液相色譜柱的性能主要取決于填料的性質(zhì)和類型。填料的大小、形狀、鍵合相、含碳量等均能影響液相色譜柱的性能，這對我們使用及選擇色譜柱都是非常有幫助的。今天我們一起看看填料是如何影響HILIC色譜柱的性能的呢？
水色譜HILIC(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography) 是一種用來改善在反相色譜中保留較差的強極性物質(zhì)保留行為的色譜技術(shù)。它通過采用強極性固定性，并且結(jié)合高比例有機相/低比例水相組成的流動相來實現(xiàn)這一目的，但本質(zhì)上是可以使用反相流動相的正相色譜。
HILIC模式色譜柱綜合了液液分配、離子交換和氫鍵作用：極性分子首先在主體流動相與色譜填料表面的半固定的高極性水膜之間發(fā)生液液分配；次級保留作用包括色譜填料表面硅醇基和/或極性官能團與帶電分析物發(fā)生的離子交換作用；氫鍵作用發(fā)生在帶正電的分析物與帶負電的表面硅醇基之間。因此， HILIC模式色譜柱適用于含如下圖所示官能團的物質(zhì)。
目前HILIC技術(shù)已經(jīng)越來越多的被用做HPLC方法開發(fā)策略的一部分， 作為傳統(tǒng)反相色譜技術(shù)的補充，不僅可以保留高極性化合物，還能夠提供巨大的選擇性差異，獲得與反相分離時完全相反的洗脫順序。因此，HILIC模式色譜柱廣泛應(yīng)用在有機酸 、多巴胺、組胺、嘧啶及水溶性維生素等極性物質(zhì)的分離中。液相液相色譜柱的性能主要取決于填料的性質(zhì)和類型。填料的大小、形狀、鍵合相、含碳量等均能影響液相色譜柱的性能，這對我們使用及選擇色譜柱都是非常有幫助的。
色譜柱填料類型
常見的液相色譜柱填料有 C1、C3、C4、C8、C18、C30、氨基、氰基、硅膠色譜柱等。常見色譜柱中的填料分類：
1、反相（與離子對）方法
C18（十八烷基或ODS）：普適性好；保留性強，用途廣
C8（辛基）：與C18相似，但保留值稍小
C3，C4：保留值??；大多用于肽類與蛋白質(zhì)
C1【三甲基硅烷（TMS）】：保留值最小；最不穩(wěn)定
苯基，苯乙基：保留值適中；選擇性有所不同
CN（氰基）：保留值適中；正相和反相均可使用
NH2（氨基）：保留性弱；用于烴類；欠穩(wěn)定
聚苯乙烯基b：在1＜PH＜13的流動相中穩(wěn)定；對某些分 離峰形好，柱子壽命長
2、正相方法
CN（氰基）：普適性好；極性適中；用途廣
OH（二醇基）：極性大于CN
NH2（氨基）：極性大，欠穩(wěn)定
硅膠b：普適性好；價廉；操作欠方便；用于制備LC
3、空間排阻方法
硅膠b：普適性極好；作吸附劑用
硅烷化硅膠：吸附性弱，溶劑兼容性好；適用于有機溶劑
OH（二醇基）：欠穩(wěn)定；在水SEC中使用（凝膠過濾）
聚苯乙烯基b：廣泛用于有機SEC（凝膠滲透）；一般與水和極性大的有機溶劑不相容
4、離子交換方法
鍵合相：穩(wěn)定性與重現(xiàn)性均不好
聚苯乙烯基b：柱效不高；穩(wěn)定；重現(xiàn)性好
填料對液相色譜柱性能的影響
1、粒徑的影響
液相色譜柱填料的平均粒徑越小，渦流擴散越小，傳質(zhì)越好，柱效越高，然而，填料粒徑小，導(dǎo)致滲透性能變差，柱壓較高。同時，填料粒徑分布越寬，滲透性能越差，色譜柱柱效越低。常見的填料粒徑有 3μm、3.5μm、5μm、10μm 等。
2、形狀的影響
液相色譜柱的填料分為無定型和球型。無定型填料制備的液相色譜柱柱床結(jié)構(gòu)不均勻，流動相線性速度不均勻，色譜圖的峰形較寬；球型填料制備的液相色譜柱柱床結(jié)構(gòu)均勻，因此色譜柱柱效高、重現(xiàn)性好。球型填料是目前最為常見的液相色譜柱填料，這種填料具有更好的性能和重現(xiàn)性。
3、鍵合相的影響
以硅膠為基質(zhì)，通過化學(xué)鍵合的方式把 C18、C8、氨基、氰基等基團鍵合在基質(zhì)上， 作為液相色譜柱中的填料。通過鍵合不同的化學(xué)基團，得到不同性能的液相色譜柱。由于不同鍵合基團的分離機理不同，從而影響化合物的保留與分離。
填料的鍵合使得液相色譜柱的固定相相對較為穩(wěn)定，不易流失，同時很大程度上消除了硅羥基的不良影響，可適用于多種流動相中，應(yīng)用廣泛。然而，鍵合后的填料耐酸性較差，pH 值不能小于 2，當(dāng)流動相 pH 超出酸性范圍時，鍵合相易流失，耐用性和穩(wěn)定性會變差。
4、端基封口的影響
硅膠因具有特殊的表面化學(xué)特性，被廣泛用作液相色譜柱填料基質(zhì)材料。硅膠表面具有硅羥基，硅羥基的密度、分布、及其化學(xué)特性對各種類型的色譜行為都會產(chǎn)生不同程度的影響。
在使用以硅膠為基質(zhì)的高效液相色譜柱特別是在反相色譜柱時，經(jīng)常會遇到因游離的硅羥基（或稱為硅醇基）而導(dǎo)致的非特異性吸附。對一些極性較強的溶質(zhì)，如堿性物質(zhì)， 色譜峰會嚴重拖尾，甚至?xí)驈娢蕉荒芟疵?。通常采用封尾的方式減少硅羥基的影響， 具體做法是將填料與小硅烷（如三甲基氯硅烷）進行后續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)掉部分殘余硅羥基， 以增加表面覆蓋率。采用該方式不僅可以減少不可逆吸附或拖尾，還能增加碳含量。但是， 該方式并不能完全反應(yīng)掉殘余的硅羥基，仍有 50%的硅羥基未被反應(yīng)。
5、含碳量的影響
液相色譜柱填料，特別是反相填料的含碳量，常被用于表征表面化學(xué)修飾程度。通常通過鍵合作用將碳鏈引入到填料中，填料含碳量越高，說明碳鏈密度越高，碳鏈越長，容量因子越大，疏水性越強。在反相條件中，碳鏈增長，意味著填料具有更大的比表面積， 締合作用增強，待測物質(zhì)保留增加。因此，高含碳量填料的液相色譜柱穩(wěn)定性好，重復(fù)性好，有利于保留效果差的化合物的分離，可以改善極性化合物的拖尾；低碳量填料的液相色譜柱有利于分析中性及堿性化合物，可以降低溶劑損耗。
6、其他因素的影響
除上述情況外，硅膠填料的活性、雜質(zhì)含量、pH 穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性等也會影響液相色譜柱性能。
生產(chǎn)硅膠時，處理溫度不同，硅膠活性也不同。硅膠的活性是選擇性差異的主要來源， 主要影響堿性化合物的保留行為；硅膠的雜質(zhì)含量是色譜柱質(zhì)量好壞的重要標志，重金屬含量低，硅羥基活性小，拖尾減小。
HILIC色譜柱的使用注意事項
1、HILIC色譜柱的平衡
使用50倍柱體積的50/50的乙腈/水相緩沖溶液（緩沖液的最終濃度為10mM）平衡新色譜柱。
在開始進樣前，用20倍柱體積的起始流動相平衡色譜柱。
進行梯度分析時，進樣間隔需要用10倍柱體積起始流動相平衡色譜柱，色譜柱平衡不充分將導(dǎo)致保留時間漂移。
2、HILIC流動相需要注意的問題
流動相中總是至少保持5％的極性溶劑（如5％水相緩沖液，5％甲醇或3％甲醇+2%水相緩沖液等），保證HILIC硅膠填料始終被水浸潤。
在流動相或梯度中至少保持有機溶劑（如乙腈）的比例不低于40％。
不要使用磷酸鹽緩沖溶液體系，因為磷酸鹽緩沖液在HILIC色譜模式下會析出；使用磷酸則沒有問題。
甲酸銨或乙酸銨水溶液緩沖系統(tǒng)比甲酸或乙酸的水溶液重現(xiàn)性更好。如果不能使用緩沖液而一定要使用流動相添加劑如甲酸，最好使用0.2%的濃度而非0.1%。
為得到最好的峰形，在流動相或梯度中總是保持緩沖系統(tǒng)的濃度為10mM。
3、HILIC稀釋劑需要注意的問題
如果可能，盡量用100％乙腈溶解樣品進樣。避免使用水配制樣品溶液，請選擇較弱的HILIC溶劑，如乙腈、甲醇、異丙醇等配制樣品溶液。
最常用的稀釋劑為75/25乙腈/甲醇，這個體系充分平衡了樣品的溶解度和峰形兩個因素。
不要用水或DMSO做稀釋劑，它們將導(dǎo)致峰形變得很差。
使用反相SPE技術(shù)將水或DMSO置換成乙腈再進樣。如果不能這樣操作，用有機溶劑稀釋水或 DMSO。
4、其它有關(guān)使用HILIC的建議
開始時可以運行一個95％乙腈至50％乙腈的梯度，如果樣品不保留，使用95/3/2的乙腈/甲醇/水相緩沖溶液的流動相進行等度分析。
將流動相中的水換成甲醇、丙酮或異丙醇也可以增加極性化合物的保留。
請確保洗針溶劑/沖洗溶劑包含和流動相一樣的高比例有機相，否則峰形會受到影響。
5、色譜柱清洗、再生和保存
（1）清洗和再生。壓力驟然升高，保留時間或分離度發(fā)生波動往往表明色譜柱被污染了。可根據(jù)如下操作清洗色譜柱。
用50/50的乙腈/水清洗以去除極性污染物。如果清洗無效，可用5:95的乙腈/水清洗色譜柱。
如果系統(tǒng)壓力上升至超過設(shè)定的壓力限或者突然出現(xiàn)色譜峰分叉，通常是需要更換保護柱的信號。
（2）色譜柱的保存。如果較長時間內(nèi)不使用色譜柱，請將柱子保存在95％乙腈中；不要將色譜柱保存在緩沖鹽流動相中，如果流動相中含有緩沖鹽，先用10倍柱體積的HPLC級水清洗色譜柱然后換上95％乙腈保存。如果中間不用水“過渡”清洗有可能在使用95％乙腈時造成鹽析出。
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