目的：建立某高風(fēng)險(xiǎn)注射劑生產(chǎn)企業(yè)制藥用水系統(tǒng)微生物數(shù)據(jù)庫(kù)，為企業(yè)制藥用水系統(tǒng)污染微生物的有效控制和溯源調(diào)查提供指導(dǎo)。
方法：連續(xù)4個(gè)季度對(duì)某大容量注射劑生產(chǎn)企業(yè)的純化水系統(tǒng)和注射用水系統(tǒng)監(jiān)控收集微生物，采用基于16S rRNA 和ITS rDNA 序列比對(duì)等方法鑒定污染微生物，結(jié)合微生物種屬和來(lái)源信息進(jìn)行分析，建立企業(yè)制藥用水系統(tǒng)的微生物菌庫(kù)。
結(jié)果：共分離鑒定1499 株細(xì)菌和20株真菌，注射用水系統(tǒng)和純化水系統(tǒng)的微生物分別占比9.0%和91.0%。純化水系統(tǒng)中鞘氨醇單胞菌和甲基桿菌最多，分別占全部分離菌的28.9%和25.2%。注射用水系統(tǒng)中葡萄球菌和微球菌較多，分別占全部收集菌的24.9%和18.2%。純化水系統(tǒng)中污染的微生物主要為革蘭氏陰性菌，占污染微生物總數(shù)的67.0%。注射用水系統(tǒng)中污染的微生物主要為革蘭氏陽(yáng)性菌，占污染微生物總數(shù)的60.3%。制藥用水系統(tǒng)中較為常見(jiàn)的真菌為雜色曲霉菌和產(chǎn)黃青霉。此外，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，純化水系統(tǒng)的微生物在第二季度和第三季度數(shù)量占比較多，占全年微生物總量67.8%，第一季度和第四季度微生物數(shù)量則下降；注射用水系統(tǒng)微生物數(shù)量則在第二季度較多，其余3個(gè)季節(jié)數(shù)量差不多。
結(jié)論：建立制藥用水系統(tǒng)微生物菌庫(kù)可指導(dǎo)制藥用水系統(tǒng)的運(yùn)行維護(hù)及消毒滅菌，同時(shí)也為高風(fēng)險(xiǎn)藥品生產(chǎn)企業(yè)的微生物污染事件提供溯源調(diào)查基礎(chǔ)。
制藥用水是藥品生產(chǎn)過(guò)程中使用量最大最廣的一種原料，尤其是注射劑生產(chǎn)企業(yè)使用的注射用水，會(huì)通過(guò)注射直接進(jìn)入人體，直接影響患者的安全[1]。制藥用水的制備、儲(chǔ)存和分配系統(tǒng)是藥品生產(chǎn)的關(guān)鍵系統(tǒng)，《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》(GMP)規(guī)定藥品生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)根據(jù)監(jiān)控計(jì)劃對(duì)制藥用水的微生物負(fù)載等指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并通過(guò)年度質(zhì)量回顧工作分析制藥用水是否持續(xù)處于穩(wěn)定、受控狀態(tài)。隨著新版GMP 的實(shí)施，各制藥企業(yè)開(kāi)始關(guān)注制藥用水系統(tǒng)的風(fēng)險(xiǎn)控制，尤其是水中微生物的控制。因?yàn)樗到y(tǒng)中的微生物可浮游或黏附于管道和儲(chǔ)罐的內(nèi)壁等部位，并能大量繁殖形成生物膜，可以持續(xù)釋放微生物從而形成持久的污染源，同時(shí)生物膜也是形成內(nèi)毒素的主要原因[2]。
微生物檢測(cè)是評(píng)價(jià)制藥用水是否合格的重要指標(biāo)，微生物指標(biāo)的檢測(cè)與控制是一項(xiàng)必要而復(fù)雜的工作[3-4]。尤其針對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)無(wú)菌藥品生產(chǎn)企業(yè)，通過(guò)對(duì)制藥用水系統(tǒng)的微生物進(jìn)行系統(tǒng)科學(xué)的收集和分析，采用合適的鑒定手段對(duì)制藥用水正常狀態(tài)下微生物進(jìn)行調(diào)研，可以幫助生產(chǎn)企業(yè)更好地對(duì)日常制藥用水系統(tǒng)運(yùn)行及消殺情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，也可以進(jìn)一步指導(dǎo)制藥用水系統(tǒng)的滅菌、消毒和清潔[5-6]。建立的制藥用水系統(tǒng)微生物菌庫(kù)也可為基于微生物和藥品特性分析風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)收集的藥品生產(chǎn)環(huán)境菌庫(kù)奠定數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，幫助藥品中污染微生物進(jìn)行溯源調(diào)查。
1、材料
1.1儀器
ME2002E 電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；MLS-3781-PC 高壓蒸汽滅菌器(日本三洋公司)；生物安全柜(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；SF450滅菌箱、IF450 恒溫培養(yǎng)箱、ICP55 低溫培養(yǎng)箱均來(lái)自德國(guó)Memmert；HTY-2000B 型集菌儀、FC502 一次性使用集菌培養(yǎng)器均來(lái)自杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司；ABI3730-XL 測(cè)序儀(美國(guó)ABI 公司)。
1.2培養(yǎng)基
胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA ， 批號(hào)：1064583)、R2A 瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：1061327)均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供；以上培養(yǎng)基適用性檢查均符合中國(guó)藥典2015 年版規(guī)定[7]。
2、方法與結(jié)果
2.1制藥用水系統(tǒng)微生物的收集
本研究連續(xù)4 個(gè)季度對(duì)某大容量注射劑無(wú)菌藥品生產(chǎn)企業(yè)純化水的各分配系統(tǒng)總供水點(diǎn)、回水點(diǎn)、使用點(diǎn)和注射用水系統(tǒng)供水點(diǎn)、各車(chē)間回水點(diǎn)及使用點(diǎn)進(jìn)行取樣，按照中國(guó)藥典2015 年版純化水標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行微生物限度檢查。純化水的各分配系統(tǒng)總供水點(diǎn)、回水點(diǎn)每天取樣檢測(cè)，各使用點(diǎn)每月取樣檢測(cè)；注射用水系統(tǒng)供水點(diǎn)、各車(chē)間回水點(diǎn)每天取樣檢測(cè)，各使用點(diǎn)每月取樣檢測(cè)。
2.2制藥用水系統(tǒng)微生物的分離和保存
一共收集獲得1 499 株細(xì)菌和20 株真菌，對(duì)收集的微生物進(jìn)行復(fù)蘇分離純化，復(fù)蘇培養(yǎng)基采用TSA 和R2A 瓊脂培養(yǎng)基，采用磁珠保存管置−70 ℃冰箱保存。部分無(wú)法復(fù)蘇的菌株采用直接單個(gè)純菌落鑒定。
2.3細(xì)菌16S rDNA 全長(zhǎng)測(cè)序及真菌ITS rDNA 測(cè)序鑒定
對(duì)制藥用水系統(tǒng)收集獲得的1 499 株細(xì)菌及20 株真菌分別采用測(cè)序儀進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA 和真菌ITS rDNA 測(cè)序鑒定。本研究比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)包含NCBI-Fungi 和NCBI-Bacteria(同源性>98.65%判定為同一種微生物[8])。
2.4制藥用水系統(tǒng)微生物污染分析
本次通過(guò)4 個(gè)季度連續(xù)收集到制藥用水系統(tǒng)微生物菌株共計(jì)1 519 株，包括1 499 株細(xì)菌和20株真菌。其中132 株細(xì)菌來(lái)源于注射用水系統(tǒng)，1 367 株細(xì)菌來(lái)源于純化水系統(tǒng)；4 株真菌來(lái)源于注射用水系統(tǒng)，16 株真菌來(lái)源于純化水系統(tǒng)。來(lái)源于注射用水系統(tǒng)的微生物占比9.0%，來(lái)源于純化水系統(tǒng)的微生物占比91.0%。整個(gè)制藥用水系統(tǒng)細(xì)菌占比98.7%，真菌占比1.3%。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 菌株數(shù)統(tǒng)計(jì)
2.5隨季節(jié)微生物污染變化
純化水系統(tǒng)的微生物在第二季度和第三季度數(shù)量占比較多，占全年微生物總量67.8%，第一季度和第四季度微生物數(shù)量則下降；注射用水系統(tǒng)微生物數(shù)量則在第二季度較多，其余三個(gè)季節(jié)數(shù)量都差不多。結(jié)果見(jiàn)表1。這可能和溫度、濕度等季節(jié)性因素存在關(guān)聯(lián)。也有報(bào)道顯示，在豐水期制藥用水系統(tǒng)管路內(nèi)檢出革蘭氏陰性菌比例上升，提示在這些時(shí)期需注意水系統(tǒng)管路等清潔消毒是否到位。
2.6制藥用水系統(tǒng)微生物菌庫(kù)的建立和分析
從制藥用水系統(tǒng)收集的1 519 株微生物的測(cè)序鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2。純化水系統(tǒng)中鞘氨醇單胞菌和甲基桿菌最多，分別占全部分離菌的28.9%和25.2%；其次為微球菌、短桿菌和叢毛單胞菌，分別占全部收集菌的12.8%，8.0%和7.8%。注射用水系統(tǒng)中葡萄球菌和微球菌較多，分別占全部收集菌的24.9%和18.2%；其次為芽孢桿菌和甲基桿菌，分別占全部分離菌的10.3%和8.8%。本研究通過(guò)對(duì)4 個(gè)季度收集的制藥用水微生物的測(cè)序鑒定結(jié)果進(jìn)行整理和分析，初步建立了制藥用水微生物菌庫(kù)。
表2 制藥用水系統(tǒng)微生物鑒定結(jié)果
對(duì)微生物鑒定結(jié)果分析總結(jié)見(jiàn)表3，純化水系統(tǒng)中污染的微生物主要為革蘭氏陰性菌，占污染微生物總數(shù)的67.0%，其中也有芽孢桿菌污染(占比2.0%)。注射用水系統(tǒng)中污染的微生物主要為革蘭氏陽(yáng)性菌，占污染微生物總數(shù)的60.3%，其中芽孢桿菌污染占比10.3%。
表3 制藥用水系統(tǒng)微生物污染結(jié)果
本研究從制藥用水系統(tǒng)中一共收集到20 株真菌，污染真菌種群的多樣性分析見(jiàn)圖1。青霉菌是制藥用水系統(tǒng)中主要污染真菌，占比50%，其中最常見(jiàn)的為產(chǎn)黃青霉。其次為雜色曲霉菌，占比20%。注射用水系統(tǒng)中污染的真菌為團(tuán)青霉和白腐菌。
圖1 制藥用水系統(tǒng)污染真菌種群多樣性分析
3、討論
從建立的制藥用水微生物菌庫(kù)各方面的對(duì)比情況分析可知，制藥用水系統(tǒng)中微生物占比絕大多數(shù)為革蘭氏陰性菌，占比64.2%。其中收集到假單胞菌55 株，假單胞菌屬的微生物容易形成生物膜，易造成水系統(tǒng)的微生物負(fù)載超標(biāo)，對(duì)產(chǎn)品和患者安全帶來(lái)影響，因此需要在水系統(tǒng)中嚴(yán)格控制，可采用熱消毒方式(通常80 ℃)對(duì)這類(lèi)熱敏感微生物進(jìn)行殺滅。芽孢類(lèi)微生物占比3%，目前國(guó)際上也將芽孢類(lèi)微生物列為產(chǎn)品中不可接受微生物，因此制藥用水系統(tǒng)中如果出現(xiàn)這類(lèi)較難消殺的微生物[9]，也需要引起重視。在制藥用水系統(tǒng)中較為常見(jiàn)的真菌為雜色曲霉菌和產(chǎn)黃青霉。從FDA 的Bad Bud Book 致病菌參考手冊(cè)可知，曲霉菌屬和青霉菌屬均屬于不可接受微生物范疇，F(xiàn)DA 也曾經(jīng)因?yàn)楫a(chǎn)品中出現(xiàn)這兩大類(lèi)微生物把產(chǎn)品進(jìn)行召回，因此針對(duì)水系統(tǒng)出現(xiàn)的這2 類(lèi)霉菌，需要制定有效的消毒殺菌手段，防止這類(lèi)微生物形成生物膜，造成更大的危害。
本次研究收集的注射用水系統(tǒng)污染的微生物主要為革蘭氏陽(yáng)性菌，可能革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁較厚耐熱性好，比革蘭氏陰性菌更能耐受注射用水系統(tǒng)溫度(70~80 ℃)。而純化水系統(tǒng)污染的微生物主要為革蘭氏陰性菌，因此可根據(jù)純化水系統(tǒng)和注射用水系統(tǒng)微生物種類(lèi)的不同，采取有針對(duì)性的控制微生物手段。注射用水系統(tǒng)出現(xiàn)的革蘭氏陽(yáng)性菌主要考慮少量來(lái)源于純化水系統(tǒng)，更多可能是外部環(huán)境帶來(lái)的污染，因此企業(yè)需要重點(diǎn)考察外部環(huán)境對(duì)注射用水系統(tǒng)的影響，確保注射用水系統(tǒng)的清潔干凈(包括各個(gè)取樣點(diǎn)、使用點(diǎn))，同時(shí)應(yīng)對(duì)注射用水系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)檢查，重點(diǎn)檢查維護(hù)是否到位、是否存在可能與外部相通的位置。
本研究通過(guò)4個(gè)季度的持續(xù)采樣收集制藥用水微生物，初步建立了高風(fēng)險(xiǎn)藥品生產(chǎn)企業(yè)制藥用水系統(tǒng)的微生物菌庫(kù)，但是環(huán)境微生物庫(kù)的建立是個(gè)持續(xù)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，因此需要在日常監(jiān)測(cè)中不斷完善[9]。制藥用水系統(tǒng)微生物菌庫(kù)的建立，可幫助生產(chǎn)企業(yè)更好地評(píng)價(jià)日常水系統(tǒng)運(yùn)行情況及消殺效果，并根據(jù)菌群建立不同的消殺方案，同時(shí)也為高風(fēng)險(xiǎn)藥品生產(chǎn)企業(yè)的微生物污染事件提供溯源調(diào)查基礎(chǔ)。
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