核磁共振（NMR）光譜儀是有機(jī)合成實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定表征、反應(yīng)控制和化合物純度分析的關(guān)鍵儀器。最常用的應(yīng)用就是定性分析外，大白話就是根據(jù)核磁數(shù)據(jù)確定化合物結(jié)構(gòu)。除了定性分析，核磁共振在定量分析（qNMR）中的應(yīng)用也越來越受歡迎。qNMR可以用于粗產(chǎn)物混合物的簡單定量，快速反應(yīng)產(chǎn)率的測定，和測定有機(jī)化合物的純度。傳統(tǒng)的核磁共振產(chǎn)率的測定需要在每個(gè)樣品中添加一個(gè)內(nèi)標(biāo)品。
定量核磁原理：NMR光譜中特定吸收峰的積分面積與負(fù)責(zé)該特定峰所對應(yīng)的質(zhì)子數(shù)成正比。我們平時(shí)對化合物合成進(jìn)行定性分析時(shí)，就是對每個(gè)核磁吸收峰進(jìn)行積分，通過各個(gè)化學(xué)位移和積分面積確定是哪個(gè)基團(tuán)的吸收峰。如果合成中含有雜質(zhì)，如果我們能確定雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，根據(jù)相應(yīng)吸收峰面積就可以確定出產(chǎn)物和雜質(zhì)的摩爾比（或摩爾濃度比，在同一溶劑中，體積一樣）。如果這個(gè)能理解，那你就已經(jīng)理解定量核磁的原理了。
如果我們想利用qNMR來測定化合物A的純度：下面我們命名一些參數(shù)，化合物A的一個(gè)確定峰的積分面積為Ia，這個(gè)確定峰對應(yīng)的質(zhì)子數(shù)為Na，化合物A的質(zhì)量為Wa，化合物A的摩爾質(zhì)量為Ma，化合物A的純度為Pa。加入內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品S相應(yīng)的參數(shù)為：Ps, Is, Ns, Ms, Ws。
在進(jìn)行定量分析時(shí)，先確定要對比的化合物A和化合物S的某個(gè)確定峰，Ia/Na和Is/Ns之比等于化合物A和化合物S的摩爾濃度之比。
來源：藥明康德研究服務(wù)部
利用上述此方法就可以測量出化合物A的純度。qNMR測量的純度比平時(shí)所用的HPLC所測的純度有更高的可信度，HPLC所測純度無法排除沒有紫外吸收的相關(guān)雜質(zhì)、揮發(fā)性雜質(zhì)、水分、殘留溶劑、無機(jī)鹽等因素的影響。其實(shí)定量核磁是可以測出樣品中精確的化合物含量，因此其另一個(gè)重要的應(yīng)用就是測量核磁收率。我們在進(jìn)行大量平行實(shí)驗(yàn)篩選反應(yīng)條件時(shí)，一般每個(gè)條件投料量很少，每個(gè)反應(yīng)條件都分離出來產(chǎn)物，來對比出最優(yōu)條件，將是一個(gè)很龐大的工作量，而且因?yàn)橥读狭亢苌伲Y(jié)果可信度也大打折扣。這時(shí)直接對反應(yīng)粗產(chǎn)物進(jìn)行定量核磁分析，即可直接確定粗產(chǎn)物中的產(chǎn)物的精確質(zhì)量，進(jìn)而直接算出核磁收率，極大的提高了工作效率。
但是傳統(tǒng)測定定量核磁必須要加入內(nèi)標(biāo)物，而且理想的內(nèi)標(biāo)應(yīng)該是高純度、便宜、穩(wěn)定、化學(xué)惰性、不揮發(fā)、不吸濕并且可溶于大多數(shù)NMR溶劑的化合物。先去找合適的內(nèi)標(biāo)物比較麻煩不說，如果樣品需要回收，內(nèi)標(biāo)物相當(dāng)于又引入了一個(gè)雜質(zhì)。在2021年，Ruslan Muhamadejev和Renate Melngaile等人報(bào)道了一種方法，即將CDCl3殘留溶劑作為此批次溶劑的定量核磁（qNMR）內(nèi)標(biāo)。這種方法大大簡化了樣品的制備，直接濃縮核磁共振溶劑即可回收分析物。該方法的準(zhǔn)確性與以1,3,5-三甲氧基苯作為內(nèi)標(biāo)的qNMR相當(dāng)【J. Org. Chem. 2021, 86, 3890−3896】。
用殘留的溶劑信號(hào)作qNMR的內(nèi)標(biāo)的前提是要確定了CDCl3批次中精確的CHCl3濃度。研究人員首先使用1,3,5-三甲氧基苯（TMB）做內(nèi)標(biāo)測定了CDCl3中未氘化的CHCl3殘留溶劑的濃度，測試結(jié)果為16.231±0.138mM。1個(gè)月后重復(fù)測定為16.144±0.037 mM（標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.23％），證明CHCl3濃度可以保持恒定至少1個(gè)月。
測量時(shí)向粗產(chǎn)物中，加入約3g精確稱量和預(yù)先確定的CHCl3濃度的CDCl3。將樣品溶液轉(zhuǎn)移到NMR管中并記錄HNMR光譜。將分析物的選擇信號(hào)進(jìn)行積分。在qNMR條件下測量HNMR后，根據(jù)下方等式即可確定樣品中的產(chǎn)物重量m(qNMR CHCl3)。然后根據(jù)第二個(gè)等式計(jì)算核磁產(chǎn)率。
c(CHCl3）為氘代氯仿中殘留氯仿的摩爾濃度，m(CDCl3）為氘代氯仿的精確質(zhì)量，ρ(CDCl3）為氘代氯仿密度，因?yàn)橘|(zhì)量更容易精確稱量，因此才會(huì)引入質(zhì)量和密度兩個(gè)參數(shù)。
然后根據(jù)第二個(gè)等式計(jì)算核磁產(chǎn)率。
作者使用這種方法qNMR確定了9種化合物的重量m(qNMR CHCl3），并與傳統(tǒng)的TMB內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行對比。結(jié)果表明新方法的準(zhǔn)確性與傳統(tǒng)方法相當(dāng)。
定量核磁一般要求：因此在操作過程中，為減少誤差，推薦稱量量在10mg以上；選取氘代試劑完全溶解樣品；設(shè)置采樣參數(shù)，將弛豫時(shí)間D1設(shè)為5倍T1以上，信噪比S/N在150以上；在譜圖處理過程中，選擇干擾較少，峰型較好，基線平穩(wěn)的質(zhì)子進(jìn)行積分。
參考文獻(xiàn)：J. Org. Chem. 2021, 86, 3890–3896；https://doi.org/10.1021/acs.joc.0c02744
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