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如何開(kāi)發(fā)出同時(shí)滿足多國(guó)申報(bào)的藥品無(wú)菌檢測(cè)法

嘉峪檢測(cè)網(wǎng)        2023-06-01 10:52

前言
 
無(wú)菌檢查法（Sterility tests），顧名思義就是檢查是否無(wú)菌，至于檢查什么，凡是藥典要求無(wú)菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料等均需要經(jīng)過(guò)此項(xiàng)檢查，因此它也成為制藥行業(yè)繞不過(guò)去的一個(gè)話題。
雖然中國(guó)藥典、美國(guó)藥典等，都對(duì)無(wú)菌檢查法進(jìn)行了明確的規(guī)定，但不同國(guó)家中具體實(shí)施卻不盡相同，因此對(duì)于那些中美雙報(bào)或者多個(gè)國(guó)家申報(bào)的公司，明確各國(guó)藥典中差異尤為重要。大家更為關(guān)注的一個(gè)問(wèn)題是，能不能開(kāi)發(fā)出同時(shí)滿足多國(guó)申報(bào)的無(wú)菌檢測(cè)法，或者該怎樣設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚋咝詢r(jià)比地滿足多國(guó)申報(bào)的要求？下文就此問(wèn)題，談?wù)剛€(gè)人見(jiàn)解。
 
一、 認(rèn)識(shí)無(wú)菌檢查法
 
除去培養(yǎng)基制備、儲(chǔ)存和稀釋液、沖洗液配制等準(zhǔn)備工作，無(wú)菌檢查法實(shí)際包含3個(gè)部分的實(shí)驗(yàn)，分別為：培養(yǎng)基適用性檢查、方法適用性試驗(yàn)和供試品的無(wú)菌檢查。
培養(yǎng)基適用性檢查：主要目的有兩個(gè)，一是確認(rèn)使用的培養(yǎng)基本身是無(wú)菌的，即無(wú)菌性檢查，通過(guò)在適宜溫度下放置培養(yǎng)基觀察判定；二是確認(rèn)使用的培養(yǎng)基細(xì)菌或真菌是可以舒舒服服生長(zhǎng)并且在規(guī)定時(shí)間內(nèi)可以被觀察到，即靈敏性檢查，通過(guò)接種特定菌種，觀察菌生長(zhǎng)狀態(tài)判斷。進(jìn)行了以上實(shí)驗(yàn)，就可以判斷檢測(cè)不到細(xì)菌真菌，不是培養(yǎng)基自身造成的。
方法適用性試驗(yàn)：主要目的是判斷采用的方法，薄膜過(guò)濾法或者直接接種法，是否適用于你要檢測(cè)的這種產(chǎn)品。尤其是一些產(chǎn)品，本身就含有抑菌成分，這種情況下難道在整個(gè)檢驗(yàn)期內(nèi)結(jié)果呈現(xiàn)陰性，就是真的無(wú)菌了嗎？答案是不一定的，因此我們需要排除檢驗(yàn)過(guò)程中操作或者產(chǎn)品本身的抑菌性。當(dāng)一個(gè)新產(chǎn)品進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)或者實(shí)驗(yàn)條件改變時(shí)，需要進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，可與供試品無(wú)菌檢查同步進(jìn)行。
供試品的無(wú)菌檢查：這就是實(shí)打?qū)嵉膶?duì)于產(chǎn)品的無(wú)菌檢測(cè)，從檢測(cè)數(shù)量、檢驗(yàn)量、陰/陽(yáng)性對(duì)照、接種要求、培養(yǎng)觀察和結(jié)果判讀全都進(jìn)行了細(xì)致規(guī)定。談?wù)剻z測(cè)數(shù)量和檢驗(yàn)量，檢測(cè)數(shù)量是一批次一定數(shù)量的產(chǎn)品中需要抽檢的數(shù)量，檢驗(yàn)量是每瓶/支中要取多少體積的供試品用于檢測(cè)。對(duì)于檢測(cè)數(shù)量和檢測(cè)量的規(guī)定更好更全面地評(píng)估了整批樣品的無(wú)菌性。
 
▲ 表1-無(wú)菌檢查法藥典包含項(xiàng)目或規(guī)定
項(xiàng)目 步驟 CHP2020 USP2021
檢測(cè)環(huán)境 無(wú)菌 √ √
稀釋液/沖洗液制備 配方 √ √
滅菌 √ √
培養(yǎng)基制備 配方/商用培養(yǎng)基 √ √
滅菌 √ ×
保存 √ √
品類 √ √
培養(yǎng)基適用性 無(wú)菌檢查 √ √
靈敏度檢查/促生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn) 菌種 √ √
菌液制備 √ ×
接種 √ √
結(jié)果判定 √ √
方法適用性 菌液制備 √ ×
接種 薄膜過(guò)濾 √ √
直接接種 √ √
結(jié)果判定 √ √
供試品無(wú)菌檢查 檢驗(yàn)數(shù)量 √ √
檢驗(yàn)量 √ √
陰性對(duì)照 √ √
陽(yáng)性對(duì)照 √ ×
接種 薄膜過(guò)濾 √ √
直接接種 √ √
培養(yǎng)觀察 √ √
結(jié)果判定 √ √
 
二、 各國(guó)藥典中無(wú)菌檢查法章節(jié)
 
▲ 表2-無(wú)菌檢查法各國(guó)藥典章節(jié)
國(guó)家 藥典章節(jié) 標(biāo)題
中國(guó) Ch.P.<1101> 無(wú)菌檢查法
美國(guó) USP<71> Sterility test
歐洲 EP 2.6.1 Sterility
日本 JP 4.06 Sterility Test
英國(guó) BP APPENDIX XVI Test for Sterility

 

三、 各國(guó)藥典比較分析

 

關(guān)于無(wú)菌檢查法，美國(guó)、日本、歐洲藥典等基本實(shí)現(xiàn)藥典協(xié)調(diào)，因此本文著重以中美之間的差異為切入點(diǎn)進(jìn)行分析：
 
1、菌種差異
 
用于無(wú)菌檢測(cè)的“官方菌”，雖然各國(guó)采用的種類大致相同，但菌種往往帶有獨(dú)特的ID編號(hào)。拿中國(guó)來(lái)說(shuō)，“中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心（CMCC）”為主流機(jī)構(gòu)，而歐美國(guó)家則普遍認(rèn)可“美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心（ATCC）”、“法國(guó)巴斯德研究所菌種保藏中心（CIP）”、“英國(guó)菌種保藏中心（NCTC）”、“日本菌種保藏中心（NBRC）”和“英國(guó)食品工業(yè)與海洋細(xì)菌菌種保藏中心（NCIMB）”，下列出不同藥典要求的菌株編號(hào)：
 
▲ 表3-無(wú)菌檢查法藥典包含項(xiàng)目或規(guī)定
名稱 CHP2020<1101> USP<71>
金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) CMCC(B) 26 003 ATCC 6538, CIP 4.83, NCTC 10788, NCIMB9518, NBRC 13276
銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10 104 ATCC 9027, NCIMB8626, CIP 82.118, NBRC 13275
枯草芽抱桿菌 CMCC(B)63 501 ATCC 6633, CIP 52.62 NCIMB 8054, NBRC3134
(Bacillus subtilis）
生孢梭菌 CMCC(B)64 941 ATCC 19404, CIP 79.3,NCTC 532 or ATCC11437, NBRC 14293
(Clostridum sporogenes)
白色念珠菌 CMCC(F) 98 001 ATCC 10231, CIP 48.72,NCPF 3179, NBRC 1594
(Candida albicans)
黑曲霉 CMCC(F) 98 003 ATCC 16404, CIP 1431.83 IMI 149007, NBRC 9455
(Aspergillus brasiliensis / Aspergillus niger)
大腸埃希菌 CMCC(B) 44 102 __
(Eschericichia coli)

對(duì)于不同來(lái)源的菌株，國(guó)家藥典委在2018年ICH Q4藥典相關(guān)檢測(cè)方法專題研討會(huì)

給出的協(xié)調(diào)建議是“基本一致，可以協(xié)調(diào)，不同來(lái)源菌株一致性需進(jìn)行驗(yàn)證”。中國(guó)藥典<9203>藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理原則中也談到“標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)來(lái)自認(rèn)可的國(guó)內(nèi)或國(guó)外菌種保藏機(jī)構(gòu)”，<1101>中卻并沒(méi)有提及可以使用等效菌株代替。而美國(guó)藥典<71>里也并未提及同<61>“equivalent strains”。
如何判斷不同的編號(hào)和機(jī)構(gòu)的同一種菌具有等效性呢？如何開(kāi)展相關(guān)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)？這一點(diǎn)其實(shí)沒(méi)有明確的定論。
 
https://www.usp.org/frequently-asked-questions/microbial-examination-nonsterile-products-microbial-enumeration-tests
 
2、稀釋液/沖洗液
 
通過(guò)對(duì)中美藥典的對(duì)比，不難發(fā)現(xiàn)中美的稀釋液和沖洗液存在差異。稀釋液或沖洗液用于薄膜過(guò)濾法，美國(guó)藥典列出了3種不同的稀釋液，分別為溶液A，溶液D，溶液K。溶液A和中國(guó)藥典的0. 1% 無(wú)菌蛋白胨水溶液配方是一致的。而溶液D為溶液A額外添加表面活性劑，實(shí)際上符合中國(guó)藥典“如有需要，可在上述溶液中添加表面活性劑或中和劑”。另外，中國(guó)藥典并沒(méi)有鎖死稀釋液/沖洗液類型，那么如果美國(guó)溶液K經(jīng)驗(yàn)證后，不對(duì)無(wú)菌檢查法造成影響，是否也能得到中國(guó)藥典的認(rèn)可？溶液K主要可用于油劑和油性溶劑的稀釋，而中國(guó)藥典中對(duì)于非水溶性供試品的規(guī)定為“ 取規(guī)定量，直接過(guò)濾；或混合溶于適量含Tween 80或其他適宜乳化劑的稀釋液中”。雖然不少文章或研究對(duì)用于非水溶性供試品檢測(cè)的稀釋液進(jìn)行改進(jìn)，如使用磷酸鹽溶液、摸索Tween 80濃度梯度等，但筆者認(rèn)為，如現(xiàn)有稀釋液可滿足方法適用性，則應(yīng)該使用藥典上明確規(guī)定的稀釋液。
 
稀釋液/沖洗液（Diluting and Rinsing Fluids）
中國(guó) 美國(guó)
0. 1% 無(wú)菌蛋白胨水溶液 取蛋白胨 1.0 g, 加水1000 mL , 微溫溶解，必要時(shí)濾過(guò)使澄清，調(diào)節(jié) pH 值至7. 1 ± 0.2, 分裝，滅菌。 溶液A (Fluid A) 將1g蛋白胨溶解于1L水中，必要時(shí)過(guò)濾或離心澄清，并調(diào)節(jié)到pH值為7.1 ± 0.2。分裝到容器中，并使用有效的方法消毒。
用于青霉素和頭孢菌素稀釋劑，可添加β-內(nèi)酰胺酶
pH7. 0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 磷酸二氫鉀3.56g, 無(wú)水磷酸氫二鈉 5. 77g, 氯化鈉4.30 g, 蛋白胨1. 00g, 加水1000mL， 微溫溶解，必要時(shí)濾過(guò)使澄清，分裝，滅菌。 —— ——
其他經(jīng)驗(yàn)證的適宜溶液 根據(jù)供試品的特性，可選用其他經(jīng)驗(yàn)證的適宜溶液作為稀釋液或沖洗液（如0.9 %無(wú)菌氯化鈉溶液）。 溶液K (Fluid K) 取蛋白胨5.0 g、3.0 g牛肉浸粉（beef extract）、10.0 g吐溫80 溶于水，定溶到1 L。調(diào)節(jié)pH值，滅菌后pH值為6.9±0.2。分裝到容器中，并使用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證工藝滅菌
用于青霉素和頭孢菌素稀釋劑，可添加β-內(nèi)酰胺酶
備注： 如需要，可在上述液體中加入表面活性劑或中和劑等 溶液D (Fluid D) 在每升溶液A中加入1 mL吐溫80，調(diào)整pH值為7.1 ± 0.2，分配到容器中，并使用有效的工藝消毒。此溶液用于含有卵磷脂或油脂的產(chǎn)品或無(wú)菌設(shè)備。
用于青霉素和頭孢菌素稀釋劑，可添加β-內(nèi)酰胺酶

3、培養(yǎng)基差異

而主要培養(yǎng)基，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨培養(yǎng)基，雖然中美藥典要求大致相似，但仍需要注意細(xì)節(jié)問(wèn)題。
 
培養(yǎng)基 Medium
中國(guó) 美國(guó)
硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 Fluid Thioglycollate Medium
胰酪胨 15.0g Pancreatic Digest of Cascin 15.0g
酵母浸出粉 5.0g Yeast Extract(water-soluble) 5.0g
葡萄糖/無(wú)水葡萄糖 5.5g/5.0g Dextrose Monohydrate/Anhydrous 5.5/5.0g
L-胱氨酸 0.5g  L-cystine 0.5g
硫乙醇酸鈉/硫乙醇酸 0.5g/0.3mL Sodium Thioglycollate or Thioglycolic Acid 0.5g/0.3mL
氯化鈉 2.5g Sodium Chloride 2.5g
新配制的刃天青水溶液(0.1%) 1.0mL Resazurin Sodium Solution (1:1000) freshly prepared 1.0mL
瓊脂 0.75g Agar 0.75g
水 1000mL Purified Water 1000mL
取除葡萄糖和刃天青溶液外的各成分混合，微溫溶解，調(diào)pH為弱堿性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調(diào)pH，使滅菌后在25℃的pH為7.1 ± 0.2。分裝至適宜容器。裝量不超過(guò)容器1/2高度，接種前，氧化物高度不超培養(yǎng)基1/3深度。 將L-胱氨酸、瓊脂、氯化鈉、葡萄糖、酵母提取物和胰酪胨與純化水混合，加熱至溶解。將硫乙醇酸鈉或硫乙醇酸溶解在溶液中，必要時(shí)加入1 N 氫氧化鈉，使滅菌后溶液的pH值為7.1±0.2。如果需要過(guò)濾，再次加熱溶液，不要煮沸，趁熱通過(guò)濕潤(rùn)的濾紙過(guò)濾。加入刃天青溶液，混合，并將培養(yǎng)基置于合適的容器中。
用于青霉素和頭孢菌素的培養(yǎng)基，可添加β-內(nèi)酰胺酶滅活抗生素。
分析：葡萄糖、刃天青溶液、硫乙醇酸鈉或硫乙醇酸添加順序不一樣。
胰酪大豆胨培養(yǎng)基 Soybean - Casein Digest Medium
胰酪胨 17.0g Pancreatic Digest of Casein 17.0g
大豆木瓜蛋白酶水解物 3.0g Papaic Digest of Soybean Meal 3.0g
葡萄糖/無(wú)水葡萄糖 2.5g/2.3g Dextrose Monohydrate/Anhydrous 2.5g/2.3g
氯化鈉 5.0 g Sodium Chloride 5.0g
磷酸氫二鉀 2.5g Dibasic Potassium Phosphate 2.5g
水 1000mL Purified Water 1000mL
取除葡萄糖外的各組分混合，微溫溶解，濾過(guò)，調(diào)節(jié)pH使滅菌后在25℃的pH值為7.3±0.2，加入葡萄糖，分裝，滅菌。 將固體溶解在純凈水中，稍微加熱形成溶液。將溶液冷卻至室溫，用1 N氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH，使滅菌后pH為7.3±0.2。過(guò)濾，如果需要澄清，分配到適當(dāng)?shù)娜萜?，并使用?yàn)證程序滅菌
用于青霉素和頭孢菌素的培養(yǎng)基，可添加 β-內(nèi)酰胺酶滅活抗生素。
分析：葡萄糖添加順序不一樣。

4、匯總對(duì)比分析

下表匯總對(duì)比了無(wú)菌檢查法在中美藥典中的差異，其中紅色標(biāo)記為需要重點(diǎn)關(guān)注的地方：
項(xiàng)目 步驟 CHP<1101> USP<71>
檢測(cè)環(huán)境 無(wú)菌 達(dá)到無(wú)菌條件 達(dá)到無(wú)菌條件
稀釋液/沖洗液制備 配方 自配，配方包含0.1% 無(wú)菌蛋白胨水溶液、pH7. 0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液和其他溶液 自配，配方包含溶液A、K、D （其中A為0. 1% 無(wú)菌蛋白胨水溶液）
滅菌 需要滅菌 需要滅菌
培養(yǎng)基制備 配方/商用培養(yǎng)基 自配/商用產(chǎn)品。配方順序略有不同 自配/商用產(chǎn)品。配方順序略有不同
滅菌 驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌 驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌
保存 2-26℃、避光、無(wú)菌密閉容器 2-26℃、無(wú)菌密閉容器
品類 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基； 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基；
胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基； 大豆酪蛋白消化物培養(yǎng)基
中和或滅活用培養(yǎng)基； 　
0.5% 葡萄糖肉湯培養(yǎng)基； 　
胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基； 　
沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基； 　
沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基； 　
馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 (PDA) 　
培養(yǎng)基適用性 無(wú)菌檢查 ≥5支瓶/批，14天無(wú)菌 取部分培養(yǎng)基，14天無(wú)菌
靈敏度檢查/促生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn) 菌種 傳代不超5次，菌種確認(rèn) 傳代不超5次，菌種確認(rèn)
金黃色葡萄球菌； 金黃色葡萄球菌；
銅綠假單胞菌； 銅綠假單胞菌；
枯草芽孢桿菌； 枯草芽孢桿菌；
生孢梭菌； 生孢梭菌；
白色念珠菌； 白色念珠菌；
黑曲霉 黑曲霉
菌種接種 ①TSB-金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌（20~25℃）； 需氧菌、厭氧菌、真菌促生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，20-25℃培養(yǎng)，TSB可代替FTM
②FTM生孢梭菌
(30~35℃,18-24h)；
③沙氏葡萄糖液體/瓊脂培養(yǎng)基-白色念珠菌（20~25℃,2-3d）
④沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基/馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基-黑曲霉（20~25℃,5-7d）
菌液制備 ①金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌用0. 1% 無(wú)菌蛋白胨水溶液或pH7. 0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋； 無(wú)規(guī)定
②黑曲霉孢子用添加一定濃度tween80的稀釋液洗脫制備；
菌液保存 室溫2h、2-8°C 24h；黑曲霉孢子2-8°C，驗(yàn)證保存時(shí)間 無(wú)規(guī)定
接種 ≤100cfu；2個(gè)重復(fù)；1個(gè)空白對(duì)照；細(xì)菌培養(yǎng)≤3d；真菌培養(yǎng)≤5d ≤100cfu；細(xì)菌培養(yǎng)≤3d；真菌培養(yǎng)≤5d；無(wú)空白對(duì)照
結(jié)果判定 空白管無(wú)菌生長(zhǎng)，加菌培養(yǎng)管生長(zhǎng)良好 培養(yǎng)基微生物生長(zhǎng)良好
方法適用性（可與供試品無(wú)菌檢查同步進(jìn)行） 菌種 金黃色葡萄球菌； 金黃色葡萄球菌；
枯草芽抱桿菌； 銅綠假單胞菌；
生孢梭菌； 枯草芽孢桿菌；
白色念珠菌； 生孢梭菌；
黑曲霉； 白色念珠菌；
大腸埃希菌 黑曲霉
菌液制備 同靈敏性檢查；大腸埃希菌制備同金黃色葡萄球菌 無(wú)規(guī)定
接種 薄膜過(guò)濾 ① 供試品最后一次薄膜過(guò)濾沖洗液添加≤100cfu試驗(yàn)菌，接種相應(yīng)培養(yǎng)基 ①最后一次薄膜過(guò)濾沖洗液添加≤100cfu測(cè)試菌株，接種相應(yīng)培養(yǎng)基
② 每種菌1個(gè)對(duì)照，加入同量試驗(yàn)菌
③ 培養(yǎng)時(shí)間≤5d
直接接種 ① 供試品接入TSB和FTM培養(yǎng)基，每種3管； ① 供試品接入TSB和FTM，可添加β-內(nèi)酰胺酶
② 接種≤100cfu到相應(yīng)培養(yǎng)基，6種菌共6管，作為對(duì)照 ② 接種≤100cfu菌株到相應(yīng)培養(yǎng)基，設(shè)置促生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性對(duì)照
③ 培養(yǎng)時(shí)間≤5d ③ 培養(yǎng)時(shí)間≤5d
結(jié)果判定 與對(duì)照管相比，供試品管生長(zhǎng)良好，則供試品無(wú)抑菌作用 與促生長(zhǎng)陽(yáng)性管相比，供試品管生長(zhǎng)良好，則供試品無(wú)抑菌作用
供試品無(wú)菌檢查 檢驗(yàn)數(shù)量 1.批出廠產(chǎn)品及生物制品原液和半成品： 1.批出廠產(chǎn)品及生物制品原液和半成品：
①注射劑少于100檢驗(yàn)10%或4個(gè)（選較多）；②數(shù)量100-500檢驗(yàn)2%或20個(gè)； ①注射劑少于100檢驗(yàn)10%或4個(gè)（選較多）；②數(shù)量100-500檢驗(yàn)10%；
③數(shù)量500檢驗(yàn)2%或20個(gè)（選較少）； ③數(shù)量500檢驗(yàn)2%或20個(gè)（選較少）；
2. 上市抽驗(yàn)樣品： 2.上市抽驗(yàn)樣品：
液體制劑檢驗(yàn)數(shù)量大于等于10個(gè) 液體制劑檢驗(yàn)數(shù)量大于等于10個(gè)
注：每瓶裝量必須滿足接種2個(gè)培養(yǎng)基，否則數(shù)量翻倍 注：每瓶裝量必須滿足接種2個(gè)培養(yǎng)基，否則數(shù)量翻倍
檢驗(yàn)量 1.生物制品原液及半成品：每只接入培養(yǎng)基最少量為半量； 1.無(wú)特定生物制品規(guī)定；
2.液體制劑根據(jù)容量選擇檢驗(yàn)量 2. 根據(jù)供試品種類和容量選擇建言量
陰性對(duì)照 相應(yīng)稀釋液 設(shè)置適當(dāng)陰性對(duì)照
陽(yáng)性對(duì)照 1. 對(duì)照菌 無(wú)需陽(yáng)性對(duì)照
①無(wú)抑菌及抗G+的供試品為金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌；
②抗G-供試品對(duì)照為大腸埃希菌；
③抗厭氧菌供試品對(duì)照為生孢梭菌
④抗真菌供試品對(duì)照 白色念珠菌
2. 接種≤100cfu，培養(yǎng)時(shí)間≤5d
接種 薄膜過(guò)濾 ①?zèng)_洗次數(shù)≥3次；每次沖洗100mL，總沖洗量一般不超過(guò)500mL,最大不超過(guò)1000mL ①?zèng)_洗次數(shù)≥3次，不超過(guò)5次；每次沖洗100mL
② 膜濾器孔徑≤0.45um
直接接種 ①生物制品   FTM:TSB=2:1 供試品接種體積不大于培養(yǎng)體積10%，無(wú)生物制品要求，無(wú)裝量要求
② 供試品接種體積不大于培養(yǎng)體積10%
③ 裝量要求FTM ≥15mL；TSB ≥10mL
培養(yǎng)觀察 ① 培養(yǎng)時(shí)間≥14d ①培養(yǎng)時(shí)間≥14d
② 接種生物制品FTM分成2等份，1份置 30-35°C 培養(yǎng)，1份置 20-25°C 培養(yǎng)； ②接種生物制品FTM（可選硫乙醇酸鹽代替培養(yǎng)基）置 30-35°C培養(yǎng)；
③ 14天培養(yǎng)基若出現(xiàn)渾濁，接種不少于1mL原始培養(yǎng)物到新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)不少于4d ③14天培養(yǎng)基若出現(xiàn)渾濁，接種不少于1mL原始培養(yǎng)物到新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)不少于4d
結(jié)果判定 陰性對(duì)照澄清，供試管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無(wú)菌生長(zhǎng)，判供試品符合規(guī)定 陰性對(duì)照澄清，供試管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無(wú)菌生長(zhǎng)，判供試品符合規(guī)定

四、 小結(jié)

本文介紹了無(wú)菌檢查法，并對(duì)比分析了該方法在各國(guó)藥典中的規(guī)定。出于一些考慮，中國(guó)藥典的無(wú)菌檢查法暫時(shí)沒(méi)有和國(guó)際統(tǒng)一，這對(duì)于藥品雙報(bào)或多報(bào)的企業(yè)來(lái)說(shuō)就有了更多的挑戰(zhàn)，按不同的藥典要求建立符合注冊(cè)國(guó)的無(wú)菌檢查法對(duì)于注冊(cè)而言可能更加穩(wěn)妥。在這里也提出一些展望，現(xiàn)行的無(wú)菌檢查法周期過(guò)長(zhǎng)，開(kāi)發(fā)出合理靠譜的無(wú)菌快速檢測(cè)技術(shù)意義非凡，期待那一天早日到來(lái)。

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來(lái)源：注冊(cè)圈

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