反相色譜是迄今在高效液相色譜中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，主要是因為它適用于分析絕大多數(shù)的非極性物質(zhì)和很多的可離子化的及離子化合物。
Q：反相色譜包括哪些？
除C18、C8、C4、C2、C1、CN、NH2和Phenyl等常見的一些鍵合硅膠固定相外，還有幾個分支品種，如混合相固定相（例如苯基－己基）、封尾和未封尾的填料種類以及極性嵌入固定相等。還有其它很多填料也用于反相色譜，包括聚合物、聚合物包覆硅膠和聚合物包覆氧化鋁、無機－有機雜化物、涂覆氧化鋯和石墨化碳等。不同的固定相分別都有自己的優(yōu)點和缺點。
當(dāng)柱子被污染，它的色譜行為和沒被污染的柱子會有些不同。被污染的反相色譜柱會產(chǎn)生反壓問題，必須進行清洗和再生才能恢復(fù)到原來或接近原來的狀態(tài)。
本文將提出了一些切實可行的恢復(fù)方案供大家討論或參考。著重點在最常用的鍵合硅膠柱上，其它類型的反相柱的清潔和再生步驟最后也有介紹。
1、污染物在反相柱上的聚集如何觀察？
通常，樣品基體中會含有一些對分析者來說不感興趣的東西，如鹽、脂類、含脂物質(zhì)、腐殖酸、疏水蛋白質(zhì)和其它一些生物質(zhì)，是一些可能與HPLC柱發(fā)生相互作用的物質(zhì)。
這些物質(zhì)和目標分析物比，保留能力有些強，有些弱。那些保留能力小的雜質(zhì)，如鹽類，通常在死體積處就會被洗脫出來，在譜圖上表現(xiàn)為干擾峰、小斑點、基線擾動、甚至是倒峰等等。
而樣品基體中的強保留物質(zhì)，如果流動相的洗脫能力從來沒有調(diào)高到足以把它們洗脫出來，多次上樣后，它們就會在柱頭累積。這種現(xiàn)象通常在等度洗脫時容易觀察到。
保留能力中等的雜質(zhì)能被緩慢洗出而且表現(xiàn)為 寬峰、基線擾動或者基線漂移。
有時，這些被吸附的雜質(zhì)累積到雜質(zhì)本身足以作為一種新固定相的程度。分析物能與這些雜質(zhì)作用，起一定的分離作用。此時保留時間會發(fā)生漂移，并出現(xiàn)峰形拖尾。
如果污染程度再嚴重下去，柱子的反壓能超過泵所能承受的最大壓力，依照發(fā)生堵塞的位置不同，可使柱子無法工作或使柱頭塌陷產(chǎn)生空洞。
2、硅膠基質(zhì)鍵合反相柱的清洗
再生被污染HPLC柱子的關(guān)鍵是知道污染物的性質(zhì)并且能找到適當(dāng)?shù)娜軇﹣砣コ?/span>
如果污染是因為重復(fù)進樣時強保留物質(zhì)的累積引起的，利用簡單的清洗步驟來除去這些污染物往往就能恢復(fù)其色譜性能。經(jīng)過等度運行后的色譜柱，有時用90～100％含量的溶劑B（雙溶劑反相系統(tǒng)中洗脫能力較強的溶劑，如甲醇、乙晴、四氫 呋喃等）沖洗20個柱體積可以清除污染物（色譜柱的柱體積和空柱管體積概念不同，一根4.6x250mm柱子的柱體積只有2.5ml，2.1x150mm的是0.28ml）。
如果使用的是緩沖鹽系統(tǒng)，不要直接切換到強溶劑，突然轉(zhuǎn)換到高濃度有機溶劑可能會使HPLC流動體系中的緩沖鹽沉淀，這樣會導(dǎo)致更大的問題，如柱頭篩板堵塞、連接管路堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進樣閥轉(zhuǎn)軸失靈。應(yīng)該先用無緩沖鹽流動相（即把緩沖液換成水），沖洗5～10個柱體積以后才切換到用強溶劑清洗。
有時候，強溶劑B也沒法把殘留在色譜柱上的污染物洗掉。那么就需要用更強的溶劑或者是系列溶劑組合。
如果污染物不是生物質(zhì)的，一種強溶劑或幾種溶劑組合清洗基本能解決問題。柱子生產(chǎn)廠家的網(wǎng)頁和產(chǎn)品說明書上很多也有清洗方法推薦。
所有的清洗方法的模式普遍都類似，溶劑系列中所用溶劑的強度逐級增加，最后一個溶劑往往是非極性（疏水性）很強的（如醋酸乙酯甚至是烷烴），以便于溶解脂質(zhì)、油類等非極性污染物。溶劑系列中每個溶劑都保證能與下一個溶劑互溶。
整個清洗過程結(jié)束后，在回到原來的流動相體系前，必須借助一個中等強度的互溶性非常好的溶劑過渡。例如， 異丙醇是一個非常好的過渡溶劑，它既能與正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大，必須確保較低的流速以免使泵壓過高。
典型清洗方法
對于典型的硅膠基質(zhì)鍵合反相柱，在未使用緩沖溶液的條件下，推薦使用以下清洗溶劑系列：
100％甲醇---100％乙晴---75％乙晴/25％異丙醇---100％異丙醇---100％二氯甲烷---100％正己烷；
每種溶劑沖洗至少10個柱體積，對于250mm×4.6mm的分析柱，合適的沖洗流速是1～2ml/min。最后用10柱體積的異丙醇過渡，然后回到原來的流動相體系（但不含緩沖鹽），最后回復(fù)到起始流動相配置。
如果使用紫外檢測器，須避免選用在紫外區(qū)域有吸收的溶劑，要不然需使用大量的溶劑沖洗才能使基線平穩(wěn)。
四氫呋喃也是另外一種常用的清洗溶劑。
如果懷疑柱子被嚴重污染，還可用二甲亞砜（DMSO）或 二甲基甲酰銨和水按50：50的比例混合，以低于0.5ml/min的流速沖洗色譜柱。
成功再生反相柱子是一個非常耗時的過程，溶劑沖洗序列可以編成一個梯度洗脫的程序自動進行，以方便過夜操作。
3、清洗硅膠反相柱上的蛋白質(zhì)殘留
如果是生物物質(zhì)如血漿或血清等積累在反相色譜柱上，必須采用稍不同的清洗方法。
大部分情況下，純有機溶劑如乙腈或甲醇不能溶解多肽和蛋白質(zhì),就不能有效地清洗柱子。不過由有機溶劑和緩沖液、酸,有時還加上離子對試劑等組成的混合液能有用。開始可嘗試用高比例的的強溶劑（溶劑B）沖洗。
Freiser和他的合作者發(fā)現(xiàn):用三氟乙酸水溶液和三氟乙酸/丙醇溶液重復(fù)進行梯度洗脫,可以再生被污染的反相柱子。
Bhadwaj和Day認為在250mm×46mm的柱子中注入100μL的三氟乙醇就能起到效果。
如果上述幾個方法都不成功，Cunico和他的同事推薦了幾種強溶劑或增溶劑可用來除去蛋白質(zhì)，見下所列：
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清洗溶劑 |
組成 |
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醋酸 |
1%水溶液 |
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三氟醋酸 |
1%水溶液 |
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0.1%三氟醋酸水溶液/丙醇 |
40:60(v/v)(較粘,需降低流速) |
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TEA(三乙胺)/丙醇 |
40:60(v/v)(混合前用0.25N磷酸和三乙胺調(diào)pH到2.5) |
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脲或胍的水溶液 |
5-8M(調(diào)pH到6-8) |
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氯化鈉、磷酸鈉或硫酸鈉溶液 |
0.5-1.0M（磷酸鈉pH7.0 |
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DMSO/水 或二甲基甲酰胺/水 |
50：50（v/v） |
在使用這些清洗溶劑之前，可以先咨詢柱子的廠商確保這些溶劑不會對填料帶來損壞。硅膠基質(zhì)的柱子通常來說都是可以的，但某些洗滌溶劑的配方可能會使有機聚合物基質(zhì)的填料膨脹或收縮，從而影響其色譜性能。
另外，須確保上表用的清洗溶劑能與先前用過的溶劑互溶，丙醇可以作為很好的過渡。對每個溶劑系統(tǒng)至少要沖洗20個柱體積。由于有些溶劑系統(tǒng)黏度很大，沖洗的流速應(yīng)該相應(yīng)調(diào)整以確保不會超過泵壓。用完胍或脲等溶劑清洗柱子后，至少應(yīng)該用40～50柱體積的HPLC級純水來沖洗。
對于反相柱子，不建議用表面活性劑如十二烷基磺酸鈉（SDS）和Trition，因為這些化合物必然會牢固吸附在硅膠鍵合相柱子上，很難除去。用表面活性劑會影響改變填料表面性質(zhì)。然而，Separation Group的研究表明:多肽合成產(chǎn)生的保護基和清除劑對柱子的污染，可以通過在流動相中加入500μL 1％SDS溶液以1ml/min的流速清洗掉。然后再用從5％～95％乙腈/1％（v/v）三氟醋酸的梯度洗脫，在起始條件平衡后，就可以恢復(fù)柱子的多肽分離功能。
4、清洗反相柱的特殊技巧
4.1去除金屬離子吸附
有時用有機溶劑清洗污染柱子并不能成功，尤其是有金屬離子吸附在硅膠或鍵合相上時：
可用鰲合劑如0.05M乙二胺四乙酸（EDTA）沖洗色譜柱，EDTA能與許多金屬離子絡(luò)合并溶解它們。
用完EDTA溶液后，一定要用水充分沖洗柱子。
如果樣品中含離子化合物，改變pH可以使它們轉(zhuǎn)為非離子狀態(tài)，這樣就可以被水/有機溶劑洗脫下來。例如，強堿性雜質(zhì)能在pH低于3時被除去，在這個條件下質(zhì)子銨變得水溶性更好。酸性雜質(zhì)能在pH調(diào)整到大于其pKa時被洗下來--大約時pH8或9，此時酸性雜質(zhì)處于離子狀態(tài)。然而，要注意硅膠柱子在長時間處于高pH條件下容易被破壞。
4.2避免柱子長菌
要避免緩沖液或用緩沖液保存的柱子長菌，可以用普通家用漂白劑1：10或1：20稀釋后來沖洗，50柱體積沖洗后，接著至少要用50柱體積色譜純的水沖洗。
不能讓漂白水通過檢測器，因為漂白水會腐蝕檢測池。
避免溶劑瓶中緩沖液長菌，每次只取足夠的緩沖液用，把沒用的保存在冰箱里，添加0.1％疊氮化鈉在緩沖液中，不能讓不流動的緩沖液在柱子中長期存在。
4.3關(guān)于使用離子對試劑
色譜工作者經(jīng)常會討論到離子對色譜中離子對試劑對固定相的影響。顯然離子對試劑如辛烷－磺酸（用于陽離子）和四烷基銨溴（用于陰離子）在一定濃度的有機修飾劑下能很強地吸附在硅膠鍵合柱子上，柱子因此被污染且很難回復(fù)到起始狀態(tài)。
因此，一般認為用過離子對試劑的柱子都應(yīng)該專用，而不能再當(dāng)常規(guī)的反相色譜柱用。
Bidlingmeyer不同意這種觀點，他認為：離子對色譜所用的pH酸度或堿度很大，在酸性條件下（pH1-3）使鍵合相和封尾試劑水解，在高pH條件下（pH7-8）溶解硅膠基質(zhì)，因而使一些柱子的性能改變。要清除磺酸離子對試劑，他建議首先用原先的流動相（僅少了離子對試劑）至少沖洗20柱體積，然后用無緩沖液的流動相沖洗(在這個清洗步驟中，甲醇可能比乙晴更有效；如果是長鏈的離子對試劑，則用四氫呋喃)。很明顯，磺酸離子對試劑和銨離子對試劑有著不同的表現(xiàn)。
Bidlingmeyer和他的合作者證明了：在C18柱子上用甲醇比例超過70%的流動相，長鏈離子對試劑，如SDS不會吸附在固定相上。這個發(fā)現(xiàn)跟Separation Group的結(jié)果一致。
4.4整體柱的清洗方法
硅膠鍵合整體柱如Chromolith 柱子（德國默克公司產(chǎn)品），清洗時可跟別的硅膠柱一樣處理。
5、聚合物柱子的再生
用來分離生物分子的聚合柱也會被污染，也需要清潔。
聚合材料非常之好的化學(xué)穩(wěn)定性通常是這種柱子的強處所在。很多廠家建議用1.0M的硝酸或1.0M的氫氧化鈉來清洗聚合物柱。一些反相聚合柱，如用聚苯乙烯/二乙烯基苯（PS－DVB）微球作填料的柱子，和用CIM RP－SDVB片做的聚合物整體柱，以及Swift柱子（美國Isco公司），都能耐寬的pH范圍（通常pH11～13或有時pH0～14）。
使用者用強有機溶劑沖洗柱子時要注意聚合物材料的溶脹和收縮問題，其程度一般由其交聯(lián)度決定。高于8～10％交聯(lián)度的聚合物通常有較好的機械性能，在水溶液中收縮很少，在有機溶劑中膨脹也不大。用一系列溶劑清洗聚合柱之前，最好能閱讀使用說明書或咨詢生產(chǎn)商的技術(shù)支持部門。
PS-DVB柱再生辦法
用含0.1％三氟乙酸的2-丙醇以一半流速沖洗10個柱體積以上
用100％流動相B溶劑以一半流速沖洗5個柱體積以上
用100％流動相A溶劑在正常流速下至少平衡10個體積以上
清洗含丁基和乙基的丙烯酸甲酯為基質(zhì)的整體柱，可按順序分別反向沖洗10個柱體積的1.0M氫氧化鈉、水、20％乙醇溶液和工作緩沖液來清除沉淀的蛋白質(zhì)。
如果有疏水性更強的蛋白質(zhì)存在，就應(yīng)該在水清洗之后插入一個30％異丙醇或70％乙醇的清洗步驟。
如果要清洗或滅活微生物菌落，PS－DVB聚合整體柱可以用0.5～1.0M的氫氧化鈉徹底清洗，在室溫下至少要用氫氧化鈉洗泡一個小時。
用傳統(tǒng)聚合基質(zhì)裝填的柱子，用來分離一些溶解度很小的蛋白質(zhì)如膜蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、和病毒外殼蛋白等，需要用較強的清洗條件。例如含3M鹽酸胍的50％異丙醇溶液在60℃才能把這些蛋白質(zhì)除去。
在固相樹脂中去除合成肽，能產(chǎn)生有反應(yīng)活性的有機正離子，可被苯甲醚和苯硫基甲烷清除。
清除正離子反應(yīng)產(chǎn)生了大的芳香族分子，這些芳香族分子會在肽純化時污染柱子。這種污染物在C18柱子上有非常高的保留沒法被100％的甲醇或乙晴洗出。要清洗這類柱子，必須把柱子反向沖洗，依次用5柱體積100％異丙醇，3-5個柱體積二氯甲烷，然后再用3-5柱體積異丙醇，最后到初始溶劑系統(tǒng)?？梢酝ㄟ^260nm紫外檢測到有芳香族雜質(zhì)的洗脫出。
6、氧化鋯基質(zhì)HPLC柱子的再生
ZirChrom Separations，Inc.（Anoka，Minnesota，USA）生產(chǎn)了一系列的氧化鋯基質(zhì)柱子。該產(chǎn)品系列有幾種反相柱子，包括聚丁乙烯，聚苯乙烯和石墨化碳等。
氧化鋯比硅膠柱子的pH耐受性要好，所以涂上氧化鋯能夠耐受更苛刻的條件如高pH和高的操作溫度。然而，因為其特殊表面性質(zhì)，需要維持一定的實驗條件才能用這種柱子成功分析各種分析物。
羧酸，氟化物和磷酸根離子都在氧化鋯柱子上有強吸附。要清除這些物質(zhì)，應(yīng)該用20％乙晴－0.1M氫氧化鈉或0.1M四甲基氫氧化銨混合物沖洗50個柱體積，然后用10柱體積的水、50柱體積20％乙晴－0.1M硝酸混合物、10柱體積水，最后是用20柱體積100％有機溶劑，依次沖洗。
對于聚丁乙烯和聚苯乙烯柱子，可以用甲醇、乙晴、異丙醇或四氫呋喃清洗。
而石墨化碳柱子至少要用20％四氫呋喃的溶劑。
結(jié)語
含有強保留物質(zhì)（特別是分子量大或疏水性強的物質(zhì)、諸如蛋白質(zhì)一類的生物質(zhì)成分，以及容易吸附在硅膠表面硅醇基上的強堿性物質(zhì)等）的樣品，通過進樣不斷進入反相色譜柱，會導(dǎo)致色譜柱污染。另外，某些流動相添加劑，如離子對試劑和表面活性劑，能吸附在填料表面而改變表面性質(zhì)。被污染的柱子會導(dǎo)致峰形差，保留行為重復(fù)性差，高柱壓，和基線漂移等現(xiàn)象。通常，用有機溶劑或者是能夠破壞污染物與鍵合相或硅膠表面作用的試劑都能夠清潔色譜柱。
色譜工作者在清洗色譜柱時要十分小心謹慎，因為有些試劑腐蝕性活性很強，可能會對鍵合相本身有損害作用。此外，利用SPE等樣品制備技術(shù)對樣品進行預(yù)先凈化，可以盡量減少柱子與污染物的接觸從而避免柱子的污染。還有使用預(yù)柱和保護柱也是避免對分析柱污染和損害的很好方法。
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