當(dāng)前蛋白及多肽類(lèi)藥物研究的如火如荼，而蛋白質(zhì)聚集是所有研發(fā)企業(yè)所面臨的一個(gè)關(guān)鍵性難題。如若在整個(gè)生產(chǎn)工藝過(guò)程中蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，那么首先影響的是蛋白質(zhì)的收率，更重要的是蛋白質(zhì)聚集還會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)質(zhì)量產(chǎn)生較大的影響，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的藥效。因此了解蛋白質(zhì)聚集的途徑、影響因素和控制蛋白質(zhì)聚集是十分必要的。
而蛋白質(zhì)的聚集因素多種多樣，如上游工藝以及下游工藝的影響，以及儲(chǔ)存以及運(yùn)輸條件的影響等等。可以說(shuō)稍不注意，蛋白質(zhì)就會(huì)發(fā)生聚集。今天筆者就借用本篇文章來(lái)談?wù)劦鞍踪|(zhì)聚集途徑以及防控手段。
2、上游工藝的影響
（1）pH
pH是上游工藝中調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝物產(chǎn)生的關(guān)鍵參數(shù)之一。pH值會(huì)影響蛋白的穩(wěn)定性。通常pH在等電點(diǎn)附近發(fā)生顯著變化的話(huà)，特別是pH向等電點(diǎn)變化，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)部分去折疊，從而發(fā)生聚集。
（2）離子
在上游工藝中，我們會(huì)使用到一些培養(yǎng)基，涉及到如Cl-、SO42-、PO43-、NO3-、Na+、K+、Ca2+等。而這些陰離子和陽(yáng)離子都會(huì)影響蛋白質(zhì)的聚集。離子結(jié)合后蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化，從而影響蛋白質(zhì)的聚集。離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合本質(zhì)上可以是放熱的或吸熱的。離子與放熱位點(diǎn)的發(fā)結(jié)合可以穩(wěn)定構(gòu)象，進(jìn)而抑制蛋白聚集。而離子與蛋白質(zhì)的吸熱結(jié)合破壞了穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而加速了蛋白的聚集。因此，了解離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合行為并通過(guò)調(diào)節(jié)離子類(lèi)型或濃度，可以控制蛋白質(zhì)的聚集行為。
（3）剪切/攪拌
蛋白質(zhì)的機(jī)械攪拌或剪切可誘導(dǎo)或加速蛋白質(zhì)的聚集，因?yàn)榧羟?攪拌應(yīng)力提供了誘導(dǎo)構(gòu)象變化所需的活化能。此外，剪切/攪拌會(huì)增加蛋白質(zhì)表面的疏水性，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集。
（4）空氣/水界面
蛋白質(zhì)分子在開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)、運(yùn)輸和儲(chǔ)存過(guò)程中由于機(jī)械攪拌和搖晃而暴露于空氣/水界面。空氣和蛋白質(zhì)疏水區(qū)域之間的界面吸附導(dǎo)致蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化從而聚集。空氣/水界面對(duì)蛋白聚集的影響取決于蛋白質(zhì)的分子量以及疏水性。
（5）溫度
分子內(nèi)氫鍵對(duì)球狀蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性至關(guān)重要。熱能會(huì)破壞蛋白質(zhì)的氫鍵，從而導(dǎo)致其展開(kāi)，最后發(fā)生聚集。
圖2 溫度及機(jī)械能導(dǎo)致蛋白展開(kāi)示意圖
（6）蛋白質(zhì)-賦形劑相互作用
蛋白質(zhì)-賦形劑的相互作用取決于賦形劑和蛋白質(zhì)的性質(zhì)。在上游加工中，糖類(lèi)、氨基酸和表面活性劑與蛋白質(zhì)相互作用，從而蛋白質(zhì)聚集。氨基酸的疏水性和電荷各不相同，會(huì)具有不同的聚集傾向。例如，精氨酸可抑制或加速聚集過(guò)程，這取決于分子間相互作用的類(lèi)型。精氨酸與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)的靜電相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)加速聚集，而精氨酸與芳香族殘基的相互作用抑制了蛋白質(zhì)聚集。
3、下游工藝的影響
下游工藝涉及不同類(lèi)型的一些相互作用，影響蛋白的穩(wěn)定性。如在離子交換以及親和層析的實(shí)驗(yàn)中會(huì)使用不同pH和離子強(qiáng)度的洗脫緩沖液，同時(shí)會(huì)存在過(guò)濾步驟，上述過(guò)程都會(huì)改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象并增加聚集傾向。
（1）蛋白質(zhì)-表面相互作用
蛋白質(zhì)-表面相互作用會(huì)引起蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，特別是由于鍵的形成和斷裂而導(dǎo)致螺旋性的喪失。例如，不銹鋼是反應(yīng)容器常用材料，而不銹鋼微粒會(huì)引起蛋白產(chǎn)生一定的聚集。不銹鋼表面不可逆吸附的蛋白質(zhì)數(shù)量促進(jìn)了聚集過(guò)程，吸附蛋白質(zhì)的量在固液界面處表面誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)聚集中起關(guān)鍵作用。同時(shí)表面的粗糙程度對(duì)蛋白質(zhì)聚集也有很大的影響。
（2）凍融、凍干及干燥
凍融和凍干通常是下游加工過(guò)程中的最后一步，并會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的聚集。以上過(guò)程可能會(huì)導(dǎo)致pH值變化，從而導(dǎo)致聚集。此外，蛋白質(zhì)的干燥也會(huì)導(dǎo)致構(gòu)象變化。
4、其他過(guò)程的物理化學(xué)因素
其他各種因素，如化學(xué)修飾以及儲(chǔ)存也會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。例如，脫酰胺化化學(xué)修飾會(huì)增加蛋白的聚集，由于修飾后蛋白的的疏水性增加，mAb1和mAb2的脫酰胺化增強(qiáng)了其在較低的pH值時(shí)的聚集。
總之，蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象是通過(guò)不同的分子內(nèi)作用力來(lái)穩(wěn)定的，如氫鍵、二硫鍵、靜電、疏水相互作用等，氫鍵對(duì)于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是很關(guān)鍵的。因此，如果生產(chǎn)及儲(chǔ)存過(guò)程中產(chǎn)生的熱、化學(xué)和耗散能打破了分子內(nèi)作用力，就會(huì)導(dǎo)致蛋白展開(kāi)，從而聚集。下表1列出了影響蛋白穩(wěn)定性的不同因素以及相互作用類(lèi)型。
5、如何控制蛋白質(zhì)聚集？
（1）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)修飾
蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響著蛋白質(zhì)的聚集，所以我們放置蛋白質(zhì)聚集的第一種手段就是對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾以及改造。例如我們可以改變蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)域的凹面靜電勢(shì)，修飾后蛋白間的靜電力減少，這樣就可以有效的防止蛋白質(zhì)的聚集。
此外我們對(duì)于蛋白質(zhì)的糖基化修飾不完整的糖鏈應(yīng)特別關(guān)注，因?yàn)檫@種情況下很容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集，在濃縮的過(guò)程中更容易產(chǎn)生聚合物。
（2）生產(chǎn)工藝過(guò)程控制
首先在培養(yǎng)基中可以添加CuSO4，這樣可以使游離醇含量降低，從而促進(jìn)二硫鍵的生成，這樣就減少了以共價(jià)鍵形成的蛋白質(zhì)聚合物。
另外在超濾濃縮前的攪拌等步驟是容易發(fā)生聚集的，可以通過(guò)使用具有不同結(jié)構(gòu)的超濾膜以及通過(guò)添加表面活性劑減少蛋白質(zhì)聚集的形成。
在色譜層析過(guò)程中，蛋白質(zhì)的飽和結(jié)合導(dǎo)致層析柱表面蛋白質(zhì)濃度升高，進(jìn)而產(chǎn)生聚集。一般可以使用精氨酸作為洗脫保護(hù)劑而減弱蛋白質(zhì)的聚集。此外流動(dòng)相中不同的鹽也會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)聚集產(chǎn)生不同的影響，所以對(duì)于流動(dòng)相的組成的選擇需要認(rèn)真研究。
（3）運(yùn)輸及貯存過(guò)程控制
當(dāng)前有多種具有抑制蛋白質(zhì)聚集的分子和材料被發(fā)現(xiàn)以及應(yīng)用。以半胱氨酸反應(yīng)小分子ebselen為例，其能夠有效促進(jìn)二硫鍵的形成，進(jìn)而減少蛋白質(zhì)聚合物的產(chǎn)生。此過(guò)程最為關(guān)鍵的還是選擇合適的包裝材料。
6、小結(jié)
蛋白在制備以及存放過(guò)程會(huì)有多種因素影響其穩(wěn)定性，要保證蛋白的療效，那么首先就要確保蛋白的構(gòu)象沒(méi)有改變。而如何降低實(shí)驗(yàn)以及存放過(guò)程蛋白構(gòu)象的改變？那就要了解蛋白在各種因素下，如熱、化學(xué)和機(jī)械應(yīng)力、吸附和離子強(qiáng)度下的變化，進(jìn)而分析蛋白在這些條件下的聚集傾向和聚集機(jī)制，以確保其療效和患者的安全性。以下為蛋白生產(chǎn)及存儲(chǔ)過(guò)程中小編的幾點(diǎn)建議：
（1）在優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)的pH、溫度和離子強(qiáng)度時(shí)，還應(yīng)考慮對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響；
（2）當(dāng)?shù)鞍追磻?yīng)器械及存儲(chǔ)包材接觸時(shí)，應(yīng)確認(rèn)表面化學(xué)和粗糙度對(duì)吸附量和構(gòu)象變化的影響；
（3）基本了解溫度、pH、鹽濃度、離子強(qiáng)度、剪切對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響是必要的；認(rèn)識(shí)到這些因素的積極影響和不利影響，將有助于提高穩(wěn)定性；
（4）目前具有多種表面改性策略，可應(yīng)適表面改性，提高穩(wěn)定性；
（5）識(shí)別易聚集區(qū)域，這樣則可以減少蛋白質(zhì)聚集傾向，可以使用聚集預(yù)測(cè)工具來(lái)確定易聚集區(qū)域。
總之，應(yīng)系統(tǒng)地探索上游、下游和儲(chǔ)存過(guò)程的物理化學(xué)因素對(duì)治療性蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響，以減輕藥物損失，從而確保療效。
參考文獻(xiàn)
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