一般認(rèn)為藥物與血漿蛋白結(jié)合成為復(fù)合體后不能跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，藥物的分布，代謝，排泄以及與相應(yīng)受體結(jié)合繼而發(fā)生藥理效應(yīng)，都以游離形式進(jìn)行，因此可認(rèn)為游離藥物才是血液乃至靶點(diǎn)的“活性藥物”形式。這一學(xué)說(shuō)（free drug hypothesis）已得到較多的藥理實(shí)驗(yàn)和臨床結(jié)果的支持。藥物血漿蛋白結(jié)合率（Plasma Protein Binding，PPB）即血液中與蛋白結(jié)合的藥物占總藥量的百分?jǐn)?shù)，可以反映藥物與血漿蛋白結(jié)合的程度。藥物進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后，因結(jié)構(gòu)上的差異或多或少會(huì)與血液中的成分形成結(jié)合型（bound）藥物，而未被結(jié)合（unbound）的部分則稱(chēng)為游離型藥物（free drug）。藥物的結(jié)合主要通過(guò)離子鍵，氫鍵，疏水性結(jié)合及范德華力結(jié)合，一般是可逆的，結(jié)合型藥物分子變大不易透膜而“儲(chǔ)存”于血液中，經(jīng)血液運(yùn)輸通過(guò)游離藥物分布到機(jī)體各組織部位。因病理等原因,藥物與血漿蛋白結(jié)合的變化可能導(dǎo)致藥物消除速率常數(shù)的改變，從而對(duì)體內(nèi)血漿濃度產(chǎn)生暫時(shí)或持續(xù)的影響。因此對(duì)于治療窗口窄，游離分?jǐn)?shù)低，清除率高或分布容積小的藥物，其血漿結(jié)合率在體內(nèi)發(fā)生變化時(shí)可能具有潛在的臨床意義[1]。
血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定方法
目前常用于血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定的方法主要包括平衡透析法（equilibrium dialysis, ED）、超濾法（ultrafiltration, UF）、超速離心法（ultracentrifugation, UC）和其他不常用的方法。結(jié)果通常表示為未結(jié)合分?jǐn)?shù)（fu, fraction unbound）或蛋白結(jié)合率 （PB, % protein binding），公式如下：
1、平衡透析法（ED）
ED采用半透膜分割的兩隔室裝置進(jìn)行測(cè)定，一側(cè)加入含藥的蛋白溶液，另一側(cè)加入空白的緩沖液，此條件下僅游離藥物可以自由穿過(guò)半滲透膜，孵育一段時(shí)間，兩側(cè)達(dá)到平衡后兩側(cè)的游離藥物濃度相等，結(jié)合態(tài)的藥物仍然停留于蛋白溶液側(cè)，通過(guò)測(cè)定兩側(cè)的藥物濃度即可算得PPB。下圖1展示平衡透析法示意圖。Theo de Boe and Henri Meijering在闡述了平衡透析法在蛋白結(jié)合率考察中的優(yōu)缺點(diǎn)，見(jiàn)表1。
圖1:平衡透析法的示意圖[2]
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優(yōu)點(diǎn)
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缺點(diǎn)
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平衡透析耗材低的非特異性吸附特性，對(duì)Fu的測(cè)定影響小
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耗時(shí): 常規(guī)平衡透析3-48小時(shí)達(dá)到平衡；對(duì)于快速平衡透析2-6小時(shí)達(dá)到平衡
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實(shí)驗(yàn)在二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行，可以控制實(shí)驗(yàn)溫度和pH值
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對(duì)于穩(wěn)定性差的化合物不合適
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快速平衡透析可以用96孔板，通量高
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不適合在緩沖液中溶解性及其不好的化合物
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快速平衡透析需要用的樣品量少
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傳統(tǒng)透析需要樣品量大
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價(jià)格便宜，操作容易
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表1：平衡透析方法的優(yōu)缺點(diǎn)[2]
2、超濾法（Ultrafiltration，UF）
超濾法與平衡透析法類(lèi)似，同樣采用半透膜分隔的兩隔室裝置進(jìn)行測(cè)定。含藥蛋白溶液加入上層隔室，在外界壓力或者離心條件快速的使游離藥物運(yùn)動(dòng)至下方buffer側(cè)，通過(guò)測(cè)定兩側(cè)化合物濃度計(jì)算蛋白結(jié)合率，圖3為超濾法的示意圖。該方法相對(duì)于ED優(yōu)勢(shì)在于其試驗(yàn)時(shí)間短，可顯著減少酯酶代謝、蛋白稀釋和蛋白滲漏造成的試驗(yàn)偏差。而該方法最大的劣勢(shì)為藥物非特異性結(jié)合效應(yīng)較明顯，尤其對(duì)于高脂溶性化合物，該類(lèi)情況下可以采用測(cè)定buffer中結(jié)合率進(jìn)行試驗(yàn)作為基礎(chǔ)對(duì)照，考察無(wú)蛋白條件下化合物的結(jié)合情況，校正正式試驗(yàn)結(jié)果。Theo de Boe and Henri Meijering闡述了超濾法在蛋白結(jié)合率考察中的優(yōu)缺點(diǎn)，見(jiàn)表2。
圖1:超濾法的示意圖[2]
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優(yōu)點(diǎn)
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缺點(diǎn)
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高準(zhǔn)確度
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使用外力(壓力)。易受實(shí)驗(yàn)耗材的影響，例如：蛋白質(zhì)泄漏。
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高通量（96-孔板）
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溫度和pH值不容易控制
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相對(duì)快速和容易實(shí)現(xiàn)
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非特異性結(jié)合影響未結(jié)合部分
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適用于不穩(wěn)定化合物
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使用96孔板時(shí)易受“邊緣效應(yīng)”影響
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在超濾液中可能存在藥物不溶性
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不能用于高度疏水的化合物
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表2：超濾法的優(yōu)缺點(diǎn)[2]
3、超速離心法（Ultracentrifugation，UC）
對(duì)于已含有藥物的血漿基質(zhì)，使用高速離心沉淀蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)結(jié)合的藥，通過(guò)比較無(wú)蛋白上清液和完整的藥物的濃度來(lái)計(jì)算游離分?jǐn)?shù)，圖4為超速離心法示意圖。避免了膜相關(guān)問(wèn)題(非特異性結(jié)合、跨膜滲漏等)是該方法的優(yōu)勢(shì)。但往往通量低，難以控制pH(可以顯著影響蛋白質(zhì)結(jié)合的條件)，需要研究化合物在基質(zhì)中較長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定(典型的離心時(shí)間為2小時(shí))，上清可能不完全無(wú)蛋白質(zhì)，導(dǎo)致觀察到人為的高游離分?jǐn)?shù)。Theo de Boe and Henri Meijering闡述了超速離心法在蛋白結(jié)合率考察中的優(yōu)缺點(diǎn)，見(jiàn)表3。
圖1:超速離心法的示意圖[2]
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優(yōu)點(diǎn)
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缺點(diǎn)
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適用于高疏水性化合物
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使用外力(壓力)。
游離和結(jié)合藥物的共沉降(MW >300 Da)
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高準(zhǔn)確性
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溫度可以控制，但pH值不容易控制
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無(wú)膜的非特異性吸附現(xiàn)象
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無(wú)高通量潛力
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無(wú)體積移位和蛋白質(zhì)滲漏現(xiàn)象
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耗時(shí)且樣品數(shù)量有限
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不能用于不穩(wěn)定的化合物
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需要昂貴的設(shè)備和特殊的操作技能
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上清中可能存在藥物不溶性
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需要的樣品量體積大
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表3：超速離心法的優(yōu)缺點(diǎn)[2]
蛋白結(jié)合率技術(shù)的選擇和分析方法的要求
血漿蛋白結(jié)合率實(shí)驗(yàn)中使用含有未標(biāo)記化合物，可以采用LC-MS/MS來(lái)測(cè)定來(lái)自不同蛋白結(jié)合率實(shí)驗(yàn)的樣品，計(jì)算出蛋白結(jié)合率。European Bioanalysis Forum (EBF) 將藥物研發(fā)過(guò)程中蛋白結(jié)合率實(shí)驗(yàn)，分為Drug discovery階段蛋白結(jié)合率研究，Drug development階段體外蛋白結(jié)合率研究，Drug development階段體內(nèi)蛋白結(jié)合率研究。根據(jù)這三個(gè)階段的蛋白結(jié)合率實(shí)驗(yàn)，EBF對(duì)一系列實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了調(diào)研，并對(duì)調(diào)查結(jié)果進(jìn)行了討論，給出具操作性的建議。對(duì)于不同化合物，可以根據(jù)化合物的理化性質(zhì)來(lái)挑選蛋白結(jié)合率測(cè)定方法[3]。
表1：根據(jù)化合物的性質(zhì)選擇血漿蛋白結(jié)合率技術(shù)。從Drug development階段的體外血漿蛋白結(jié)合研究(上表)和體內(nèi)血漿蛋白結(jié)合研究(下表)的調(diào)查中得到答案。符號(hào)的數(shù)量表明該技術(shù)是否被許多公司使用(符號(hào)數(shù)量較多)或僅被少數(shù)公司使用(符號(hào)數(shù)量較少)[3]。
表2：根據(jù)預(yù)期蛋白結(jié)合率選擇血漿蛋白結(jié)合率技術(shù)：可分為極高蛋白結(jié)合率(>98%)、高蛋白結(jié)合率(85–98%)和中低蛋白結(jié)合(<85%)。從Drug development階段的體外血漿蛋白結(jié)合研究(上表)和體內(nèi)血漿蛋白結(jié)合研究(下表)的調(diào)查中得到答案。符號(hào)的數(shù)量表明該技術(shù)是否被許多公司使用(符號(hào)數(shù)量較多)或僅被少數(shù)公司使用(符號(hào)數(shù)量較少)[3]。
對(duì)于Drug discovery和Drug development中，蛋白結(jié)合率實(shí)驗(yàn)中，生物分析方法驗(yàn)證的程度，業(yè)內(nèi)沒(méi)有詳細(xì)的指導(dǎo)原則。不同的實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用從基本的篩選到完全驗(yàn)證的方法，來(lái)支持血漿蛋白結(jié)合率分析檢測(cè)。EBF對(duì)不同實(shí)驗(yàn)室的情況進(jìn)行了調(diào)研，并得出如下圖結(jié)果。
圖5：在三個(gè)調(diào)查問(wèn)題中，對(duì)于“是用確認(rèn)或者驗(yàn)證的生物分析方法來(lái)分析蛋白結(jié)合率實(shí)驗(yàn)樣品”得到的反饋。
(A):問(wèn)題1：Drug discovery階段蛋白結(jié)合率研究；
（B）問(wèn)題2：Drug development階段體外蛋白結(jié)合率研究；
（C）問(wèn)題3：Drug development階段體內(nèi)蛋白結(jié)合率研究[3]
EBF建議采用分層方法設(shè)計(jì)蛋白結(jié)合率研究和檢測(cè)蛋白結(jié)合率樣品[3]。
1、在Drug discovery階段
不需要實(shí)驗(yàn)計(jì)劃
不需要做研究前的方法確證
不需要陽(yáng)性對(duì)照
使用一個(gè)濃度（n=2）
使用通用分析方法（基于篩選或確認(rèn)實(shí)驗(yàn)的要求）或者有限的預(yù)研究方法確認(rèn)（標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品）
項(xiàng)目中的方法確認(rèn)：有限的校準(zhǔn)曲線樣品，并提前定義擴(kuò)大接受標(biāo)準(zhǔn)(25%的標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確度)，QC樣品可選
建議使用合適的內(nèi)標(biāo)
原始數(shù)據(jù)可用。如果要求，可提供簡(jiǎn)短的總結(jié)報(bào)告[3]。
2、在Drug development階段（體內(nèi)和體外蛋白結(jié)合率研究）
可以在實(shí)際的蛋白結(jié)合率研究之前進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)，例如，記錄非特異性結(jié)合或其他關(guān)鍵參數(shù)(基于先驗(yàn)知識(shí)或化合物類(lèi)特征)。
可選陽(yáng)性對(duì)照
使用至少三個(gè)藥物濃度水平(每個(gè)水平至少三個(gè)重復(fù))
使用已確認(rèn)的方法或在項(xiàng)目中提前確認(rèn)的方法：記錄校準(zhǔn)曲線、準(zhǔn)確性、精密度、特異性、殘留和穩(wěn)定性
在研究中或者提前定義標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的接收標(biāo)準(zhǔn)（擴(kuò)大到20%，對(duì)于定量下限是25%）
建議使用穩(wěn)定性同位素內(nèi)標(biāo)
研究報(bào)告包括所有實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)和結(jié)果[3]。
EBF對(duì)于蛋白結(jié)合率實(shí)驗(yàn)方法選擇和要求的建議，為藥物在臨床階段的蛋白結(jié)合率實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展給出了根本遵循和行動(dòng)指南。
結(jié)語(yǔ)
在生物分析部，我們建立了臨床血漿蛋白結(jié)合率的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，已經(jīng)開(kāi)發(fā)，驗(yàn)證了多個(gè)蛋白結(jié)合率檢測(cè)方法，可以為更多客戶提供臨床蛋白結(jié)合率檢測(cè)服務(wù)。我們期待通過(guò)專(zhuān)業(yè)的業(yè)務(wù)能力，持續(xù)賦能客戶的新藥研發(fā)項(xiàng)目。
參考文獻(xiàn)
[1]郭賓，李川.藥物與血漿蛋白結(jié)合率的藥理學(xué)基礎(chǔ)及其研究進(jìn)展.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)2005Mar;10(3): 241-253
[2]Theo de Boer and Henri Meijering, Equilibrium Dialysis, Ultracentrifugation, and Ultrafiltration in LC‐MS Bioanalysis
[3] Brigitte Buscher, Sirpa Laakso, Hermann Mascher, Klaus Pusecker, Mira Doig, Lieve Dillen,
Winfried Wagner-Redeker,Thomas Pfeifer, Pascal Delrat & Philip Timmerman. Bioanalysis
for plasma protein binding studies in drug discovery and drug development: views and recommendations of the European Bioanalysis Forum. Bioanalysis (2014) 6(5), 673–682.
京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
