親水作用（Hilic）色譜，有時被稱為“含水正相色譜”，有時又被稱為“反反相色譜”，簡單來說，是極性的固定相和極性的流動相組成，參考表1，在固定相方面，看似和正相色譜一樣，那么，同一款色譜柱是否既可以用于正相色譜，又可以用于Hilic色譜？在流動相方面，和反相色譜接近，那兩種模式保留行為和流動相對保留的影響規(guī)律有什么差異？你對Hilic色譜是否也疑惑重重？接下來讓我們一起揭開親水作用 （Hilic）色譜的神秘面紗吧。
表1 反相、正相、Hilic色譜對比
一、Hilic簡介
1.1流動相
在大多數(shù)的Hilic分離中，采用的流動相為含有少量水/緩沖液與有機相混合（典型的是乙腈），水的比例為3%-40%之間。
水的比例不低于3%是由于Hilic色譜的保留機理決定的，普遍認為Hilic色譜流動相中的水會被吸附到極性固定相的表面形成水膜，然后分析物在水膜和流動相之間進行液液分配作用，加上極性官能團和固定相之間的氫鍵作用力，離子官能團之間的靜電作用力等，實現(xiàn)被分析物的保留。水膜的作用非常重要，所以Hilic流動相中至少含有3%的水。當水的比例大于40%時，保留一般很弱（k≈0）。
1.2固定相
應用于Hilic色譜的固定相有：純硅膠柱、氨基柱、二醇基柱、酰胺基柱等。純硅膠柱有固定相不易流失的優(yōu)點，在使用CAD、ELSD和LC-MS檢測器時，最受歡迎；氨基柱，在Hilic色譜中的應用，特別適合碳水化合物（糖類）分離；二醇基柱，親水性很好，可以提供不同的選擇性。
二、Hilic和正相色譜相比
2.1固定相的區(qū)別
同樣是Silica，NH2，Diol柱，與用于正相色譜中的色譜柱不同，專為Hilic色譜設計的色譜柱，可以用于水/有機物的流動相中，換句話說，Hilic色譜對固定相的耐水性要求更高，否則會因固定相的水解，出現(xiàn)基線噪音大、色譜柱壽命短等問題。所以用于正相色譜中的色譜柱，不一定能用于Hilic色譜。而適用于Hilic色譜的色譜柱，可以用于正相色譜中。
典型案例：
Athena NH2-RP用于糖類分析，CAD檢測時，能改善基線噪音。而國產(chǎn)A/C品牌、進口B品牌氨基柱由于鍵合相水解，基線噪音大大增加。
圖1 幾款氨基柱流失性對比
采用電噴霧檢測器（CAD），考察了國產(chǎn)A/C品牌、進口B品牌氨基柱和安譜的CNW Athena NH2-RP在乙腈：水（70：30）的條件下的穩(wěn)定性，結果表明，Athena NH2-RP的流失性更低，穩(wěn)定性更好，是糖類分析的理想之選。
圖2 Athena NH2-RP乳糖分析穩(wěn)定性測試
Athena NH2-RP 4.6 × 250mm，5μm （LAEQ-462568）測試乳糖，連續(xù)進混合標準品，500針后，蔗糖和乳糖的拖尾因子和保留時間穩(wěn)定，蔗糖的柱效基本保持不變，乳糖的柱效降低6%，Athena NH2-RP色譜柱在含水流動相中分析糖類物質(zhì)具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。
2.2應用范圍的差異
正相色譜主要用于極性大的脂溶性化合物（圖3），而Hilic色譜主要用于極性大的水溶性化合物（參考圖2 Athena NH2-RP用于乳糖分析）。
圖3 Athena silica硝基苯胺異構體分析
2.3總結
和正相色譜相比，用于Hilic色譜中的Silica/NH2/Diol等色譜柱耐水性更好，Athena NH2-RP在Hilic色譜糖類分析中表現(xiàn)優(yōu)異。
對于極性強的化合物，如果在正己烷、異丙醇中溶解度較好，推薦用正相色譜，如果在水中溶解度較好，推薦用Hilic色譜。
三、Hilic和反相色譜相比
3.1
極性較強的尿素，在Athena C18-WP (LAEQ-462572)沒有保留，而在Athena NH2-RP (LAEQ-462568)可以很好的保留。和反相色譜相比，Hilic色譜對極性大的水溶性化合物保留能力更強。
3.2流動相中水的洗脫強度
以Athena NH2-RP 4.6 × 250mm，5μm （LAEQ-462568）對糖類物質(zhì)的分析為例。
乙腈/水（75：25）
1.果糖 2.葡萄糖 3.蔗糖 4.麥芽糖
應用：蜂蜜 中國藥典2020年版一部P374
乙腈/水（70：30）
1.蔗糖 2.乳糖
應用：乳糖 中國藥典2020年版四部 P690
對比蜂蜜和乳糖應用，采用同一支Athena NH2-RP 4.6 × 250mm，5μm （LAEQ-462568）色譜柱，流動相從乙腈/水（75：25）變?yōu)橐译?水（70：30）后，蔗糖的出峰時間從14.008min縮短至8.840min，流動相中水相比例增加，目標化合物出峰變早。我們知道，反相色譜中，流動相中水相比例增加，目標化合物的出峰會變晚。在Hilic色譜中，流動相中的水相部分表現(xiàn)為強溶劑，這和傳統(tǒng)的反相色譜完全相反。
3.3總結
對于極性大的親水性化合物，在反相色譜中很難保留，可以用Hilic色譜增加保留。
在反相色譜中，流動相中的水相部分表現(xiàn)為弱溶劑，而在Hilic色譜中，水表現(xiàn)為強溶劑。
四、Hilic色譜總結
Hilic色譜作為正相和反相色譜的補充，采用極性的固定相和流動相，在分析極性強的水溶性化合物中有很大優(yōu)勢。
通常情況，流動相中水相比例為3%-40%，水相比例太高，一方面目標化合物保留太弱，另一方面加快鍵合相的水解。
固定相的耐水解性要求更高，如Athena NH2-RP在Hilic色譜中特別適合糖類物質(zhì)的分析，基線噪音小，色譜柱壽命長。
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