人眼的分辨率十分有限，需要通過顯微鏡對細胞等微觀結(jié)構(gòu)觀察。但是使用光學(xué)顯微鏡無法對細胞的胞內(nèi)亞結(jié)構(gòu)進行細致的觀察，需要應(yīng)用電子顯微鏡等更為昂貴的設(shè)備進行觀察，這無疑成為了很多經(jīng)費不足的研究機構(gòu)的推進研究的阻礙。然而，膨脹顯微鏡（ExM）技術(shù)的發(fā)明打破了這一局面。膨脹顯微鏡技術(shù)是一種基于可膨脹的聚電解質(zhì)水凝膠原位聚合使固定生物標本各向同性擴大的技術(shù)。根據(jù)該方法和水凝膠化學(xué)方法的不同膨脹顯微鏡可以提供4-20倍的線性放大，從而可以使用傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡對細胞特征進行超分辨率成像。除了細胞成像之外，膨脹顯微鏡技術(shù)還可以清除樣本，這有利于更復(fù)雜的三維（3D）組織樣本的成像?，F(xiàn)階段膨脹顯微鏡技術(shù)已用于組織學(xué)切片的病理篩選、單細胞/分子精度觀察3D組織樣本和亞細胞RNA定位和測定。
迄今為止，膨脹顯微鏡技術(shù)中使用的水凝膠主要是通過使用氧化還原引發(fā)劑實現(xiàn)對丙烯酸酯/丙烯酰胺基單體進行鏈聚合而合成。但是，這種策略往往會導(dǎo)致很長的樣品制備時間，并需要一個惰性氣氛來緩解氧對引發(fā)活性中心的抑制，特別是對于比較薄樣品。并且，反應(yīng)是自發(fā)地進行，因此需要通過仔細的實驗設(shè)計實現(xiàn)對凝膠化時間的控制，以避免在滲透過程中過早的凝膠化。此外，雖然鏈生長聚合在任何組織細胞中是一樣的，但納米尺度的不均一性會發(fā)生，并可能在膨脹時增加熒光團位置的空間誤差。與階梯式生長網(wǎng)絡(luò)相比，鏈式聚合水凝膠也具有較差的力學(xué)性能，這可能會使膨脹后的樣品處理復(fù)雜化。因此，需要對膨脹顯微鏡技術(shù)中所采用的凝膠進行改進以克服上述缺陷。
近期，科羅拉多大學(xué)博爾德分校的Kristi S. Anseth團隊為膨脹顯微技術(shù)設(shè)計了一種專用水凝膠（PhotoExM），以減少處理時間，并實現(xiàn)樣品的均勻膨脹。該水凝膠是基于光引發(fā)聚合技術(shù)，即快速的光引發(fā)硫醇/丙烯酸酯混合模式聚合，這種聚合不受氧氣的抑制，并單體向生物樣品的擴散（即傳質(zhì)）與水凝膠形成的反應(yīng)動力學(xué)解耦，這在膨脹前將細胞嵌入水凝膠中尤其有利。基于該方法，可以實現(xiàn)水凝膠中嵌入的單個細胞的納米級特征成像，以及實現(xiàn)與細胞外微環(huán)境中新生沉積的細胞外基質(zhì)（ECM）分子的相互作用的觀察。該工作以題為“Photo-expansion microscopy enables super-resolution imaging of cells embedded in 3D hydrogels”的文章發(fā)表于Nature Materials上。
PhotoExM水凝膠的設(shè)計
PhotoExM水凝膠是通過光引發(fā)的硫醇/丙烯酸酯混合模式聚合制備。該混合模式反應(yīng)中的網(wǎng)絡(luò)生長通過丙烯酰胺、丙烯酸鈉（16wt%）和聚乙二醇（PEG）-二丙烯酰胺交聯(lián)劑（PEGdiAcM；Mn = 600 g mol-1）的同時鏈式生長共聚進行，再加上多臂PEG-SH和傳播的鏈式生長自由基之間的鏈式傳遞反應(yīng)實現(xiàn)階梯式生長聚合。與純粹的鏈式增長網(wǎng)絡(luò)相比，PhotoExM水凝膠配方的混合模式反應(yīng)機制使網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)點的空間位置均勻化，這可以減少擴展后熒光團位置的空間誤差。PhotoExM凝膠具有更高的彈性模量，因此與原始的ExM化學(xué)相比，在處理過程中具有更大的抗變形能力。更值得注意的是，將8臂PEG-SH加入到網(wǎng)絡(luò)中所帶來的階梯式增長特性減少了水凝膠形成所需的交聯(lián)劑（PEGdiAcM）含量，其膨脹率可以通過修改PEGdiAcM的重量百分比輕松調(diào)節(jié)。
PhotoExM方法的驗證和解析
為了量化PhotoExM水凝膠的保真度和均勻性，肌細胞（C2C12細胞）被培養(yǎng)在蓋玻片上并固定并免疫標記α-管蛋白作為觀察樣品。在大約×4.6的樣本擴展之后，對相同的區(qū)域進行成像。通過計算樣品特征的均方根（r.m.s.），將誤差作為平均測量長度的函數(shù)。在20微米以上，平均r.m.s.誤差為2.8%，這與先前的ExM方法相當(dāng)，但PhotoExM具有更快的聚合動力學(xué)（PhotoExM的70秒與ExM的90分鐘）。接下來通過量化4.6-6.7倍擴增前后的微管全寬（FWHM）來評估PhotoExM實現(xiàn)的分辨率提升。擴增前測量的微管直徑為331±32納米，4.6倍擴增后下降到90±8納米，6.7倍擴增后為69±7納米。后者與用一抗和二抗免疫標記的微管的測量直徑（d）相當(dāng)（d≈60-65納米），證明了PhotoExM的超分辨率成像能力。接下來，用PhotoExM來觀察肌肉組織切片。從6個月大的雄性小鼠身上分離出粗大的脛骨前肌縱向切片，固定后用α-肌動蛋白免疫標記，以觀察肌纖維中的肉眼可見度。在不同的肌肉切片中，在×4.6擴展之前和之后對肌節(jié)進行成像，可以對組織樣本內(nèi)的擴展各向同性進行量化。在×4.6擴增前后，肉眼可觀察到的平均距離分別為1.43±0.19和6.35±0.81μm（非標單位）。平均肌節(jié)長度之間的比率為4.44，對應(yīng)的誤差為3.0%，這在PhotoExM過程的3.5%誤差范圍內(nèi)（×4.6擴展）。此外，PhotoExM還可以被用來揭示分離的肌纖維上的肌肉干細胞（Pax7）和肌纖維-ECM界面（dystrophin）的亞細胞結(jié)構(gòu)，以及肌肉干細胞周圍的ECM（層粘連蛋白）。
合成水凝膠可以被廣泛地用作體內(nèi)輸送系統(tǒng)，以促進組織再生，并作為三維模型在體外研究疾病和發(fā)展。雖然三維微環(huán)境可以更好地再現(xiàn)細胞在體內(nèi)的生態(tài)位，但對細胞進行高分辨率的分析和成像卻更具挑戰(zhàn)性。這些問題的出現(xiàn)不僅是因為超分辨率顯微鏡的穿透深度有限，而且還因為充滿細胞的基質(zhì)的光吸收和散射。為了解決其中的一些挑戰(zhàn)，通過 PhotoExM技術(shù)中的消化步驟，使生物樣本與略微不透明的細胞水凝膠基質(zhì)平行降解，形成光學(xué)上透明的凝膠，隨后在成像前進行擴展（GtG策略）。該策略依賴于將PhotoExM成分擴散到三維水凝膠中的能力與凝膠的按需光聚合解耦，從而暫時產(chǎn)生一個相互滲透的網(wǎng)絡(luò)。使用這種基于PhotoExM的GtG方法，首次可視化了人類間充質(zhì)干細胞（hMSCs）及其與新生沉積的ECM分子的相互作用。
小結(jié)：該文提供了一種用于膨脹顯微鏡技術(shù)的光聚合凝膠策略（PhotoExM），這種新型PhotoExM提供了一種簡單而強大的補充方法，可以解決單體擴散、氧抑制和水凝膠膨脹后的脆弱性的問題，并能實現(xiàn)配方的預(yù)混合，有利于樣品的制備。PhotoExM提供了一種精確監(jiān)測三維微環(huán)境中核形狀和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法，克服了迄今為止的研究受到分辨率的限制。更值得注意的是，由于ExM與RNA成像兼容，PhotoExM在未來有潛力實現(xiàn)準確描述三維微環(huán)境中轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的亞細胞和細胞異質(zhì)性，推動該領(lǐng)域的發(fā)展。
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