對(duì)于藥物分析人員而言，HPLC方法的開發(fā)是一個(gè)難以回避的問題，是分析進(jìn)程中的限速步驟，在確定了雜質(zhì)譜，對(duì)待研究物質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)（pKa，logD等）進(jìn)行預(yù)測(cè)后，便會(huì)面臨色譜柱的選擇，不同類型的色譜柱提供不同的選擇性，根據(jù)分離度計(jì)算公式RS=（1/4）[k/(1+k)(α-1)N0.5]，選擇性α與分離度成正相關(guān)，因此色譜柱的選擇是方法開發(fā)至關(guān)重要的一環(huán)。面對(duì)市場(chǎng)上琳瑯滿目的色譜柱，你是否感到手足無措，不知該如何下手呢？不要急，本文將對(duì)Waters、Agilent、ThermoFisher三大廠家主流HPLC色譜柱進(jìn)行系統(tǒng)對(duì)比，讓你對(duì)色譜柱有一個(gè)更清晰的認(rèn)識(shí)。（本文以硅膠顆粒及小分子分離分析為基礎(chǔ)進(jìn)行介紹。）
首先呢，我們先來了解一下色譜柱的構(gòu)造。色譜柱的填充主要包括固相載體（主要為硅膠顆粒）及附著在載體上的配合基（C8/C18/Phenyl/PFP等）。顆粒的特征主要分為類型、直徑、孔徑大小和表面積。一般來講，表面積與保留時(shí)間、最大進(jìn)樣量成正比，與孔徑成反比。顆粒類型主要分為完全多孔的硅膠顆粒、表面多孔顆粒、薄殼型顆粒、混合顆粒及灌注顆粒。幾種顆粒類型特征如下表所示。
由上表可知，適合小分子分離分析的顆粒主要為全多孔硅膠顆粒、表面多孔顆粒及混合顆粒，而三大廠商也是以此為依托進(jìn)行不斷的改良。其中，混合顆粒在1977年被Unger等人報(bào)道后，被Waters公司全力發(fā)展。
Waters HPLC色譜柱有4大經(jīng)典色譜柱系列和4大顆粒平臺(tái)。
4大經(jīng)典色譜柱系列為Sunfire、Symmetry、Atlantis及XTerra系列。Sunfire、Symmetry系列主要采用高純硅膠顆粒，是Waters公司早期系列色譜柱。Atlantis系列主要為解決大極性化合物保留設(shè)計(jì)的色譜柱，主要有Atlantis T3柱，Atlantis dC18柱及Atlantis HILIC柱。XTerra系列是第一代雜化顆粒色譜柱，而XTerra MS C18柱pH耐受范圍可達(dá)1-12，溫度耐受范圍可達(dá)60℃，體現(xiàn)出了雜化顆粒的特性。
4大顆粒平臺(tái)為BEH（亞乙基橋雜化顆粒）、CSH XSelect（表面帶電雜化顆粒）、CORTECS（表面多孔硅膠顆粒）及HSS XSelect（高強(qiáng)度全多孔硅膠顆粒）。BEH系列主要分為3種色譜柱——常規(guī)C8/C18柱，親水柱（RP18\HILIC\Amide）及苯基柱。CSH XSelect系列提供堿性化合物的極佳峰形與載量，主要有C18柱、五氟苯基柱（PFP）及苯基柱。CORTECS系列主要分為4種色譜柱——常規(guī)C8/C18柱，C18+柱，親水柱（RP18\HILIC\T3）及苯基柱，C18+柱表面帶正電鍵合相，可在低pH條件下使堿性化合物獲得優(yōu)異的峰形。HSS XSelect系列主要分為常規(guī)柱（C18/SB C18）、親水柱（T3）、五氟苯基柱（PFP）及氰基柱（CN）。
Agilent HPLC色譜柱主要分為2大系列——ZORBAX系列及Poroshell 120系列，分別對(duì)應(yīng)全多孔硅膠顆粒及表面多孔硅膠顆粒。根據(jù)工藝不同，ZORBAX系列可分為5個(gè)小系列——Eclipse plus、StableBond、Eclipse XDB、Extend C18及Bonus-RP。Eclipse plus系列是Agilent完全創(chuàng)新的新型柱，可以保證堿性、酸性和中性化合物的優(yōu)異峰形、分離度和結(jié)果（見圖2）。StableBond系列為pH值低至1的低pH應(yīng)用提供了非常高的穩(wěn)定性，且為未封端工藝。Eclipse XDB系列采用超密鍵合和雙封端工藝，以盡可能多地覆蓋活性硅醇基。Extend C18柱采用獨(dú)特的雙齒型鍵合和雙封端工藝，使其能夠在pH值高達(dá)11.5的高pH應(yīng)用中提供高效率和高選擇性優(yōu)勢(shì)。Bonus RP柱在C14烷基鏈中嵌入了酰胺基團(tuán)，使其可以耐受100%水相。
前文已經(jīng)提到表面多孔硅膠顆粒的優(yōu)勢(shì)，因此Agilent開發(fā)了基于表面多孔硅膠顆粒的Poroshell 120系列色譜柱，以提供更高的通量和更高的分離度。
圖2 不同廠家、類型C18柱對(duì)嘧啶、苯酚峰形對(duì)比（圖片來自Agilent）
Thermo Scientific HPLC色譜柱主要分為3大系列——Hypersil GOLD、Syncronis及Accucore。Hypersil GOLD系列色譜柱采用改良的高純硅膠顆粒，提供12種不同的化學(xué)鍵合相，Hypersil GOLD C18色譜柱通過專有的衍生技術(shù)和封端程序使其pH耐受范圍可以達(dá)到1-11，可以與混合顆粒耐受范圍相媲美。Syncronis系列色譜柱采用高純硅膠顆粒，具有多種鍵合方式和封端的固定相（約7種）。Accucore系列色譜柱是Thermo Scientific基于表面多孔硅膠顆粒開發(fā)的系列色譜柱，提供了7種不同的鍵合相。具有表面多孔硅膠顆粒的優(yōu)勢(shì)。
值得一提的是，Hypersil GOLD HILIC色譜柱和Syncronis HILIC色譜柱都有極性鍵合相，而Waters公司的BEH/CORTECS/Atlantis HILIC色譜柱及Agilent公司的ZORBAX/Poroshell 120 HILIC色譜柱均為未鍵合的硅膠顆粒，從而顯示出不同的選擇性。
三大廠商常用色譜柱信息見表2。
接下來，介紹一下色譜柱的評(píng)價(jià)系統(tǒng)。USP藥典委員會(huì)給出了2種色譜柱評(píng)價(jià)方式——USP方法、PQRI方法。
USP方法是由美國(guó)藥典HPLC色譜柱工作組采用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（NIST）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)870（SRM870）（尿嘧啶、甲苯、乙苯、奎札因及阿米替林混合物），在甲醇-磷酸鹽緩沖液（pH7.0）（80：20）條件下對(duì)色譜柱進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法。該方法用乙苯的保留因子表征疏水性（Hy）；用奎札因的拖尾因子表征色譜柱殘留金屬離子的螯合作用（CTF）；用阿米替林的保留因子（CFA）及拖尾因子（TFA）表征硅醇基的活性。另外通過測(cè)定固定相的鍵合密度（BD）表征形狀選擇性（見圖3）。目前該數(shù)據(jù)庫(kù)共123根色譜柱信息。
圖3 色譜柱評(píng)價(jià)方式——USP方法
PQRI方法是PQRI原料藥技術(shù)委員會(huì)雜質(zhì)工作小組聯(lián)合Dr. Lloyd Snyder，采用一系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（見圖4），在50%乙腈/緩沖液；pH2.8、7.0；柱溫35℃條件下對(duì)色譜柱進(jìn)行評(píng)價(jià)的方法。該方法分別用疏水性（H），空間選擇性（S）,氫鍵酸性（A），氫鍵堿性（B），pH2.8及7.0條件下離子交換能力（C2.8\C7.0）表征色譜柱的能力（見圖5）。目前該數(shù)據(jù)庫(kù)共757根色譜柱信息。
圖6 色譜柱評(píng)價(jià)方式——Tanaka測(cè)試
上述3種色譜柱評(píng)價(jià)系統(tǒng)互為補(bǔ)充，分析工作者可以根據(jù)需要選擇性質(zhì)相似的替換柱或用于方法開發(fā)的性質(zhì)差異較大的色譜柱。
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