LCMS-8050為例
三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀是通過(guò)液相的分離技術(shù)使化合物進(jìn)行分離、質(zhì)譜的離子化技術(shù)將待測(cè)物質(zhì)成分轉(zhuǎn)化為離子(正離子和負(fù)離子)，在四極桿部分對(duì)不同質(zhì)荷比(m/z)的離子進(jìn)行區(qū)分，將樣品離子信號(hào)轉(zhuǎn)換成電子脈沖計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)的大小與分析樣品中離子的濃度成正比，通過(guò)與已知的標(biāo)樣或參考物質(zhì)比較最終實(shí)現(xiàn)未知樣品的定量分析。
一個(gè)優(yōu)秀的液相質(zhì)譜定量方法，不僅應(yīng)該考慮液相系統(tǒng)分離度，也應(yīng)兼顧質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)靈敏度。本文以島津LCMS-8050儀器為例，探討定量方法的建立與優(yōu)化。
一、 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、接通電源，啟動(dòng)工作站
雙擊電腦桌面上的“LabSolutions”圖標(biāo)，等待，直到出現(xiàn)下面的界面：
輸入用戶ID和密碼，點(diǎn)擊“確定”，進(jìn)入主項(xiàng)目。進(jìn)入主項(xiàng)目后，首先在新出現(xiàn)的窗口中點(diǎn)擊左側(cè)的“儀器”，再雙擊右側(cè)的對(duì)應(yīng)的儀器型號(hào)圖標(biāo)，進(jìn)入分析界面。
2、維護(hù)進(jìn)樣器與溶劑管理器
（1）自動(dòng)進(jìn)樣器清洗
點(diǎn)擊分析界面上方工具欄圖標(biāo)中的“自動(dòng)進(jìn)樣器清洗”，執(zhí)行自動(dòng)進(jìn)樣器清洗。反相色譜清洗液為甲醇水溶液(50:50，V:V)；正相色譜清洗液使用與流動(dòng)相一致的溶劑；離子交換色譜清洗液為純水。
（2）排氣
對(duì)泵和自動(dòng)進(jìn)樣器兩部分進(jìn)行排氣。排氣的方式又分為手動(dòng)排氣和自動(dòng)排氣，實(shí)際操作時(shí)，只需執(zhí)行其中一種排氣方式。將配制好的流動(dòng)相放在流動(dòng)相托盤上，確保輸液泵的吸濾頭浸沒在對(duì)應(yīng)的流動(dòng)相液面以下。
手動(dòng)排氣（面板控制）：旋開液相色譜輸液泵的排氣閥旋鈕（旋開180º即可），按下對(duì)應(yīng)泵單元面板上的“purge”鍵，進(jìn)行排氣操作。排氣完成約需時(shí)3分鐘，之后請(qǐng)關(guān)閉排氣閥旋鈕。自動(dòng)進(jìn)樣器排氣只需按下左側(cè)面板上的“purge”鍵即可；耗時(shí)約25分鐘。
自動(dòng)排氣（工作站操作）：在LabSolutions工作站實(shí)時(shí)分析界面的儀器參數(shù)視圖中，選擇“自動(dòng)排氣”項(xiàng)，在下拉菜單中選擇需要排氣的流動(dòng)相，同時(shí)勾選“自動(dòng)進(jìn)樣器”。設(shè)置完成后，點(diǎn)擊“下載”。
然后點(diǎn)擊分析界面上方工具欄圖標(biāo)中的“自動(dòng)排氣”，執(zhí)行自動(dòng)排氣。
二、 連接兩通，建立MRM方法
定量工作一般采用MRM 模式，對(duì)于目標(biāo)化合物首先需要建立化合物的MRM 分析方法。
1、Q1/Q3 掃描
（1）配制一定濃度（例如1000 μg/L）的目標(biāo)化合物單標(biāo)或者混標(biāo)，通過(guò)自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，進(jìn)樣體積1 μL。Q1/Q3 同時(shí)掃描正負(fù)離子的目標(biāo)前體離子，可正負(fù)離子同時(shí)掃描。
“Start m/z（測(cè)定開始m/z）”和“End m/z（測(cè)定結(jié)束m/z）”：根據(jù)目標(biāo)化合物的分子量自行設(shè)置合適范圍。
“Acq. Time（測(cè)定時(shí)間）” “Data Acquisition（數(shù)據(jù)采集時(shí)間）”一致，均修改為0.5 min
“Pump（泵）”部分選擇“Binary gradient（二元高壓）”，“Total Flow（總流速）”0.4 mL/min，“Pump B Conc.（泵B 濃度）”有機(jī)相80%
“Column Oven（柱溫箱）”前的“√”去掉
“Autosampler（自動(dòng)進(jìn)樣器）”將Rinse Type（清洗類型）改為“External Only（清洗針外壁）”
以上條件設(shè)置完成，保存方法，單擊快捷鍵“
”，然后按“Download”鍵。
單針/批處理進(jìn)樣分析。
（2）數(shù)據(jù)結(jié)果查看
打開Postrun（再解析）窗口，打開數(shù)據(jù)文件，使用“Average Spectrum（譜圖平均）”工具，查看某段時(shí)間內(nèi)的平均質(zhì)譜圖，找到目標(biāo)化合物的[M+H]+或者[M-H]-及加合離子信息，根據(jù)分析結(jié)果選擇合適的前體離子。
2、利用產(chǎn)物離子自動(dòng)搜索的方式優(yōu)化
（1）單擊“Optimization for Method（優(yōu)化方法）”，彈出的對(duì)話框中選擇“Optimize MRM event from product ion（利用產(chǎn)物離子搜索進(jìn)行優(yōu)化）”作為優(yōu)化方式。在彈出的對(duì)話框中，依次輸入“Compound Name（化合物名稱）”、“Precursor m/z（前體m/z）”、“Start(min)（開始（min））”0min、“End(min)（結(jié)束（min））” 0.5 min、“Vial（樣品瓶）”、“Tray（樣品瓶架）”、“Inj Vol.（進(jìn)樣體積）” 1.0 μL等信息。鼠標(biāo)左鍵點(diǎn)擊“Start（開始）”，開始MRM 優(yōu)化過(guò)程。
（2）利用產(chǎn)物離子搜索完成一個(gè)化合物的MRM 優(yōu)化需要4步，通常2分鐘內(nèi)可以完成一個(gè)化合物的優(yōu)化，若時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，建議Stop 整個(gè)優(yōu)化過(guò)程，檢查End (min)是否修改為0.5 min（默認(rèn)為10 min）。
三、 連接色譜柱，建立液質(zhì)方法
1、加載MRM方法
將“二”優(yōu)化好的MRM 參數(shù)加載到新建方法中。找到MRM 方法文件所在的文件夾，選中所有需要的MRM 方法文件。修改“Acq. Time（測(cè)定時(shí)間）”為分析一個(gè)樣品所需的時(shí)間，例如0-10 min。
2、建立色譜分離條件
常用的有機(jī)相包括甲醇和乙腈，甲醇作為質(zhì)子化溶劑（氫鍵供給者）洗脫能力較弱、粘度較、高，乙腈反之。醋酸/乙酸銨、甲酸/甲酸銨、氨水為常見的流動(dòng)相PH調(diào)節(jié)劑。在初步確定的液相方法適宜pH值與溶劑條件后，我們將篩選不同色譜柱的分離效果、優(yōu)化流動(dòng)相梯度、調(diào)節(jié)柱溫箱溫度等。
（1）液相梯度條件設(shè)置
液相色譜的初始條件在Pump（泵）選項(xiàng)卡中依次設(shè)置：二元高壓系統(tǒng)選擇“Binary gradient（二元高壓梯度）”，設(shè)置“Total Flow（總流速）”、初始濃度“Pump B Conc.（泵B 濃度）” 如果采用線性梯度則默認(rèn)0、最高壓力限“Maximum”設(shè)置為100。Pump（泵）選項(xiàng)卡設(shè)置后，在梯度表格中設(shè)置時(shí)間程序。
（2）柱溫設(shè)置
選中“Column Oven（柱溫箱）”復(fù)選框，在“Oven Temperature（柱溫箱溫度）”中，設(shè)置柱溫。CTO-20A/20AC、CTO-30AS柱溫箱最高溫度90℃，CTO-30A柱溫箱最高溫度160℃，也可設(shè)置為色譜柱的最高使用溫度進(jìn)而保護(hù)色譜柱。
（3）保存方法
整體方法編輯完成后，保存方法，同時(shí)下載方法，平衡儀器。
四、確定色譜柱，優(yōu)化液質(zhì)方法
LC-MS方法開發(fā)時(shí)，除考慮液相分離度，也要盡可能提高質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度。如圖，酸性流動(dòng)相（甲酸水）能增加質(zhì)譜正離子模式的靈敏度、降低負(fù)離子模式的靈敏度，堿性流動(dòng)相（乙酸銨）反之。
1、優(yōu)化脫劑管溫度
可調(diào)節(jié)脫溶管溫度影響目標(biāo)化合物電離，操作者可對(duì)比200、250、300 deg.C的靈敏度，得到最佳脫溶管溫度參數(shù)（如圖最佳溫度為300）：
2、優(yōu)化Interface（接口）參數(shù)設(shè)置
可設(shè)置多通道檢測(cè)，分別篩選0.25、0.5、1.0、2.0 kV接口電壓的靈敏度。
3、調(diào)整噴霧針位置
噴霧針距離離子源越遠(yuǎn)，響應(yīng)靈敏度降低。在實(shí)驗(yàn)中一般默認(rèn)其x軸位置為+1（即伸出1mm），但是否為目標(biāo)化合物最佳噴霧針位置，需要手動(dòng)調(diào)整加以驗(yàn)證。這里需要注意的是，除噴霧針的位置外，其他參數(shù)均可以通過(guò)軟件反控，因此可以使用批處理的方法進(jìn)行優(yōu)化。
液相質(zhì)譜定量方法的開發(fā)，實(shí)質(zhì)就是在保持各組分色譜峰良好分離度的前提下，兼顧各目標(biāo)化合物的高響應(yīng)靈敏度。流動(dòng)相溶劑、流動(dòng)相pH、色譜柱是影響液相分離效果的主要因素，MRM電壓、脫溶劑參數(shù)、噴針位置是影響質(zhì)譜靈敏度的主要因素，當(dāng)分離度和靈敏度沖突時(shí)我們要優(yōu)先滿足分離度。
簡(jiǎn)而言之，液相質(zhì)譜定量方法的建立與優(yōu)化一般包括以下四步：一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備，保證系統(tǒng)正常運(yùn)行；二、連接兩通，優(yōu)化MRM電壓，建立MRM方法；三、篩選色譜柱，建立良好液相分離方法；四、在兼顧液相分離度同時(shí)，優(yōu)化質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度。希望今天的分享能夠?qū)Υ蠹矣兴鶐椭诖狞c(diǎn)贊評(píng)論。
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