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近日，中檢院發(fā)布《28天重復(fù)劑量吸入毒性試驗（征求意見稿）》、《90天重復(fù)劑量吸入毒性試驗（征求意見稿）及起草說明》、《擴展一代生殖發(fā)育毒性試驗（征求意見稿）》、《兩代生殖發(fā)育毒性試驗（征求意見稿）》、《皮膚吸收體內(nèi)試驗方法（征求意見稿）》、《急性吸入毒性試驗 急性毒性分級法（征求意見稿）》、《體外皮膚變態(tài)反應(yīng) U937細(xì)胞激活試驗（征求意見稿）》及《化妝品禁用原料目錄增補表》。內(nèi)容如下：

 

28天重復(fù)劑量吸入毒性試驗

 28-Day Inhalation Toxicity Study

（征求意見稿）

 

1、范圍

本規(guī)范規(guī)定了嚙齒類動物28天重復(fù)劑量吸入毒性試驗的基本原則、要求和方法。

本規(guī)范適用于化妝品原料的28天重復(fù)劑量吸入毒性的評價。

 

2、試驗?zāi)康?/span>

對于有短期反復(fù)吸入暴露可能的化妝品原料，需進(jìn)行28天重復(fù)劑量吸入毒性試驗。通過該試驗不僅可獲得一定時期內(nèi)反復(fù)吸入受試物后引起的健康效應(yīng)、受試物作用靶器官和受試物體內(nèi)蓄積能力資料，并可估計吸入的無有害作用水平，后者可用于人群吸入的定量風(fēng)險評估。

 

3、術(shù)語與定義

3.1  28天重復(fù)劑量吸入毒性

是指在有限時間（28天）內(nèi)，每日反復(fù)通過吸入途徑接觸受試物后所引起的不良反應(yīng)。

3.2  氣溶膠aerosol

懸浮在空氣中具有可以忽略下降速度/沉降速度的固態(tài)、液態(tài)或固液態(tài)混合顆粒狀物質(zhì)。

3.3  空氣動力學(xué)直徑aeodynamic equivalent diameter(AD)

氣溶膠顆粒與不同直徑標(biāo)準(zhǔn)單位密度（1.0 g/cm3）球形顆粒中某一顆粒的終端沉降速度相同時，該標(biāo)準(zhǔn)球形顆粒的直徑即為空氣動力學(xué)直徑。其計量單位為μm。

3.4  空氣動力學(xué)質(zhì)量中位數(shù)直徑mass median aerodynamic diameter(MMAD)

氣溶膠中小于和等于某一空氣動力學(xué)直徑的顆?？傎|(zhì)量，占全部顆粒物質(zhì)量50%時，該直徑即為空氣動力學(xué)質(zhì)量中位數(shù)直徑。

3.5  幾何標(biāo)準(zhǔn)差geometric standard deviation(GSD)

用以描述氣溶膠顆粒大小的分布狀態(tài)。以撞擊器各級累積百分比為Y軸、粒徑為X軸擬合對數(shù)概率曲線，以累積百分比84.1%對應(yīng)的粒徑除以累積百分比50%的粒徑，即為幾何標(biāo)準(zhǔn)差。

3.6  理論濃度nominal concentration

制備氣溶膠消耗受試物的量除以通過暴露系統(tǒng)的空氣總體積。

3.7  實際濃度analytical concentration

暴露系統(tǒng)中動物呼吸區(qū)經(jīng)采樣分析獲得的氣溶膠濃度。

3.8  口鼻暴露nose-only

即僅頭部、鼻部、鼻口部暴露的暴露模式，試驗過程中將動物置于相應(yīng)固定器內(nèi)進(jìn)行吸入暴露。

3.9  全身暴露whole-body

將動物置于封閉的染毒柜或腔體內(nèi)進(jìn)行吸入暴露的暴露模式。

 

4、試驗的基本原則

以不同劑量受試物每日吸入給予各組實驗動物，連續(xù)染毒28天，每組采用一個吸入劑量染毒。染毒期間每日觀察動物的毒性反應(yīng)。在染毒期間死亡的動物要進(jìn)行稱重和尸檢。染毒結(jié)束后，處死存活動物，進(jìn)行尸檢、臨床檢查、支氣管肺泡灌洗檢查以及適當(dāng)?shù)牟±斫M織學(xué)檢查，以評估受試物產(chǎn)生的吸入毒性作用。

 

5、試驗方法

5.1  受試物

受試物可分為氣態(tài)受試物、沸點較低易揮發(fā)的液態(tài)受試物、高沸點不易揮發(fā)液態(tài)受試物、粉狀或固體受試物。試驗時將受試物制備成何種物態(tài)（氣溶膠、粉塵）取決于受試物的理化性質(zhì)、設(shè)定的濃度和/或按照實際加工使用期間的物理狀態(tài)等。吸濕性的及會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的受試物，在試驗中需保證所用空氣干燥，某些受試物經(jīng)超聲霧化時會產(chǎn)熱，應(yīng)注意選擇適合的發(fā)生裝置。

5.2  實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境

5.2.1  動物種系的選擇

常規(guī)選擇嚙齒類動物，首選大鼠。一般選用7周～9周齡的成年大鼠。每個性別動物體重的變動范圍不應(yīng)超出動物平均體重的20%。實驗動物應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。

5.2.2  動物的性別和數(shù)量

每一劑量組及陰性（溶媒）對照組實驗動物至少應(yīng)有10只（雌雄各半）?？闪碓O(shè)追蹤觀察組，給予最高劑量受試物或陰性（溶媒）對照品，每組至少10只動物（雌雄各半）。

考慮到重復(fù)劑量吸入毒性試驗的重要性，應(yīng)適當(dāng)增加每組動物數(shù)。若計劃在試驗過程中處死動物觀察毒性反應(yīng)，應(yīng)增加計劃處死的動物數(shù)。若考慮在試驗期間增加影響動物健康的試驗操作（如毒代動力學(xué)研究），則應(yīng)另設(shè)衛(wèi)星組，增加相應(yīng)動物數(shù)僅用于滿足這部分的研究需要，并不進(jìn)行毒理學(xué)評價。試驗結(jié)束時的動物數(shù)需達(dá)到能夠有效評價受試物毒性作用的數(shù)量。追蹤觀察組動物在全程染毒結(jié)束后繼續(xù)觀察一段時間（一般不少于14天），以了解毒性作用的持續(xù)性、可逆性或遲發(fā)毒作用。

5.2.3  試驗前動物準(zhǔn)備

染毒開始前至少要有5天時間使實驗動物適應(yīng)實驗室飼養(yǎng)環(huán)境。如動物擬采用口鼻暴露方式染毒，動物還需提前適應(yīng)口鼻暴露時所用的固定器。

5.2.4  飼養(yǎng)環(huán)境

實驗動物房應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定，選用標(biāo)準(zhǔn)配合飼料。實驗飼養(yǎng)室內(nèi)溫度應(yīng)控制在20℃～25℃，相對濕度在應(yīng)控制在40%～70%范圍內(nèi)。采用人工照明，每12h明暗交替。試驗期間，動物常規(guī)進(jìn)食，自由飲水。當(dāng)動物吸入染毒時間超過6h，則需在染毒期間以適合方式給動物喂食，并提供飲水。當(dāng)動物采用全身暴露方式染毒時，每只動物在暴露期間應(yīng)處在獨立的空間，以防止動物聚集趴臥，其被毛吸附受試物氣溶膠，影響動物吸入受試物的量。

5.3  分組

試驗通常包括三個暴露水平的受試物和一個陰性/溶媒對照。陰性/溶媒對照組動物暴露于潔凈空氣或溶媒，溶媒應(yīng)盡可能采用水，采用其他溶媒進(jìn)行試驗時，應(yīng)根據(jù)文獻(xiàn)報道或預(yù)試驗確認(rèn)所采用溶媒無吸入毒性，否則應(yīng)同時設(shè)立陰性對照組和溶媒對照組，對照組的其他條件均與受試物組相同。最大吸入暴露水平的設(shè)計應(yīng)在引起中毒效應(yīng)的前提下又不致造成動物過多死亡，低暴露水平組應(yīng)不低于人群的實際吸入暴露水平，且不出現(xiàn)任何毒性作用，中間暴露水平組應(yīng)引起較輕的可觀察到的毒性作用。

吸入試驗中動物暴露水平通常以吸入暴露量表述，即氣溶膠發(fā)生后經(jīng)動物吸入的氣溶膠的量?？筛鶕?jù)試驗周期中測得氣溶膠濃度、每分鐘通氣量、暴露時間計算求得，公式如下：

吸入暴露量	=	氣溶膠濃度	×	每分鐘通氣量	×	暴露時間	÷	BW
(mg/kg)		(mg/L air)		(L/min)		(min)		(kg)

每分鐘通氣量(L/min) = 0.608×BW(kg)0.852

注：每分鐘通氣量可采用實際檢測動物的每分鐘通氣量計算。也可以動物平均體重代入經(jīng)驗公式得出動物理論每分鐘通氣量。BW為動物平均體重。

5.4  吸入暴露條件

5.4.1  吸入暴露方式

首選的暴露方式為口鼻暴露，為滿足特定的研究目的（如便于染毒中觀察動物反應(yīng)），也可采用全身暴露方式染毒，但應(yīng)在試驗報告中予以闡釋說明。

采用口鼻暴露方式染毒時，所選用的固定器應(yīng)不對動物產(chǎn)生額外的應(yīng)激，應(yīng)注意與動物體重大小匹配，并確保動物在暴露過程中無法避開吸入染毒氣流。吸入裝置應(yīng)配備動態(tài)氣流，其通風(fēng)量至少應(yīng)超過裝置里動物總換氣量的兩倍，氧含量應(yīng)不低于19%，并保證每只動物暴露條件穩(wěn)定均一。如果進(jìn)入暴露系統(tǒng)的空氣體積小于流出體積時，應(yīng)防止空氣經(jīng)其他途徑進(jìn)入暴露系統(tǒng)使受試物氣溶膠稀釋。染毒過程中應(yīng)使裝置內(nèi)保持輕度負(fù)壓，防止受試物泄露到外部環(huán)境中。

采用全身暴露方式染毒時，吸入裝置需配備動態(tài)氣流，每小時換氣約12次～15次，應(yīng)保證染毒柜內(nèi)氧含量不低于19%，染毒柜內(nèi)應(yīng)密閉，以防止受試物泄露到外部環(huán)境中。為保證受試物氣溶膠均勻分散，實驗動物所占的總體積應(yīng)不超過染毒柜體積的5%。

5.4.2  吸入暴露濃度

吸入染毒途徑不同于其它染毒途徑，其暴露水平主要通過調(diào)整氣溶膠濃度，保持相同的吸入暴露時間來實現(xiàn)。也可調(diào)整吸入暴露時間，保持氣溶膠濃度不變來實現(xiàn)（如采用此種方式，需排除暴露時間不一致對動物的影響）。

最大吸入濃度設(shè)計應(yīng)考慮：①受試物可達(dá)到的最大濃度；②人體可能的最大暴露水平；③維持充足的氧氣供應(yīng)的需要；④動物福利。在缺乏限值數(shù)據(jù)支持的情況下，氣溶膠最大濃度可為5 mg/L，蒸氣的最大濃度可為20 mg/L，氣體最大濃度可為20000 ppm。

5.4.3  吸入染毒頻率

染毒期間，動物每日吸入染毒1次，每周吸入染毒7天。

5.4.4  吸入染毒時間

原則上，各組動物吸入染毒時間應(yīng)一致，當(dāng)采用調(diào)整吸入染毒時間來區(qū)分各組暴露水平時，各組吸入染毒時間相差不應(yīng)太長，否則需要考察染毒時間不一致對動物的影響。采用口鼻暴露方式時，大鼠的吸入染毒時間應(yīng)不超過6h，小鼠的吸入染毒時間應(yīng)不超過4h。采用全身暴露方式時，動物的染毒時間應(yīng)不少于6h，最長不超過22h。如確需超過上述時間限制，應(yīng)在試驗報告中予以闡釋說明。

5.5  暴露條件的監(jiān)測

5.5.1  濃度監(jiān)測

試驗期間為保證實際濃度的穩(wěn)定性，可以使用實時監(jiān)測設(shè)備（如氣溶膠光度計），或定期通過特異性的方法（如采用撞擊器吸附或化學(xué)反應(yīng)的原理直接采樣，然后進(jìn)行化學(xué)分析），或非特異性的方法如濾膜采樣法來測定呼吸區(qū)或染毒柜內(nèi)氣溶膠濃度，以證明暴露條件的穩(wěn)定性。濃度波動范圍規(guī)定：氣體或揮發(fā)性受試物不得超過平均濃度±10%；液體或固體氣溶膠不得超過平均值的±20%。

5.5.2  粒徑監(jiān)測

氣溶膠顆粒的空氣動力學(xué)粒徑?jīng)Q定了在重力作用下顆粒在呼吸道中的沉降情況；氣溶膠顆粒空氣動力學(xué)直徑的幾何標(biāo)準(zhǔn)差（GSD）代表氣溶膠粒度分布范圍，其值越大代表粒子分布較廣。為了使動物整個呼吸道充分暴露于受試物中，推薦的氣溶膠顆?？諝鈩恿W(xué)中值直徑（MMAD）數(shù)值應(yīng)介于1μm～3μm，GSD通常應(yīng)介于1.5～3之間。可采用基于質(zhì)量檢測的碰撞法，基于激光飛行法的光學(xué)方法或其它替代方法定期對呼吸區(qū)或染毒柜中的氣溶膠粒徑進(jìn)行測定，并計算GSD值。如在整個試驗周期中采用替代方法進(jìn)行粒徑分析時，需驗證替代方法所得結(jié)果與碰撞法一致。

5.5.3  暴露裝置內(nèi)氣流

通過染毒柜或口鼻暴露系統(tǒng)的氣流速率需嚴(yán)格控制，應(yīng)在每次暴露期間盡可能連續(xù)監(jiān)測并每小時記錄1次。

5.5.4  暴露系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境監(jiān)測

暴露系統(tǒng)內(nèi)溫度維持在22℃±3℃，口鼻暴露和全身暴露系統(tǒng)都需監(jiān)測記錄動物呼吸區(qū)的相對濕度，應(yīng)在每次暴露期間盡可能連續(xù)監(jiān)測并每小時記錄1次。理想的相對濕度一般在30%~70%，但在某些情況下，可能無法達(dá)到（例如在測試水溶液型受試物時），應(yīng)在試驗報告中予以闡釋說明。氧氣的濃度不低于19%，二氧化碳的濃度不超過1%。

5.6  臨床觀察

染毒期間應(yīng)每天觀察，染毒結(jié)束后，追蹤觀察組還應(yīng)繼續(xù)觀察至追蹤觀察期結(jié)束。對動物的任何毒性表現(xiàn)均應(yīng)記錄，記錄內(nèi)容包括發(fā)生時間、程度和持續(xù)時間。觀察應(yīng)至少包括如下內(nèi)容：皮膚和被毛的改變、眼和粘膜變化、呼吸、循環(huán)、植物神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肢體運動和行為活動等改變。應(yīng)在首次染毒前記錄動物體重，此后每周記錄動物體重變化。應(yīng)測定每周飼料消耗量。

5.7  臨床檢查

5.7.1  眼科檢查

在動物染毒前和染毒后，應(yīng)對所有實驗動物，使用眼科鏡或其他有關(guān)設(shè)備進(jìn)行眼科檢查。

5.7.2  血液檢查

在染毒結(jié)束及追蹤觀察結(jié)束時應(yīng)測定血球容積、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞總數(shù)和分類，必要時測定凝血功能如凝血時間、凝血酶原時間、凝血激酶時間或血小板數(shù)等指標(biāo)。

5.7.3  臨床血液生化檢查

在染毒結(jié)束及追蹤觀察結(jié)束時進(jìn)行，檢查指標(biāo)包括電解質(zhì)平衡、碳水化合物代謝、肝、腎功能?？筛鶕?jù)受試物作用形式選擇其他特殊檢查。推薦的指標(biāo)包括：氯、鈉、鉀、禁食血糖（不同動物品系采用不同的禁食期）、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、尿素氮、白蛋白、血液肌酐、總膽紅素及總血清蛋白。必要時可進(jìn)行脂肪、激素、酸堿平衡、正鐵血紅蛋白、膽堿酯酶活性的分析測定。此外，還可根據(jù)所觀察到的毒性作用進(jìn)行其他更大范圍的臨床生化檢查，以便進(jìn)行全面的毒性評價。

5.7.4  尿液檢查

一般不需要進(jìn)行，只有當(dāng)懷疑存在或觀察到相關(guān)毒性作用時方需進(jìn)行尿液檢查。

5.7.5  支氣管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage, BAL）檢查

解剖動物取肺臟，整肺稱重后結(jié)扎左肺用于組織病理學(xué)檢查，右肺進(jìn)行BAL檢查，分析BAL液的白細(xì)胞計數(shù)和分類、總蛋白、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶以及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子/趨化因子等參數(shù)。BAL液分析通常作為組織病理學(xué)檢查的結(jié)果的補充，但不能替代組織病理學(xué)檢查。

5.7.6  其他檢查指標(biāo)

可根據(jù)研究需要，增加額外的檢測指標(biāo)，如肺功能，行為學(xué)分析等。

5.8  病理檢查

5.8.1  大體尸檢

所有動物均應(yīng)進(jìn)行全面的大體尸檢，內(nèi)容包括動物的外觀、所有孔道，胸腔、腹腔及其內(nèi)容物。肺、肝、腎、腎上腺、睪丸、附睪、子宮、卵巢、胸腺、脾、腦和心臟應(yīng)在分離后盡快稱重以防水分丟失。應(yīng)將下列組織和器官保存在固定液中，以備日后進(jìn)行病理組織學(xué)檢查：所有大體解剖呈現(xiàn)異常的器官、腦（包括延髓/腦橋、小腦和大腦皮層、腦垂體）、甲狀腺/甲狀旁腺、胸腺、左肺/氣管、喉、鼻咽組織、心臟、主動脈、唾液腺、肝、脾、腎、腎上腺、胰、性腺、子宮、生殖附屬器官*、皮膚*、食管、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸、膀胱、前列腺、有代表性的淋巴結(jié)、雌性乳腺*、大腿肌肉*、周圍神經(jīng)、胸骨（包括骨髓）、眼及視神經(jīng)、股骨（包括關(guān)節(jié)面）*、脊髓（包括頸部、胸部、腰部）*和淚腺*。

*只有當(dāng)毒性作用提示或作為被研究的靶器官時才需要檢查這些器官。

5.8.2  病理組織學(xué)檢查

應(yīng)對下述器官和組織進(jìn)行檢查：

（1）所有最高劑量組和對照組動物的重要的和可能受到損傷的器官或組織，如高劑量組動物的器官或組織有病理組織學(xué)的病變，則應(yīng)擴展至其他劑量組的相應(yīng)的器官和組織。

（2）各劑量組大體解剖見有異常的器官或組織。

（3）其他劑量組動物的靶器官。

（4）在追蹤觀察組，應(yīng)對那些在染毒組呈現(xiàn)毒性作用的組織和器官進(jìn)行檢查。

 

6、試驗結(jié)果的評價

6.1  數(shù)據(jù)處理

可通過表格形式總結(jié)試驗結(jié)果，顯示試驗開始時各組動物數(shù)、出現(xiàn)損傷的動物數(shù)、損傷的類型和每種損傷的動物百分比。對所有數(shù)據(jù)應(yīng)采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行評價，統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)在試驗設(shè)計時確定。

6.2  結(jié)果評價

28天重復(fù)劑量吸入毒性試驗結(jié)果應(yīng)結(jié)合前期試驗結(jié)果，并考慮到毒性效應(yīng)指標(biāo)和尸檢及病理組織學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行綜合評價。毒性評價應(yīng)包括受試物吸入暴露劑量與是否出現(xiàn)毒性反應(yīng)、毒性反應(yīng)的發(fā)生率及其程度之間的關(guān)系。這些反應(yīng)包括行為或臨床異常、肉眼可見的損傷、靶器官、體重變化情況、死亡效應(yīng)以及其他一般或特殊的毒性作用。在綜合分析的基礎(chǔ)上得出重復(fù)劑量吸入毒性的LOAEL和（或）NOAEL，為人群吸入的定量風(fēng)險評估提供依據(jù)。

 

7、試驗結(jié)果的解釋

28天重復(fù)劑量吸入毒性試驗?zāi)軌蛱峁┦茉囄锒唐诮?jīng)呼吸系統(tǒng)反復(fù)吸入接觸引起的毒性作用資料，也可為90天重復(fù)劑量吸入毒性試驗中受試物的劑量選擇提供依據(jù)。其試驗結(jié)果可在有限的程度上外推到人，但它可為確定人群的允許接觸水平提供有用的信息。

 

28天重復(fù)劑量吸入毒性試驗

起草說明

為加強化妝品的監(jiān)督管理，進(jìn)一步提高化妝品使用安全性，中國食品藥品檢定研究院組織開展了28天重復(fù)劑量吸入毒性試驗方法的研究制定工作?，F(xiàn)就工作有關(guān)情況說明如下：

 

一、起草原則

本方法主要參照OECD 在2018 年發(fā)布的“化學(xué)品檢測指南——28天（亞急性）吸入毒性研究”（TG412）編制。寫作結(jié)構(gòu)框架按現(xiàn)行《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行調(diào)整。本標(biāo)準(zhǔn)制定在充分考慮動物福利的前提下，本著科學(xué)性、合理性、規(guī)范性的指導(dǎo)原則，對某些內(nèi)容及吸入相關(guān)特征指標(biāo)進(jìn)行具體化和明確化，同時也盡可能提供多種吸入條件監(jiān)測方法，突出體現(xiàn)適用性與可操作性。

 

二、起草過程

本研究于2021年11月由化妝品標(biāo)準(zhǔn)專家委員會立項；在研究和分析國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，起草了本標(biāo)準(zhǔn)文本及編制說明，形成方法草案。

2023年5月本標(biāo)準(zhǔn)草案通過結(jié)題專家論證，形成如下意見及結(jié)論：按28天重復(fù)劑量吸入毒性試驗和90天重復(fù)劑量吸入毒性試驗分別提交方法文本和起草說明，規(guī)范方法文本，修改后通過。修改后對外征求意見，根據(jù)反饋情況對文本進(jìn)行修改。

 

三、與我國已有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系

我國現(xiàn)已發(fā)布國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21754-2008《化學(xué)品28天/14天重復(fù)劑量吸入毒性試驗方法》和GB/T 15670.12-2017《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗方法第12部分：短期重復(fù)吸入染毒（28天）毒性試驗》。本方法在參考上述我國已有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，主要針對化妝品原料的特點，以現(xiàn)行《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中亞慢性經(jīng)口毒性試驗和亞慢性經(jīng)皮毒性試驗的寫作框架為模板，本著化妝品原料檢測適用性及可操作性的原則進(jìn)行編制。

 

四、與國際同類標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系

本方法以O(shè)ECD 2018年發(fā)布“化學(xué)品檢測指南——28天（亞急性）吸入毒性研究”（OECD GUIDELINES ON THE TESTING OF CHEMICALS: 28-Day (Subacute) Inhalation Toxicity Study）為依據(jù)進(jìn)行撰寫，結(jié)合國內(nèi)實驗條件及操作的具體情況，撰寫的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容基本涵蓋了實驗對象、實驗操作和結(jié)果分析的技術(shù)要求，重點突出了對的吸入暴露參數(shù)的規(guī)定和確認(rèn)。

 

五、與《規(guī)范》中原方法的對比情況

現(xiàn)行《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中尚無28天重復(fù)劑量吸入毒性試驗的相關(guān)內(nèi)容，但有亞慢性經(jīng)口毒性試驗和亞慢性經(jīng)皮毒性試驗的相關(guān)內(nèi)容，本標(biāo)準(zhǔn)以上述試驗方法的寫作框架為模板，重點增加了對吸入相關(guān)特征指標(biāo)規(guī)定。

 

90天重復(fù)劑量吸入毒性試驗

 90-Day Inhalation Toxicity Study

（征求意見稿）

 

1、范圍

本規(guī)范規(guī)定了嚙齒類動物90天重復(fù)劑量吸入毒性試驗的基本原則、要求和方法。

本規(guī)范適用于化妝品原料的90天重復(fù)劑量吸入毒性的評價。

 

2、試驗?zāi)康?/span>

對于有長期反復(fù)吸入暴露可能的化妝品原料，需進(jìn)行90天重復(fù)劑量吸入毒性試驗。通過該試驗不僅可獲得一定時期內(nèi)反復(fù)吸入受試物后引起的健康效應(yīng)、受試物作用靶器官和受試物體內(nèi)蓄積能力資料，并可估計吸入的無有害作用水平，后者可用于人群吸入的定量風(fēng)險評估。

 

3、術(shù)語與定義

3.1  90天重復(fù)劑量吸入毒性

是指在實驗動物部分生存期內(nèi)，每日反復(fù)通過吸入途徑接觸受試物后所引起的不良反應(yīng)。

3.2  氣溶膠aerosol

懸浮在空氣中具有可以忽略下降速度/沉降速度的固態(tài)、液態(tài)或固液態(tài)混合顆粒狀物質(zhì)。

3.3  空氣動力學(xué)直徑aeodynamic equivalent diameter(AD)

氣溶膠顆粒與不同直徑標(biāo)準(zhǔn)單位密度（1.0 g/cm3）球形顆粒中某一顆粒的終端沉降速度相同時，該標(biāo)準(zhǔn)球形顆粒的直徑即為空氣動力學(xué)直徑。其計量單位為μm。

3.4  空氣動力學(xué)質(zhì)量中位數(shù)直徑mass median aerodynamic diameter(MMAD)

氣溶膠中小于和等于某一空氣動力學(xué)直徑的顆?？傎|(zhì)量，占全部顆粒物質(zhì)量50%時，該直徑即為空氣動力學(xué)質(zhì)量中位數(shù)直徑。

3.5  幾何標(biāo)準(zhǔn)差geometric standard deviation(GSD)

用以描述氣溶膠顆粒大小的分布狀態(tài)。以撞擊器各級累積百分比為Y軸、粒徑為X軸擬合對數(shù)概率曲線，以累積百分比84.1%對應(yīng)的粒徑除以累積百分比50%的粒徑，即為幾何標(biāo)準(zhǔn)差。

3.6  理論濃度nominal concentration

制備氣溶膠消耗受試物的量除以通過暴露系統(tǒng)的空氣總體積。

3.7  實際濃度analytical concentration

暴露系統(tǒng)中動物呼吸區(qū)經(jīng)采樣分析獲得的氣溶膠濃度。

3.8  口鼻暴露nose-only

即僅頭部、鼻部、鼻口部暴露的暴露模式，試驗過程中將動物置于相應(yīng)固定器內(nèi)進(jìn)行吸入暴露。

3.9  全身暴露whole-body

將動物置于封閉的染毒柜或腔體內(nèi)進(jìn)行吸入暴露的暴露模式。

 

4、試驗的基本原則

以不同劑量受試物每日吸入給予各組實驗動物，連續(xù)染毒90天，每組采用一個吸入劑量染毒。染毒期間每日觀察動物的毒性反應(yīng)。在染毒期間死亡的動物要進(jìn)行稱重和尸檢。染毒結(jié)束后，處死存活動物，進(jìn)行尸檢、臨床檢查、支氣管肺泡灌洗檢查以及適當(dāng)?shù)牟±斫M織學(xué)檢查，以評估受試物產(chǎn)生的吸入毒性作用。

 

5、試驗方法

5.1  受試物

受試物可分為氣態(tài)受試物、沸點較低易揮發(fā)的液態(tài)受試物、高沸點不易揮發(fā)液態(tài)受試物、粉狀或固體受試物。試驗時將受試物制備成何種物態(tài)（氣溶膠、粉塵）取決于受試物的理化性質(zhì)、設(shè)定的濃度和/或按照實際加工使用期間的物理狀態(tài)等。吸濕性的及會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的受試物，在試驗中需保證所用空氣干燥，某些受試物經(jīng)超聲霧化時會產(chǎn)熱，應(yīng)注意選擇適合的發(fā)生裝置。

5.2  實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境

5.2.1  動物種系的選擇

常規(guī)選擇嚙齒類動物，首選大鼠。一般選用7周～9周齡的成年大鼠。每個性別動物體重的變動范圍不應(yīng)超出動物平均體重的20%。實驗動物應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定。

5.2.2  動物的性別和數(shù)量

每一劑量組及陰性（溶媒）對照組實驗動物至少應(yīng)有20只（雌雄各半）?？闪碓O(shè)追蹤觀察組，給予最高劑量受試物或陰性（溶媒）對照品，每組至少10只動物（雌雄各半）。

考慮到重復(fù)劑量吸入毒性試驗的重要性，應(yīng)適當(dāng)增加每組動物數(shù)。若計劃在試驗過程中處死動物觀察毒性反應(yīng)，應(yīng)增加計劃處死的動物數(shù)。若考慮在試驗期間增加影響動物健康的試驗操作（如毒代動力學(xué)研究），則應(yīng)另設(shè)衛(wèi)星組，增加相應(yīng)動物數(shù)僅用于滿足這部分的研究需要，并不進(jìn)行毒理學(xué)評價。試驗結(jié)束時的動物數(shù)需達(dá)到能夠有效評價受試物毒性作用的數(shù)量。追蹤觀察組動物在全程染毒結(jié)束后繼續(xù)觀察一段時間（一般不少于28天），以了解毒性作用的持續(xù)性、可逆性或遲發(fā)毒作用。

5.2.3  試驗前動物準(zhǔn)備

染毒開始前至少要有5天時間使實驗動物適應(yīng)實驗室飼養(yǎng)環(huán)境。如動物擬采用口鼻暴露方式染毒，動物還需提前適應(yīng)口鼻暴露時所用的固定器。

5.2.4  飼養(yǎng)環(huán)境

實驗動物房應(yīng)符合國家相應(yīng)規(guī)定，選用標(biāo)準(zhǔn)配合飼料。實驗飼養(yǎng)室內(nèi)溫度應(yīng)控制在20℃～25℃，相對濕度在應(yīng)控制在40%～70%范圍內(nèi)。采用人工照明，每12h明暗交替。試驗期間，動物常規(guī)進(jìn)食，自由飲水。當(dāng)動物吸入染毒時間超過6h，則需在染毒期間以適合方式給動物喂食，并提供飲水。當(dāng)動物采用全身暴露方式染毒時，每只動物在暴露期間應(yīng)處在獨立的空間，以防止動物聚集趴臥，其被毛吸附受試物氣溶膠，影響動物吸入受試物的量。

5.3  分組

試驗通常包括三個暴露水平的受試物和一個陰性/溶媒對照。陰性/溶媒對照組動物暴露于潔凈空氣或溶媒，溶媒應(yīng)盡可能采用水，采用其他溶媒進(jìn)行試驗時，應(yīng)根據(jù)文獻(xiàn)報道或預(yù)試驗確認(rèn)所采用溶媒無吸入毒性，否則應(yīng)同時設(shè)立陰性對照組和溶媒對照組，對照組的其他條件均與受試物組相同。最大吸入暴露水平的設(shè)計應(yīng)在引起中毒效應(yīng)的前提下又不致造成動物過多死亡，低暴露水平組應(yīng)不低于人群的實際吸入暴露水平，且不出現(xiàn)任何毒性作用，中間暴露水平組應(yīng)引起較輕的可觀察到的毒性作用。

吸入試驗中動物暴露水平通常以吸入暴露量表述，即氣溶膠發(fā)生后經(jīng)動物吸入的氣溶膠的量?？筛鶕?jù)試驗周期中測得氣溶膠濃度、每分鐘通氣量、暴露時間計算求得，公式如下：

吸入暴露量	=	氣溶膠濃度	×	每分鐘通氣量	×	暴露時間	÷	BW
(mg/kg)		(mg/L air)		(L/min)		(min)		(kg)

每分鐘通氣量(L/min) = 0.608×BW(kg)0.852

注：每分鐘通氣量可采用實際檢測動物的每分鐘通氣量計算。也可以動物平均體重代入經(jīng)驗公式得出動物理論每分鐘通氣量。BW為動物平均體重。

5.4  吸入暴露條件

5.4.1  吸入暴露方式

首選的暴露方式為口鼻暴露，為滿足特定的研究目的（如便于染毒中觀察動物反應(yīng)），也可采用全身暴露方式染毒，但應(yīng)在試驗報告中予以闡釋說明。

采用口鼻暴露方式染毒時，所選用的固定器應(yīng)不對動物產(chǎn)生額外的應(yīng)激，應(yīng)注意與動物體重大小匹配，并確保動物在暴露過程中無法避開吸入染毒氣流。吸入裝置應(yīng)配備動態(tài)氣流，其通風(fēng)量至少應(yīng)超過裝置里動物總換氣量的兩倍，氧含量應(yīng)不低于19%，并保證每只動物暴露條件穩(wěn)定均一。如果進(jìn)入暴露系統(tǒng)的空氣體積小于流出體積時，應(yīng)防止空氣經(jīng)其他途徑進(jìn)入暴露系統(tǒng)使受試物氣溶膠稀釋。染毒過程中應(yīng)使裝置內(nèi)保持輕度負(fù)壓，防止受試物泄露到外部環(huán)境中。

采用全身暴露方式染毒時，吸入裝置需配備動態(tài)氣流，每小時換氣約12次～15次，應(yīng)保證染毒柜內(nèi)氧含量不低于19%，染毒柜內(nèi)應(yīng)密閉，以防止受試物泄露到外部環(huán)境中。為保證受試物氣溶膠均勻分散，實驗動物所占的總體積應(yīng)不超過染毒柜體積的5%。

5.4.2  吸入暴露濃度

吸入染毒途徑不同于其它染毒途徑，其暴露水平主要通過調(diào)整氣溶膠濃度，保持相同的吸入暴露時間來實現(xiàn)。也可調(diào)整吸入暴露時間，保持氣溶膠濃度不變來實現(xiàn)（如采用此種方式，需排除暴露時間不一致對動物的影響）。

最大吸入濃度設(shè)計應(yīng)考慮：①受試物可達(dá)到的最大濃度；②人體可能的最大暴露水平；③維持充足的氧氣供應(yīng)的需要；④動物福利。在缺乏限值數(shù)據(jù)支持的情況下，氣溶膠最大濃度可為5 mg/L，蒸氣的最大濃度可為20 mg/L，氣體最大濃度可為20000 ppm。

5.4.3  吸入染毒頻率

染毒期間，動物每日吸入染毒1次，每周吸入染毒7天。

5.4.4  吸入染毒時間

原則上，各組動物吸入染毒時間應(yīng)一致，當(dāng)采用調(diào)整吸入染毒時間來區(qū)分各組暴露水平時，各組吸入染毒時間相差不應(yīng)太長，否則需要考察染毒時間不一致對動物的影響。采用口鼻暴露方式時，大鼠的吸入染毒時間應(yīng)不超過6h，小鼠的吸入染毒時間應(yīng)不超過4h。采用全身暴露方式時，動物的染毒時間應(yīng)不少于6h，最長不超過22h。如確需超過上述時間限制，應(yīng)在試驗報告中予以闡釋說明。

5.5  暴露條件的監(jiān)測

5.5.1  濃度監(jiān)測

試驗期間為保證實際濃度的穩(wěn)定性，可以使用實時監(jiān)測設(shè)備（如氣溶膠光度計），或定期通過特異性的方法（如采用撞擊器吸附或化學(xué)反應(yīng)的原理直接采樣，然后進(jìn)行化學(xué)分析），或非特異性的方法如濾膜采樣法來測定呼吸區(qū)或染毒柜內(nèi)氣溶膠濃度，以證明暴露條件的穩(wěn)定性。濃度波動范圍規(guī)定：氣體或揮發(fā)性受試物不得超過平均濃度±10%；液體或固體氣溶膠不得超過平均值的±20%。

5.5.2  粒徑監(jiān)測

氣溶膠顆粒的空氣動力學(xué)粒徑?jīng)Q定了在重力作用下顆粒在呼吸道中的沉降情況；氣溶膠顆?？諝鈩恿W(xué)直徑的幾何標(biāo)準(zhǔn)差（GSD）代表氣溶膠粒度分布范圍，其值越大代表粒子分布較廣。為了使動物整個呼吸道充分暴露于受試物中，推薦的氣溶膠顆?？諝鈩恿W(xué)中值直徑（MMAD）數(shù)值應(yīng)介于1μm～3μm，GSD通常應(yīng)介于1.5～3之間。可采用基于質(zhì)量檢測的碰撞法，基于激光飛行法的光學(xué)方法或其它替代方法定期對呼吸區(qū)或染毒柜中的氣溶膠粒徑進(jìn)行測定，并計算GSD值。如在整個試驗周期中采用替代方法進(jìn)行粒徑分析時，需驗證替代方法所得結(jié)果與碰撞法一致。

5.5.3  暴露裝置內(nèi)氣流

通過染毒柜或口鼻暴露系統(tǒng)的氣流速率需嚴(yán)格控制，應(yīng)在每次暴露期間盡可能連續(xù)監(jiān)測并每小時記錄1次。

5.5.4  暴露系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境監(jiān)測

暴露系統(tǒng)內(nèi)溫度維持在22℃±3℃，口鼻暴露和全身暴露系統(tǒng)都需監(jiān)測記錄動物呼吸區(qū)的相對濕度，應(yīng)在每次暴露期間盡可能連續(xù)監(jiān)測并每小時記錄1次。理想的相對濕度一般在30%～70%，但在某些情況下，可能無法達(dá)到（例如在測試水溶液型受試物時），應(yīng)在試驗報告中予以闡釋說明。氧氣的濃度不低于19%，二氧化碳的濃度不超過1%。

5.6  臨床觀察

染毒期間應(yīng)每天觀察，染毒結(jié)束后，追蹤觀察組還應(yīng)繼續(xù)觀察至追蹤觀察期結(jié)束。對動物的任何毒性表現(xiàn)均應(yīng)記錄，記錄內(nèi)容包括發(fā)生時間、程度和持續(xù)時間。觀察應(yīng)至少包括如下內(nèi)容：皮膚和被毛的改變、眼和粘膜變化、呼吸、循環(huán)、植物神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肢體運動和行為活動等改變。應(yīng)在首次染毒前記錄動物體重，此后每周記錄動物體重變化。應(yīng)測定每周飼料消耗量。

5.7  臨床檢查

5.7.1  眼科檢查

在動物染毒前和染毒后，應(yīng)對所有實驗動物，使用眼科鏡或其他有關(guān)設(shè)備進(jìn)行眼科檢查。

5.7.2  血液檢查

在染毒結(jié)束及追蹤觀察結(jié)束時應(yīng)測定血球容積、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞總數(shù)和分類，必要時測定凝血功能如凝血時間、凝血酶原時間、凝血激酶時間或血小板數(shù)等指標(biāo)。

5.7.3  臨床血液生化檢查

在染毒結(jié)束及追蹤觀察結(jié)束時進(jìn)行，檢查指標(biāo)包括電解質(zhì)平衡、碳水化合物代謝、肝、腎功能?？筛鶕?jù)受試物作用形式選擇其他特殊檢查。推薦的指標(biāo)包括：氯、鈉、鉀、禁食血糖（不同動物品系采用不同的禁食期）、血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、尿素氮、白蛋白、血液肌酐、總膽紅素及總血清蛋白。必要時可進(jìn)行脂肪、激素、酸堿平衡、正鐵血紅蛋白、膽堿酯酶活性的分析測定。此外，還可根據(jù)所觀察到的毒性作用進(jìn)行其他更大范圍的臨床生化檢查，以便進(jìn)行全面的毒性評價。

5.7.4  尿液檢查

一般不需要進(jìn)行，只有當(dāng)懷疑存在或觀察到相關(guān)毒性作用時方需進(jìn)行尿液檢查。

5.7.5  支氣管肺泡灌洗（bronchoalveolar lavage, BAL）檢查

解剖動物取肺臟，整肺稱重后結(jié)扎左肺用于組織病理學(xué)檢查，右肺進(jìn)行BAL檢查，分析BAL液的白細(xì)胞計數(shù)和分類、總蛋白、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶以及炎癥相關(guān)細(xì)胞因子/趨化因子等參數(shù)。BAL液分析通常作為組織病理學(xué)檢查的結(jié)果的補充，但不能替代組織病理學(xué)檢查。

5.7.6  其他檢查指標(biāo)

可根據(jù)研究需要，增加額外的檢測指標(biāo)，如肺功能，行為學(xué)分析等。

5.8  病理檢查

5.8.1  大體尸檢

所有動物均應(yīng)進(jìn)行全面的大體尸檢，內(nèi)容包括動物的外觀、所有孔道，胸腔、腹腔及其內(nèi)容物。肺、肝、腎、腎上腺、睪丸、附睪、子宮、卵巢、胸腺、脾、腦和心臟應(yīng)在分離后盡快稱重以防水分丟失。應(yīng)將下列組織和器官保存在固定液中，以備日后進(jìn)行病理組織學(xué)檢查：所有大體解剖呈現(xiàn)異常的器官、腦（包括延髓/腦橋、小腦和大腦皮層、腦垂體）、甲狀腺/甲狀旁腺、胸腺、左肺/氣管、喉、鼻咽組織、心臟、主動脈、唾液腺、肝、脾、腎、腎上腺、胰、性腺、子宮、生殖附屬器官*、皮膚*、食管、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸、直腸、膀胱、前列腺、有代表性的淋巴結(jié)、雌性乳腺*、大腿肌肉*、周圍神經(jīng)、胸骨（包括骨髓）、眼及視神經(jīng)、股骨（包括關(guān)節(jié)面）*、脊髓（包括頸部、胸部、腰部）*和淚腺*。

*只有當(dāng)毒性作用提示或作為被研究的靶器官時才需要檢查這些器官。

5.8.2  病理組織學(xué)檢查

應(yīng)對下述器官和組織進(jìn)行檢查：

（1）所有最高劑量組和對照組動物的重要的和可能受到損傷的器官或組織，如高劑量組動物的器官或組織有病理組織學(xué)的病變，則應(yīng)擴展至其他劑量組的相應(yīng)的器官和組織。

（2）各劑量組大體解剖見有異常的器官或組織。

（3）其他劑量組動物的靶器官。

（4）在追蹤觀察組，應(yīng)對那些在染毒組呈現(xiàn)毒性作用的組織和器官進(jìn)行檢查。

6、試驗結(jié)果的評價

6.1  數(shù)據(jù)處理

可通過表格形式總結(jié)試驗結(jié)果，顯示試驗開始時各組動物數(shù)、出現(xiàn)損傷的動物數(shù)、損傷的類型和每種損傷的動物百分比。對所有數(shù)據(jù)應(yīng)采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行評價，統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)在試驗設(shè)計時確定。

6.2  結(jié)果評價

90天重復(fù)劑量吸入毒性試驗結(jié)果應(yīng)結(jié)合前期試驗結(jié)果，并考慮到毒性效應(yīng)指標(biāo)和尸檢及病理組織學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行綜合評價。毒性評價應(yīng)包括受試物吸入暴露劑量與是否出現(xiàn)毒性反應(yīng)、毒性反應(yīng)的發(fā)生率及其程度之間的關(guān)系。這些反應(yīng)包括行為或臨床異常、肉眼可見的損傷、靶器官、體重變化情況、死亡效應(yīng)以及其他一般或特殊的毒性作用。在綜合分析的基礎(chǔ)上得出重復(fù)劑量吸入毒性的LOAEL和（或）NOAEL，為人群吸入的定量風(fēng)險評估提供依據(jù)。

 

7、試驗結(jié)果的解釋

90天重復(fù)劑量吸入毒性試驗?zāi)軌蛱峁┦茉囄镩L期經(jīng)呼吸系統(tǒng)反復(fù)吸入接觸引起的毒性作用資料。其試驗結(jié)果可在有限的程度上外推到人，但它可為確定人群的允許接觸水平提供有用的信息。

 

90天重復(fù)劑量吸入毒性試驗

起草說明

 

為加強化妝品的監(jiān)督管理，進(jìn)一步提高化妝品使用安全性，中國食品藥品檢定研究院組織開展了90天重復(fù)劑量吸入毒性試驗方法的研究制定工作?，F(xiàn)就工作有關(guān)情況說明如下：

 

一、起草原則

本方法主要參照OECD 在2018 年發(fā)布的“化學(xué)品檢測指南——90天（亞慢性）吸入毒性研究”（TG413）編制。寫作結(jié)構(gòu)框架按現(xiàn)行《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行調(diào)整。本標(biāo)準(zhǔn)制定在充分考慮動物福利的前提下，本著科學(xué)性、合理性、規(guī)范性的指導(dǎo)原則，對某些內(nèi)容及吸入相關(guān)特征指標(biāo)進(jìn)行具體化和明確化，同時也盡可能提供多種吸入條件監(jiān)測方法，突出體現(xiàn)適用性與可操作性。

 

二、起草過程

本研究于2021年11月由化妝品標(biāo)準(zhǔn)專家委員會立項；在研究和分析國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，起草了本標(biāo)準(zhǔn)文本及編制說明，形成方法草案。

2023年5月本標(biāo)準(zhǔn)草案通過結(jié)題專家論證，形成如下意見及結(jié)論：按28天重復(fù)劑量吸入毒性試驗和90天重復(fù)劑量吸入毒性試驗分別提交方法文本和起草說明，規(guī)范方法文本，修改后通過。修改后對外征求意見，根據(jù)反饋情況對文本進(jìn)行修改。

 

三、與我國已有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系

我國現(xiàn)已發(fā)布國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T21765-2008《化學(xué)品亞慢性吸入毒性試驗方法》。本方法在參考上述我國已有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，主要針對化妝品原料的特點，以現(xiàn)行《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中亞慢性經(jīng)口毒性試驗和亞慢性經(jīng)皮毒性試驗的寫作框架為模板，本著化妝品原料檢測適用性及可操作性的原則進(jìn)行編制。

 

四、與國際同類標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系

本方法以O(shè)ECD 2018年發(fā)布“化學(xué)品檢測指南——90天（亞慢性）吸入毒性研究”（OECD GUIDELINES ON THE TESTING OF CHEMICALS: 90-Day (Subchronic) Inhalation Toxicity Study）為依據(jù)進(jìn)行撰寫，結(jié)合國內(nèi)實驗條件及操作的具體情況，撰寫的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容基本涵蓋了實驗對象、實驗操作和結(jié)果分析的技術(shù)要求，重點突出了對的吸入暴露參數(shù)的規(guī)定和確認(rèn)。

 

五、與《規(guī)范》中原方法的對比情況

現(xiàn)行《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中尚無90天重復(fù)劑量吸入毒性試驗的相關(guān)內(nèi)容，但有亞慢性經(jīng)口毒性試驗和亞慢性經(jīng)皮毒性試驗的相關(guān)內(nèi)容，本標(biāo)準(zhǔn)以上述試驗方法的寫作框架為模板，重點增加了對吸入相關(guān)特征指標(biāo)規(guī)定。

 

Skin Absorption-In Vivo Method

（征求意見稿）

 

1、 范圍

本方法規(guī)定了皮膚吸收體內(nèi)試驗方法的術(shù)語和定義、試驗原則、試驗方法、試驗數(shù)據(jù)和報告。

本方法適用于化妝品原料經(jīng)皮吸收的體內(nèi)試驗。

 

2、 試驗?zāi)康?/span>

本方法闡述了化妝品原料經(jīng)皮吸收的體內(nèi)試驗方法，以便為化妝品原料的毒性分級、標(biāo)簽標(biāo)識和應(yīng)用提供試驗依據(jù)。本試驗方法適用于單一成分的化妝品原料，非單一成分的原料若使用本方法進(jìn)行評價，需要提供更多的科學(xué)依據(jù)說明其可行性。

 

3、 術(shù)語和定義

未吸收劑量（unabsorbed dose）:染毒暴露以后從皮膚洗脫下來的劑量、附著在開放性覆蓋物的劑量，還包括在染毒過程中從皮膚表面蒸發(fā)的量。

吸收劑量（absorbed dose）：染毒部位皮膚處理以后，包括在尿液、籠具清洗液、糞便、呼氣（如果可測）、血液、各種組織（如果可采集）以及尸體殘留的劑量。

可吸收劑量（absorbable dose）:皮膚清洗后存留在皮膚上或皮膚內(nèi)的劑量。

 

4、 試驗的基本原則

將受試物（如放射標(biāo)記物）以符合實際使用情況的制劑形式按一個或多個劑量涂布于動物剃毛后的皮膚上，然后覆蓋上合適的保護(hù)裝置（開放式、半封閉式和封閉式）以防止動物舔舐樣品，并讓受試物制劑與動物皮膚持續(xù)接觸暴露一段時間。在暴露時間結(jié)束后，取下覆蓋物并用合適的清潔劑清洗動物皮膚，保留用過的覆蓋物和清洗液以備分析測定，然后換上新的覆蓋物。在試驗前、試驗期間和試驗結(jié)束后，動物需要一直單獨飼養(yǎng)于代謝籠中，收集其排泄物和呼出氣以備分析測定。如果有充足的證據(jù)表明極少產(chǎn)生或不產(chǎn)生揮發(fā)性的放射性代謝產(chǎn)物，則可以不收集動物呼出氣。每個試驗通常包括多個試驗組，其中一個試驗組動物在染毒結(jié)束后立即處死，其他試驗組動物可根據(jù)試驗計劃在染毒結(jié)束后間隔不同時間處死。在每一個采樣時間點處死相關(guān)存活動物，采集血樣以及染毒部位皮膚進(jìn)行分析測定；此外，對殘留在動物尸體內(nèi)未被排泄出的代謝物也要進(jìn)行分析測定。最后，用適當(dāng)?shù)姆治龇椒▽Σ杉臉悠愤M(jìn)行分析測定，并估計透皮吸收的程度。

 

5、 試驗方法

5.1 受試物

受試物應(yīng)該作為一個整體對其透皮吸收特性進(jìn)行研究。理想情況下，應(yīng)該用放射性標(biāo)記受試物。

受試物應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)配制后用于測試。受試物的配制（比如純品、稀釋品或者含有受試物的制劑）應(yīng)與人類或者其他目標(biāo)種屬動物接觸該物質(zhì)的形態(tài)一致或相似；任何不同于實際使用情形的改變均應(yīng)給出合理的解釋。必要時可以將樣品溶解或者均勻分散于溶媒中，應(yīng)該了解溶媒（水除外）的皮膚吸收特征以及與受試物的相互作用。

5.2 實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境

5.2.1 動物物種、品系的選擇

大鼠是最常用的實驗動物，但是也可以根據(jù)檢測原料性質(zhì)的不同使用皮膚吸收率和人類更相似的裸鼠以及其他品系動物。一般選用成年健康的單性別動物（通常用雄性）。試驗開始時，實驗動物體重差異不應(yīng)大于平均體重的20%。比如，雄性大鼠體重一般應(yīng)在200～250g范圍之內(nèi)，最好是在該范圍的上半?yún)^(qū)內(nèi)。

5.2.2性別和數(shù)量

每個樣品采集以及每個設(shè)定的觀察時間點需設(shè)一個試驗組，每組至少4只相同性別動物。在每一段時間間隔處死一組動物，比如在染毒結(jié)束時（通常是6h或24h）和后續(xù)觀察期結(jié)束時（例如48h和72h）。如果已有資料表明受試物的經(jīng)皮毒性有明顯雌雄性別差異，應(yīng)選用更敏感的性別；如果沒有資料，則任選一種。

5.2.3飼養(yǎng)環(huán)境

動物實驗室溫度應(yīng)在22℃±3℃；相對濕度應(yīng)在30%～70%之間，但盡可能達(dá)到50%～60%。人工控制光照，明暗12h交替。動物常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。在試驗期間（最好也包括適應(yīng)期間），動物應(yīng)在代謝籠中單籠飼養(yǎng)。因食物和水的溢出會影響到試驗結(jié)果，要盡量避免及減少此類情況發(fā)生。

5.3 試驗步驟

5.3.1 試驗動物的準(zhǔn)備

標(biāo)記動物以便識別，并在研究開始前進(jìn)行至少五天適應(yīng)性喂養(yǎng)，使動物適應(yīng)實驗室條件。

適應(yīng)期后（大約染毒前24小時），剃除每只動物肩部和背部的毛發(fā)。因受損皮膚后可能改變皮膚的滲透特性，因此剃除毛發(fā)時要注意避免損傷皮膚。剃毛后（大約在皮膚染毒前24小時），用丙酮輕輕擦拭皮膚表面以去除皮脂。不建議另外用肥皂和水清洗皮膚，因為任何肥皂殘留物都可能促皮膚對測試物質(zhì)的吸收。剃毛面積應(yīng)該足夠大，以便能夠較準(zhǔn)確的計算出每平方厘米皮膚上受試物的吸收量。對于體重在200～250 克范圍內(nèi)的大鼠，剃毛皮膚面積應(yīng)該至少為10 cm2。動物準(zhǔn)備完畢后，重新放回代謝籠。

5.3.2 皮膚染毒

選用特定面積的特定皮膚位置。然后將已知量的測試制劑均勻地涂于該部位。該量通常應(yīng)模擬潛在的人體用量，通常為1～5 mg/cm2 的固體或10μl/cm2的液體?？筛鶕?jù)試驗具體條件、試驗?zāi)康囊约笆茉囄锏奈锢硇再|(zhì)等調(diào)整染毒劑量，但應(yīng)有適當(dāng)理由。染毒后，受試部位應(yīng)避免被觸碰。通常，受試部位應(yīng)采用非閉合的遮蓋裝置覆蓋（如使用透氣尼龍紗布），典型裝置的示例如圖1所示。某些特定情況下，受試部位應(yīng)采取閉合性保護(hù)。若半揮發(fā)性測試物質(zhì)的揮發(fā)導(dǎo)致受試物的回收率超出可接受的范圍（另見5.4），此時則有必要在在受試物裝置上覆蓋活性炭過濾器以捕獲揮發(fā)的受試物（見圖1）。任何覆蓋物都不應(yīng)損傷皮膚，也不會吸收或與受試制備物發(fā)生反應(yīng)。染毒后，將動物放回單獨的代謝籠中以收集排泄物。

圖1 一種用于覆蓋和保護(hù)受試部位皮膚的典型遮蓋裝置設(shè)計示例圖

5.3.3 染毒時間和取樣

染毒期是指在皮膚開始接觸受試物，至清洗去除受試物之間的時間間隔。所采用的染毒時間（一般為6或24h）應(yīng)與通常人體可能的接觸時間相對應(yīng)。染毒結(jié)束后，將動物飼養(yǎng)于代謝籠中保留直至預(yù)定的處死時間點。染毒結(jié)束后，應(yīng)對受試皮膚進(jìn)行觀察并記錄任何可見的刺激癥狀。

在整個研究過程中，應(yīng)采用代謝籠單獨收集尿液和糞便，并可在14C-標(biāo)記的二氧化碳和揮發(fā)性14C化合物(>5%)產(chǎn)生時進(jìn)行收集和定量分析。尿液、糞便和捕獲液（如14C標(biāo)記的二氧化碳和揮發(fā)性14C化合物）應(yīng)在每個取樣時間點從每組中單獨收集。若有足夠的信息證明很少或幾乎不產(chǎn)生放射性代謝物，則可采用開放式籠架。整個試驗期間，應(yīng)定期觀察動物的毒性/異常反應(yīng)。

染毒期，從開始皮膚接觸后至24h以及隨后的每一天，均應(yīng)收集排泄物直至試驗結(jié)束。一般而言，雖然三個排泄物收集間隔時間點通常就足夠了，但某些受試制備物的特征或現(xiàn)有動力學(xué)數(shù)據(jù)可能會要求有更合適的或更多的收集時間點。

染毒結(jié)束時，從每只動物身上移去保護(hù)裝置并單獨保留以便試驗分析。所有動物的受試部位皮膚應(yīng)用棉簽蘸取清劑清洗至少3次。必須注意避免污染其他部位。清洗劑應(yīng)為肥皂水等有代表性的常用衛(wèi)生清潔劑。最后，擦干皮膚，用新的干凈遮蓋裝置覆蓋受試部位皮膚，將這些動物放回代謝籠，組成后面時間點的試驗動物組。必須保留所有擦洗拭子和洗液以供研究分析。

5.3.4 試驗觀察和檢測

對于每個實驗組，應(yīng)在預(yù)定時間處死試驗動物，收集血樣，移去保護(hù)下的裝置或覆蓋物并進(jìn)行分析。剪下每只動物的受試部位皮膚以及對應(yīng)的空白對照部位皮膚，分別進(jìn)行試驗分析。受試部位皮膚可分層，可將角質(zhì)層與下面的真皮層分離，以提供受試物更多的信息。在染毒之后的這一時段受試物分布的試驗分析，將提供其在角質(zhì)層中轉(zhuǎn)運的某些特征。最后清洗皮膚并處死動物后，應(yīng)移去保護(hù)下的覆蓋物，以便于皮膚分層處理。從受試動物身體上環(huán)狀切下受試部位的皮膚并釘在板上，將粘附性膠條貼于皮膚表面，輕壓，膠條將部分角質(zhì)層粘附下來，繼續(xù)用膠條重復(fù)粘貼，直到膠條不在粘附與皮膚表面，表明角質(zhì)層已被全部去除。將同一只動物的所有膠條合并至一個單獨的容器中，加入組織消化液溶解角質(zhì)層。

保留每只動物的尸體以便試驗分析。在對動物尸體進(jìn)行吸收劑量試驗前，每個可能的靶組織均可被分離單獨進(jìn)行試驗。一般而言，僅對尸體的總含量進(jìn)行分析即可，若有其他研究提示，也可將靶組織分離進(jìn)行單獨試驗。動物處死時，膀胱中的尿液應(yīng)與先前收集的尿液合并在一起進(jìn)行測試。此外，收集了代謝籠中的糞便后，籠子和捕獲裝置均應(yīng)采用合適的溶劑沖洗并收集，其他潛在的受污染儀器也應(yīng)該進(jìn)行類似的處理。

5.4 試驗分析

所有試驗均應(yīng)達(dá)到足夠的回收率（如平均100±10%的放射性），超出回收率范圍的應(yīng)說明理由。每個樣品所使用的劑量應(yīng)采用適宜、有效的方法進(jìn)行分析。

統(tǒng)計分析應(yīng)考慮測定每個劑量組的平行樣之間的偏差。

 

6.數(shù)據(jù)和報告

6.1數(shù)據(jù)

6.1.1       應(yīng)對每只動物在每個取樣時間的受試物和（或）代謝物進(jìn)行以下測定（除單個動物的數(shù)據(jù)外）以便計算吸收劑量、未吸收劑量和可吸收劑量，且不同取樣時間點的數(shù)據(jù)均應(yīng)按組報告其平均值：

- 保護(hù)器具上的量；

- 從皮膚上清除下來的量；

- 在皮膚上/皮膚內(nèi)、不能從皮膚上洗下的量；

- 血樣中的量；

- 排泄物和呼出氣體中的量（如適用）；

- 殘留在尸體和取下單獨試驗的器官上的量。

6.1.2 排泄物、呼出的空氣、血液和尸體中的受試物和/或代謝物的量，用以確定每個時間點的吸收總量，從而計算出染毒后每平方厘米皮膚吸收受試物的量。

6.2 報告

試驗報告應(yīng)符合試驗方案所規(guī)定的要求，包括所使用試驗系統(tǒng)合理性，具體包括以下內(nèi)容：

1）受試物：

- 識別數(shù)據(jù)[如，CAS 編號；來源;純度（放射化學(xué)純度）；已知雜質(zhì)；批號];

- 物理性質(zhì)、物理化學(xué)性質(zhì)（如，pH、揮發(fā)性、溶解度、穩(wěn)定性、分子量和辛醇/水分配系數(shù)的對數(shù)值lgPOW）；

2）受試物的制備：

- 配方和使用理由；

- 受試物制備詳細(xì)過程、使用量、達(dá)到的濃度、賦形劑、穩(wěn)定性和均一性；

3）受試動物：

- 使用的種屬/系；

- 動物的數(shù)量、年齡和性別；

- 動物來源、飼養(yǎng)環(huán)境、飼料、生產(chǎn)許可證明、使用許可證明等；

- 試驗開始時每只動物的體重；

4）試驗條件：

- 染毒的詳細(xì)過程（受試部位、分析方法、閉合/非閉合、體積、提取、檢測）；

- 食物和水質(zhì)的詳細(xì)信息。

5）結(jié)果：

- 任何毒性癥狀；

- 吸收數(shù)據(jù)列表（以速率、數(shù)量或百分比表示）；

- 試驗的總體回收率；

- 結(jié)果的解釋，與該受試物已有的經(jīng)皮吸收的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

6）結(jié)果討論。

7）結(jié)論。

 

皮膚吸收體內(nèi)試驗方法起草說明

 

為配合《化妝品新原料注冊備案資料管理規(guī)定》的實施，有必要建立與其相適應(yīng)的體內(nèi)皮膚吸收試驗方法及技術(shù)指導(dǎo)原則，為該類化妝品原料的安全性評估提供技術(shù)保障，中國食品藥品檢定研究院組織起草了《皮膚吸收體內(nèi)試驗方法》（征求意見稿）?，F(xiàn)就起草的有關(guān)情況說明如下：

 

一、起草的必要性

皮膚有吸收外界物質(zhì)的能力，稱為經(jīng)皮吸收。皮膚最主要的吸收途徑是滲透入角質(zhì)層細(xì)胞，再經(jīng)表皮其他各層到達(dá)真皮而被吸收（主要吸收脂溶性物質(zhì)）；除此之外，還可通過毛囊、皮脂腺和汗腺導(dǎo)管而被吸收（主要吸收水溶性物質(zhì)）；極少量的物質(zhì)如鉀、鈉、汞等可通過角質(zhì)層細(xì)胞間隙吸收。

皮膚吸收功能對維護(hù)身體健康必不可少，并且是外用藥物治療疾病及化妝品發(fā)揮作用的理論基礎(chǔ)，各類外用藥物利用皮膚的吸收能力達(dá)到治療疾病的作用，各種美白護(hù)膚化妝品利用皮膚的吸收能力來達(dá)到祛斑、美白等功效。

在化妝品研究領(lǐng)域，進(jìn)行經(jīng)皮膚暴露的安全評估時，皮膚吸收率的檢測是一項基礎(chǔ)而又非常重要的內(nèi)容。經(jīng)皮吸收試驗方法可分為兩類：體外吸收方法和體內(nèi)吸收方法，其中，用各類實驗動物開展的體內(nèi)皮膚吸收試驗方法能夠為受試物的經(jīng)皮吸收率提供較為可靠的資料。

國外現(xiàn)有的體內(nèi)皮膚吸收評價方法或指導(dǎo)原則有世界衛(wèi)生組織（World Health Organization, WHO）2006年發(fā)布的《環(huán)境健康標(biāo)準(zhǔn)235：皮膚吸收》（Environmental Health Criteria 235: DERMAL ABSORPTION），經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）2004年發(fā)布的《皮膚吸收：體內(nèi)試驗方法》（OECD guideline for the testing of chemicals Skin Absorption: in vivo Method），歐洲食品安全局（European Food Safety Authority, EFSA）2017年發(fā)布的《皮膚吸收指南》（Guidance on dermal absorption），以及美國環(huán)保署（United States Environmental Protection Agency，US EPA）1998年發(fā)布的《健康效應(yīng)測試指南：皮膚滲透》（Health Effects Test Guidelines OPPTS 870.7600 Dermal Penetration）等。我國于2011年發(fā)布了國家標(biāo)準(zhǔn)《化學(xué)品皮膚吸收體內(nèi)實驗方法》（GB/T 27825-2011），該標(biāo)準(zhǔn)所用的試驗方法與OECD的方法基本一致。

2021年，我國發(fā)布了《化妝品新原料注冊備案資料管理規(guī)定》，對化妝品新原料注冊備案資料要求進(jìn)行了明確規(guī)定，其中在國內(nèi)外首次使用的具有較高生物活性的寡肽、多肽、蛋白質(zhì)類新原料，以及擬用于皮膚部位的納米新原料，要求提交皮膚吸收/透皮試驗資料。因此，有必要建立與其相適應(yīng)的體內(nèi)皮膚吸收試驗方法及技術(shù)指導(dǎo)原則，為該類化妝品原料的安全性評估提供技術(shù)保障。

 

二、起草原則與思路

查閱國內(nèi)外關(guān)于藥物、化學(xué)物質(zhì)皮膚吸收的體內(nèi)試驗方法，對不同的試驗方法進(jìn)行對比、分析，從而轉(zhuǎn)化、建立適用于化妝品原料皮膚吸收率檢測的試驗方法，用于具有較高生物活性物質(zhì)或納米級物質(zhì)的皮膚吸收率檢測。在建立體內(nèi)皮膚吸收率試驗方法時，明確對受試物的要求、實驗動物的選擇及飼養(yǎng)條件、實驗組和對照組的設(shè)置、陽性對照物的選擇、皮膚染毒方式、染毒暴露時間、樣品采集與檢測、數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法、結(jié)果判定原則等內(nèi)容，并起草皮膚吸收體內(nèi)試驗方法實驗報告范例。

根據(jù)研究所得的試驗方法，制定技術(shù)指導(dǎo)原則，如適用范圍、評價指標(biāo)、統(tǒng)計學(xué)方法、結(jié)果判定原則等，建議作為具有較高生物活性物質(zhì)或納米級物質(zhì)等申報化妝品新原料時的安全性評價技術(shù)審評原則。

 

三、主要內(nèi)容

（一）研究方法

查閱國內(nèi)外關(guān)于藥物、化學(xué)物質(zhì)皮膚吸收的體內(nèi)試驗方法，通過對比分析，轉(zhuǎn)化為化妝品用原料皮膚吸收體內(nèi)試驗方法，明確其適用范圍、受試物要求、實驗動物的選擇與飼養(yǎng)、暴露方式及條件、樣品采集與檢測、數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法、結(jié)果判定原則等。在此基礎(chǔ)上，梳理該試驗方法的關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)，通過專家論證及征求意見，并對反饋意見進(jìn)行了研究和吸納，起草了皮膚吸收體內(nèi)試驗技術(shù)指導(dǎo)原則。

1.實驗動物。根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)、動物倫理要求和試驗指導(dǎo)原則對試驗動物的種類、性別、體重、數(shù)量、飼養(yǎng)條件、適應(yīng)性飼養(yǎng)時間等條件進(jìn)行規(guī)定，并根據(jù)皮膚吸收試驗的特點規(guī)定動物每籠飼養(yǎng)數(shù)量、動物分組等。

2.暴露方式及條件。根據(jù)受試物的物態(tài)對皮膚吸收的暴露方式進(jìn)行規(guī)定，包括受試部位、受試物濃度及用量、受試部位的保護(hù)、暴露時間等。

3.樣品采集與檢測。根據(jù)受試物及實驗動物的特點，對樣品采集的范圍及時間點進(jìn)行規(guī)定，包括實驗動物的尿液、糞便、捕獲液、遮蓋物、擦洗試子、洗液、血樣、受試部位皮膚、動物尸體或靶組織、飼養(yǎng)籠清洗液等，并采用適宜、有效的方法進(jìn)行檢測。

4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。對試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析方法進(jìn)行規(guī)定，包括不同時間點的回收率、吸收劑量、未吸收劑量、可吸收劑量等，從而計算出染毒后每平方厘米皮膚吸收受試物的量。

5.試驗報告編寫。根據(jù)所制定的試驗方法對試驗報告的內(nèi)容進(jìn)行規(guī)定，包括受試物的描述及制備、實驗動物相關(guān)信息、染毒方法、試驗結(jié)果的統(tǒng)計分析及解釋、試驗結(jié)論等。

6.技術(shù)指導(dǎo)原則制定。根據(jù)所制定的試驗方法及試驗報告的內(nèi)容，制定相應(yīng)的技術(shù)指導(dǎo)原則，包括該試驗的適用范圍、評價指標(biāo)、統(tǒng)計學(xué)方法、結(jié)果判定原則等。

 

（二）技術(shù)路線

 

 

急性吸入毒性試驗急性毒性分級法

Acute Inhalation Toxicity   Acute Toxic Class Method

（征求意見稿）

 

1、  范圍

本試驗方法規(guī)定了急性吸入毒性試驗急性毒性分級法的試驗原則、試驗方法、數(shù)據(jù)和報告。

本試驗方法適用于化妝品原料急性吸入毒性的急性毒性分級。

 

2、  試驗?zāi)康?/span>

本試驗方法的目的是通過測試獲得受試物的健康危害信息等資料，從而可參考聯(lián)合國全球化學(xué)品分級和標(biāo)簽管理協(xié)調(diào)制度（the United Nations（UN）Globally Harmonized System （GHS）of Classification and Labelling of Chemicals）的化學(xué)品急性吸入毒性分級標(biāo)準(zhǔn)對其急性毒性進(jìn)行分級。本試驗方法適用于單一成分的化妝品原料，非單一成分的原料若使用本方法進(jìn)行評價，需要提供更多的科學(xué)依據(jù)說明其可行性。本試驗方法不適用于測試難溶的同分異構(gòu)物、纖維類、納米類原料等。

 

3、  定義

急性吸入毒性分級法是指按照一定的連續(xù)試驗步驟和相應(yīng)的濃度進(jìn)行測試，從而獲得受試物的毒性分級和半數(shù)致死濃度（LC50，Lethal Concentration 50）估測范圍的試驗方法。

理論濃度（nominal concentration），是指應(yīng)用受試物的量除以通過染毒系統(tǒng)空氣的總體積所得到的濃度。

實際濃度（actual concentration）是指在吸入式染毒柜中動物呼吸道中的受試物濃度，可通過特異性（如直接采樣、吸附或化學(xué)反應(yīng)等方法進(jìn)行采樣、分析）或非特異性（如濾膜增重法）等方法進(jìn)行測試分析。

 

4、  試驗原則

本試驗采用分步試驗的方法，觀察試驗動物段時間（一般為4 h，不超過24 h）吸入暴露后的反應(yīng)，從而得到可以對受試物急性吸入毒性進(jìn)行分級的信息。每步試驗使用每種性別3只動物在確定的濃度下進(jìn)行吸入暴露試驗。根據(jù)動物死亡和/或瀕死狀態(tài)，有時只進(jìn)行2步試驗操作就可以對受試物的急性吸入毒性類別做出判斷。如果有證據(jù)表明某種性別的動物比另外一種動物的敏感性要高時，可以只使用敏感性別動物進(jìn)行試驗。前面一步操作的試驗結(jié)果決定著下一步試驗操作：

a）無需進(jìn)行下一步試驗；

b）每種性別3只動物；或

c）只使用6只敏感性別的動物。方法是每個試驗濃度組使用6只敏感性別的動物（性別不限），以估測的毒性類別界限范圍數(shù)值中較低的濃度來進(jìn)行試驗。

應(yīng)人道地處死瀕臨死亡的、處于難以忍受疼痛的和嚴(yán)重持久痛苦的動物按照試驗死亡進(jìn)行統(tǒng)計。

 

5、  試驗方法

5.1方法描述

5.1.1 動物種屬的選擇

應(yīng)使用健康年輕、實驗室中常用的種屬動物進(jìn)行試驗。首選大鼠，如使用其他動物應(yīng)進(jìn)行論證，說明理由和依據(jù)。

5.1.2 動物的準(zhǔn)備

雌性動物應(yīng)是未經(jīng)產(chǎn)的、未妊娠。要保證每步試驗暴露時的鼠齡在8周~12周；每一步試驗之間使用的同周齡、同性別動物的平均體重相差應(yīng)不超過±20%。采用隨機選擇原則，并對每只動物做出標(biāo)記。在進(jìn)行試驗之前至少要在籠內(nèi)飼養(yǎng)5天以適應(yīng)實驗室飼養(yǎng)條件。試驗前還需在試驗設(shè)備中進(jìn)行短期的適應(yīng)訓(xùn)練，以減少因為進(jìn)入新的設(shè)備環(huán)境造成的應(yīng)激。

5.1.3 飼養(yǎng)條件

實驗動物暴露前和暴露結(jié)束后，室內(nèi)溫度應(yīng)在22℃±3℃。理想情況下相對濕度在30%~70%范圍內(nèi)，但試驗暴露期間以水為載體時很難做到。

實驗動物暴露前后按性別、濃度分籠飼養(yǎng)，但是每籠動物的數(shù)量不能妨礙對每只實驗動物的觀察，并應(yīng)減少由于同種相殘和相互撕咬而造成實驗動物信息的丟失。以口-鼻式裝置暴露時，需將動物放入染毒柜內(nèi)使其適應(yīng)染毒柜的環(huán)境。動物在染毒柜內(nèi)的固定不能過度的增加動物體力、熱量和活動的負(fù)荷，動物的固定可能影響動物的體溫（過熱）和/或每分鐘動物呼吸量。如果有資料表明這些改變沒有達(dá)到可感覺到的程度，就不一定需要預(yù)先在染毒柜內(nèi)進(jìn)行適應(yīng)操作。全身暴露氣溶膠的動物暴露期間需各自相隔互不接觸，防止柜體內(nèi)動物的相互趴臥造成被毛對氣溶膠的過濾作用。除暴露期間外，可使用常規(guī)和經(jīng)過認(rèn)證的實驗室飲食，自由飲水。采用人工照明，每12 h明暗交替。

5.1.4 吸入染毒裝置

要根據(jù)受試物的性質(zhì)和試驗?zāi)康膩磉x擇吸入染毒方式。首選的染毒方式是口-鼻式染毒（包括頭部暴露、鼻部暴露或者口鼻部暴露模式）。當(dāng)受試物是液體、固態(tài)氣溶膠和能產(chǎn)生氣溶膠的蒸氣時，首選鼻式暴露方式。對于特殊的研究目的，也可采用全身暴露染毒裝置以更好地滿足研究需求，但應(yīng)在試驗報告中予以闡釋說明。為了保證全身染毒時柜體內(nèi)空氣中受試物的穩(wěn)定性，實驗動物的總體積不應(yīng)超過染毒柜總?cè)莘e的5%。

5.2 暴露條件

5.2.1染毒濃度

5.2.1.1推薦暴露吸入時間為4 h，但需除去達(dá)到濃度穩(wěn)定平衡所需時間。根據(jù)特殊試驗需要也可采用其他的暴露時限，但是需在試驗報告中給予相關(guān)說明。全身暴露時的動物單獨飼養(yǎng)，防止染毒柜內(nèi)其他動物的理毛行為經(jīng)口攝入受試物。吸入暴露期間需要禁食。全身暴露時可提供飲水。

5.2.1.2動物吸入暴露的受試物是氣體、蒸氣、氣溶膠或是它們的混合物。試驗時將受試物制備成的何種物態(tài)（氣溶膠、粉塵）取決于受試物的理化性質(zhì)、設(shè)定的濃度，和/或按照實際加工使用期間的物理狀態(tài)等。具有吸濕性的和會發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的受試物在試驗中需保證吸入的空氣是干燥的。需注意避免使用發(fā)生爆炸的濃度進(jìn)行試驗。

5.2.2 顆粒粒徑的分布

對所有的氣溶膠和可能形成氣溶膠的蒸氣都需測定顆粒粒徑的大小。為了使整個呼吸道都能暴露受試物，推薦的氣溶膠顆粒的質(zhì)量中值空氣動力學(xué)直徑（Mass Median Aerodynamic Diameter，MMAD）為1μm～4μm，其幾何標(biāo)準(zhǔn)差為1.5～3.0。需盡可能達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)，如技術(shù)上無法滿足要求時需由專家做出評判。例如，金屬煙塵比本標(biāo)準(zhǔn)的粒徑要小，但是帶電的粒子、纖維和吸濕性受試物（在呼吸道潮濕環(huán)境下其粒徑增加）可超過這個標(biāo)準(zhǔn)。

5.2.3 載體選擇與受試物的配制

為了制備具有合適濃度和粒徑大小的受試氣體，需要使用載體溶劑，水是首選載體溶劑。顆粒物需要機械加工達(dá)到要求的粒徑大小，但要注意加工中是否引起受試物的分解和變性。如機械加工改變了受試物組成成分（由于過度摩擦產(chǎn)生高溫），受試物的組成要經(jīng)過檢測分析進(jìn)行確認(rèn)。需注意不要污染受試物。對于不能形成可吸入性的或不易形成粉末的顆粒材料不需要進(jìn)行試驗。磨損試驗是用來證明加工這些材料時不會產(chǎn)生呼吸性顆粒物。如果經(jīng)磨損試驗證實可產(chǎn)生呼吸性顆粒物，該被加工的材料應(yīng)當(dāng)進(jìn)行吸入毒性試驗。

5.2.4對照組

當(dāng)使用的受試物載體及陰性（僅吸入氣體）的有歷史背景數(shù)據(jù)時，一般不需要平行設(shè)置載體對照組或陰性（僅吸入氣體）對照組。

5.3 暴露條件的監(jiān)測

5.3.1 染毒裝置內(nèi)氣流

通過染毒柜的氣流速率需嚴(yán)格控制，可連續(xù)在線監(jiān)測記錄或每次暴露期間至少每小時監(jiān)測記錄一次。試驗所用空氣中受試物濃度（或其穩(wěn)定性）的監(jiān)測數(shù)據(jù)是對染毒系統(tǒng)中各個動力學(xué)參數(shù)作用的綜合結(jié)果，因此這些數(shù)據(jù)可提供控制制備動態(tài)空氣設(shè)備相關(guān)參數(shù)的間接方法。在口-鼻式染毒時，當(dāng)通過染毒系統(tǒng)的試驗氣體的氣流動力不足時，需注意動物的在染毒裝置內(nèi)是否發(fā)生重復(fù)吸入。已有確定在所選定的操作條件下不會發(fā)生重復(fù)吸入的方法。氧氣的濃度至少為19%；二氧化碳的濃度不超過1%。如果證實確實不能達(dá)到這個標(biāo)準(zhǔn)，需要測定并記錄試驗氣體中氧氣和二氧化碳的濃度。

5.3.2染毒裝置柜體內(nèi)溫度和相對濕度

染毒柜內(nèi)溫度維持在22℃±3℃?？?鼻式和全身暴露都需監(jiān)測記錄動物呼吸帶的相對濕度，在吸入染毒的4 h之內(nèi)至少3次；吸入染毒暴露期限較短的試驗可以每小時監(jiān)測記錄1次。理想的相對濕度需維持在30%～70%；但是有時很難達(dá)到（例如：受試物的水制備物），有時是受試物與測定方法發(fā)生干擾而無法測定。

5.3.3 受試物

5.3.3.1 理論濃度

無論何時都應(yīng)盡量記錄并計算染毒柜空氣中的理論濃度。理論濃度是指制備產(chǎn)生的受試物的量除以通過染毒系統(tǒng)的空氣總體積得到的參數(shù)。雖然理論濃度不是用來描述動物暴露特征，但是通過理論濃度與實際濃度進(jìn)行比較可以得到試驗系統(tǒng)制備效率的指征，從而可發(fā)現(xiàn)制備染毒空氣過程中存在的問題。

5.3.3.2 實際濃度

1）實際濃度是吸入染毒柜內(nèi)動物呼吸道中的受試物的濃度，可以通過特異性的方法（如吸附或化學(xué)反應(yīng)）直接采樣，然后進(jìn)行分析；或是通過非特異性的方法（如濾膜增重法）來獲得。單一成分的粉末、低揮發(fā)性液體的氣溶膠才能使用增重法，同時還需要專門預(yù)試驗數(shù)據(jù)的支持。對多成分的粉末氣溶膠也可以用增重分析法測量，但是這需要證實所制備的空氣與最初受試物的組成成分相似。如果沒有此類數(shù)據(jù)資料，則需在試驗期間按照規(guī)定的時間間隔對制備產(chǎn)生的空氣進(jìn)行再分析（理想的是染毒柜中的空氣）。對可揮發(fā)的或易升華的氣溶膠，需證實所用方法能收集到所有物體狀態(tài)的受試物。需在試驗報告中報告靶濃度（目標(biāo)濃度）、理論濃度和實際濃度，但只有實際濃度可用來計算致死濃度值。

2）盡量使用同一批試驗受試物。應(yīng)將試驗樣本保存在能維持純度、均勻性和穩(wěn)定性的條件下。開始試驗前對受試物的特征有充分的了解和描述，如純度、鑒別特征和鑒定出來的污染物和雜質(zhì)。這可用以下參數(shù)來證實，如保留時間、相對峰面積和通過質(zhì)譜、氣相色譜或其他的檢測方法得到的分子量，包括且不限于以上內(nèi)容。檢驗檢測機構(gòu)需要對委托方提供的受試物進(jìn)行必要的簡單描述（如顏色、物理狀態(tài)等）。

3）需盡可能的保持染毒空氣成分穩(wěn)定，可采用適當(dāng)?shù)姆治龇椒ㄟB續(xù)或間隔采樣監(jiān)測。間隔采樣時，吸入染毒4 h的試驗至少采樣2次。如果由于系統(tǒng)內(nèi)染毒空氣流量過低所限，或染毒濃度太低需采集較多的空氣樣本時而不能完全滿足連續(xù)或間隔采樣量的要求，可在整個暴露期內(nèi)只采集一次樣本。如果樣本之間出現(xiàn)明顯波動，進(jìn)行下一個濃度試驗時需在暴露期間采集4次樣本進(jìn)行分析?？諝飧鱾€樣本之間的濃度波動范圍規(guī)定，氣體和揮發(fā)性受試物不得超過平均濃度±10%，液體或固體氣溶膠不超過平均值的±20%。并需要計算柜內(nèi)空氣受試物達(dá)到95%平衡時的時間（T95）。一個暴露周期內(nèi)需要考慮到制備受試物空氣的時間和達(dá)到T95的時間。對組成非常復(fù)雜混合物的蒸氣/氣體、氣溶膠（如推動終端裝置設(shè)備產(chǎn)生的燃燒空氣和試驗物形成的）在染毒柜內(nèi)空氣中每一相成分物相各不相同，至少要選擇一個標(biāo)志性物質(zhì)來進(jìn)行分析，通常是受試制備物中處在某一物相（蒸氣/氣體或氣溶膠）的主要的活性物質(zhì)。如果試驗物質(zhì)是制劑（商品形式的產(chǎn)品）分析報告的濃度應(yīng)是制劑的總濃度，不是活性成分的或某成分的濃度。

5.3.3.3 顆粒物粒徑的分布

氣溶膠的粒徑大小需在染毒的4 h期間至少測定2次，方法是使用撞擊采樣器或其他替代的設(shè)備如空氣動力學(xué)粒徑儀等。如果撞擊時采樣器與替代的測定方法所得到的結(jié)果相同，在整個試驗期間的就可以使用替代的方法進(jìn)行監(jiān)測。后一種檢測方法，如濾膜增重或塵埃測定器/氣體發(fā)泡收集管等，與最初確定的測定方法進(jìn)行平行試驗，來驗證原來測定方法的收集效率。粒徑大小分析得到的質(zhì)量濃度應(yīng)與采用濾膜分析法得到的質(zhì)量濃度的一個合理的限度之內(nèi)。如果在試驗開始階段就證明兩種試驗方法的質(zhì)量濃度相同，就可以免去驗證性試驗。從動物福利方面考慮，需采取措施減少無確定結(jié)果的數(shù)據(jù)資料，因為這會要求重復(fù)進(jìn)行暴露試驗。如果空氣中的蒸氣受試物能發(fā)生凝結(jié)而形成氣溶膠，或者染毒蒸氣空氣中測定到顆粒物也就是暴露空氣存在潛在的混合相，需對這種受試物進(jìn)行粒徑的測定。

5.4 操作步驟

5.4.1正式試驗（main test）

5.4.1.1 每一步使用雌雄各3只動物，或6只敏感性別的動物。如果采用鼻式暴露時使用的嚙齒類動物不是大鼠，需要調(diào)整最長的暴露時間以減少動物種屬之間的差異?？蓮?個固定的起始濃度水平染毒，這個濃度應(yīng)能引起染毒動物中的某些動物出現(xiàn)毒性作用。氣體、蒸氣和氣溶膠的試驗步驟圖（見7試驗步驟流程圖）的濃度水平是第1類～4類的分級標(biāo)準(zhǔn)的界限值：氣體為（100、500、2500、20000 ppm/4 h）（見圖1）；蒸氣為（0.5、2、10、20 mg/L/4 h）（見圖2）；氣溶膠為（0.05、0.5、1、5 mg/L/4 h）（見圖3）。高于各相應(yīng)物態(tài)類別的上限濃度就歸為第5類。按照各自的試驗圖表來確定起始濃度。根據(jù)人道處死和動物死亡的數(shù)量，按照圖中的指示的箭頭來決定下一步的試驗，直到能對受試物作出毒性分級時結(jié)束試驗。

5.4.1.2 進(jìn)行下一個暴露濃度組試驗的時間間隔長短要根據(jù)毒性體征的發(fā)作時間、持續(xù)時間和嚴(yán)重程度來決定。決定進(jìn)行暴露下一個濃度水平需要直到前一個濃度水平的動物存活狀態(tài)完全確定下來后再進(jìn)行。建議的每個濃度水平之間的時間間隔為3至4天，這可以觀察到可能存在的遲發(fā)毒性。如出現(xiàn)的反應(yīng)不能確定，可適當(dāng)調(diào)整時間間隔的長短。

5.4.2  限度試驗（limit test）

5.4.2.1如已知或預(yù)期受試物幾乎無毒時可進(jìn)行限度試驗，如在超過規(guī)定的極限濃度值以上時才引起毒性反應(yīng)的受試物。受試物的毒性的信息可從已經(jīng)檢測的類似化合物、混合物或產(chǎn)物結(jié)果得到，此時要考慮到已知的具有毒理學(xué)意義的受試物的特性、混合物構(gòu)成的百分比等。在沒有或很少毒性信息的情況下，或者是估計受試物是具有毒性，需進(jìn)行正式試驗（可參考OECD指南39號）。

5.4.2.2 正常的操作程序下，使用每種性別3只動物，或使用6只敏感性別的動物，暴露水平分別是：氣體20000 ppm；蒸氣20 mg/L；粉塵/霧5 mg/L（如果技術(shù)可達(dá)到）。受試物制備成氣溶膠時，粒徑的大小需達(dá)到可呼吸性粒子的大?。ㄈ鏜MAD為1μm～4μm）。絕大部分的受試物都能在2 mg/L的濃度水平進(jìn)行試驗。如進(jìn)行高于2 mg/L濃度水平的氣溶膠試驗，受試物應(yīng)能夠制備成可呼吸性粒子大小。從動物福利方面考慮，不主張超過限度濃度的試驗。

5.4.2.3 只在有可能直接涉及到人類健康需要的情況下才進(jìn)行第5類染毒濃度水平（＞20000 ppm或mg/L）的試驗，并需在試驗報告中論述理由。對潛在爆炸性受試物試驗設(shè)計時要認(rèn)真研究避免引起發(fā)生爆炸的條件出現(xiàn)。為了避免不必要的使用動物，開始限度試驗前，需在染毒系統(tǒng)不放置動物的條件下進(jìn)行預(yù)試驗，以確認(rèn)染毒條件是否能達(dá)到限度試驗的水平。

5.4.3  觀察

5.4.3.1 暴露期間要對實驗動物經(jīng)常進(jìn)行臨床觀察。暴露染毒結(jié)束后的當(dāng)日至少要觀察2次，還可根據(jù)動物對染毒的反應(yīng)增加觀察次數(shù)；此后的14天內(nèi)至少每日觀察1次。觀察周期時長不是固定不變的，需要根據(jù)出現(xiàn)的臨床癥狀的特點、時間以及恢復(fù)期的長短決定。毒性反應(yīng)出現(xiàn)和消失的時間很重要，應(yīng)特別注意是否存在毒性體征延遲的傾向，對每只動物的所有的觀察都要分別作系統(tǒng)的記錄。

5.4.3.2 對處于瀕死的動物和表現(xiàn)出嚴(yán)重的疼痛和/或持續(xù)的嚴(yán)重痛苦的動物從動物福利考慮要人道的處死。對最初出現(xiàn)的微弱的毒性體征和由于暴露操作引起的短暫的呼吸道的異常改變等臨床體征要認(rèn)真分析區(qū)別，不要錯誤認(rèn)為這些都是染毒處理引起的毒性作用。要按照列在人道觀察終點的指南文件中“人道終點”的原則和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。對人道處死的或發(fā)現(xiàn)已經(jīng)死亡的動物處死和死亡時間要盡可能的準(zhǔn)確的記錄?；\外觀察包括動物皮膚和被毛、眼和粘膜、呼吸、循環(huán)、自主神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的改變，以及身體活動和行為方式等變化。盡可能的注意局部作用與系統(tǒng)作用之間的任何差別。關(guān)注點主要為顫動、抽搐、流涎、腹瀉、嗜睡、睡眠和昏迷。測定直腸溫度可辨別出是否存在因染毒或在染毒柜內(nèi)過度的限制造成的反射性呼吸過緩、體溫過低/過高。

5.4.4  體重

進(jìn)入實驗室適應(yīng)環(huán)境期間每只至少要稱重一次；染毒當(dāng)日開始試驗前（第0天）、染毒后的1、3、7天（此后每周記錄一次）、染毒第1天后死亡或進(jìn)行人道處死的動物進(jìn)行稱重。體重變化是判定毒性作用的指標(biāo)，并且對于體重持續(xù)低于染毒前體重的20%要給予密切觀察。試驗結(jié)束時存活動物稱量體重后并人道地處死。

5.4.5  病理學(xué)

所有實驗動物，包括試驗期間死亡的、人道處死的動物和動物福利考慮從試驗隊列中退出的，都需進(jìn)行大體解剖檢查。如果發(fā)現(xiàn)動物死亡后不能立即進(jìn)行解剖檢查，將死亡動物放入冰箱的冷藏箱內(nèi)低溫存放，以減少動物尸體的自溶分解。大體尸檢應(yīng)在死亡后1 d～2 d進(jìn)行。每只動物大體解剖所見的病理學(xué)改變都記錄，特別注意呼吸道出現(xiàn)的任何變化。其他輔助的檢查，包括可能對試驗結(jié)果做出解釋的檢查指標(biāo)，如測定存活大鼠的肺臟重量或者對呼吸道進(jìn)行顯微檢查以提供受試物刺激性的證據(jù)等。檢查的器官涉及到染毒后存活24 h以上的動物出現(xiàn)大體解剖學(xué)改變的器官、或者已知或預(yù)期可能受到影響的器官。全呼吸道的顯微組織學(xué)檢查為鑒定受試物是否與水發(fā)生反應(yīng)（如，酸和吸濕性的受試物反應(yīng)）提供非常有價值的信息。

 

6、  數(shù)據(jù)和試驗報告

6.1  數(shù)據(jù)

需提供每只動物的體重、大體解剖檢查所見的全部資料。臨床觀察的數(shù)據(jù)需要總結(jié)成表格的形式以體現(xiàn)出每個試驗組使用的動物數(shù)、出現(xiàn)特異性毒性體征的動物數(shù)、試驗期間死亡或人道處死的動物數(shù)、每只動物的死亡時間、詳細(xì)描述毒性作用的發(fā)生、發(fā)展的時間進(jìn)程和體征的可逆性；大體解剖所見。

6.2  試驗報告

試驗報告需包括以下信息:

1）實驗動物和飼養(yǎng)條件:

— 飼養(yǎng)籠具的描述：每籠動物的數(shù)量（或動物變化的數(shù)量）、墊料、環(huán)境溫度、相對濕度、光照周期、飼料合格認(rèn)證資料；

— 使用的動物種屬和品系，不使用大鼠進(jìn)行試驗的論證依據(jù)；

— 動物的數(shù)量、周齡和性別；

— 隨機選擇分組的方法；

— 動物食物、飲水的質(zhì)量（包括飼料的類型/來源和供水的來源）；

— 試驗前的所有的包括飼料、檢疫、疾病的處理等描述。

2）受試物:

— 物理性狀、純度、相關(guān)的理化性質(zhì)（包括同分異構(gòu)體）；

— 受試物特征性數(shù)據(jù)和化學(xué)文摘（CAS）注冊號（如果已知）。

3）載體:

— 如果不是用水作為載體，所用的載體是什么，對采用這種載體的理由作出論述；

— 載體的歷史背景數(shù)據(jù)或所使用的載體不會干擾試驗結(jié)果的數(shù)據(jù)資料。

4）吸入染毒裝置:

— 吸入染毒裝置的介紹，包括大小尺度和體積；

— 除了描述制備染毒空氣操作外，還需動物暴露所用設(shè)備及其來源進(jìn)行描述；

— 測定氣溫、濕度、粒徑大小和實際濃度的儀器設(shè)備；

— 空氣的來源、空氣供給/解壓處理、調(diào)節(jié)供給條件所使用的系統(tǒng)；

— 確保試驗空氣均勻所使用的調(diào)節(jié)設(shè)備和方法；

— 壓差（正壓或負(fù)壓）；

— 每個吸入裝置動物暴露孔的數(shù)量（口-鼻式裝置）；每個染毒裝置的動物數(shù)（全身染毒設(shè)備）；

— 試驗時空氣中受試物的均勻性、穩(wěn)定性；

— 溫度和濕度感受器、采樣孔所在的部位；

— 空氣流速，包括口-鼻式固定孔處的空氣流速、全身染毒柜內(nèi)放置動物處的空氣流速；

— 如果測定了空氣中氧氣和二氧化碳需要提供所用設(shè)備的信息；

— 達(dá)到吸入染毒柜空氣濃度穩(wěn)定平衡的時間（T95）；

— 每小時空氣體積更換次數(shù)；

— 計量儀器設(shè)備。

5）暴露數(shù)據(jù):

— 正式試驗中選擇設(shè)定靶濃度的理由（基本原理）；

— 理論濃度（制備的試驗物質(zhì)進(jìn)入到吸入染毒設(shè)備的總量除以通過染毒柜空氣的總體積）；

— 從動物呼吸道中采樣測得的受試物的實際濃度；對于不同物態(tài)的混合物受試物（氣體、蒸氣和氣溶膠），需分別對每一物態(tài)進(jìn)行測定；

— 報告中所有的空氣濃度都用質(zhì)量單位（如mg/L，mg/m3等）或體積單位（如ppm、ppb）來表示；

— 顆粒物粒徑大小的分布用MMAD和GSD來表示，同時列出得到此參數(shù)數(shù)值的計算過程。應(yīng)在報告中記錄每個檢測到的粒徑大小的數(shù)據(jù)。

6）試驗條件:

— 受試物制備的詳細(xì)操作，包括固態(tài)物質(zhì)被制備成為直徑更小的顆粒物或制備成溶液的詳細(xì)操作過程；如機械加工時改變了受試物的組成成分，還要提交加工后受試物組成成分的檢測分析的結(jié)果；

— 制備試驗空氣所用設(shè)備和制備動物染毒時所用空氣的操作的描述（可以用示意圖表示）；

— 所用化學(xué)分析方法的詳細(xì)描述和分析方法可靠性的詳細(xì)描述（包括空氣媒介樣本中受試物的回收率）；

—設(shè)置染毒濃度的基本原理。

7）結(jié)果:

— 列表表示染毒裝置內(nèi)空氣環(huán)境的溫度、濕度和流速；

— 列表表示染毒空氣中理論濃度、實際濃度數(shù)據(jù)；

— 列表表示顆粒粒徑大小的數(shù)據(jù)，包括樣本的采集測試方法、粒徑大小的分布、MMAD及GSD的計算等；

— 列表表示動物出現(xiàn)毒性反應(yīng)的數(shù)據(jù)和每只動物暴露濃度水平（如死亡率、性質(zhì)、嚴(yán)重程度和作用的持續(xù)時間等毒性體征的動物數(shù)量）；

— 試驗中測得的每只動物的體重、計劃試驗結(jié)束人道處死前動物死亡的日期和時間、毒性體征出現(xiàn)的時間和過程，以及每只動物出現(xiàn)的毒性體征是否是可逆的等；

— 每只動物大體解剖和組織病理學(xué)檢查（如果進(jìn)行了組織學(xué)檢查）所見；

— 受試物按照急性吸入毒性分級屬于哪類和LC50界限值。

8）討論和結(jié)果分析:

— 需要特別強調(diào)的是需要描述是否達(dá)到本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的參考值范圍，如限度濃度試驗和顆粒粒徑大小的規(guī)定；

— 應(yīng)根據(jù)總體調(diào)查結(jié)果處理顆粒的可吸入性，尤其是當(dāng)無法滿足顆粒尺寸標(biāo)準(zhǔn)時；

— 對測定理論濃度和實際濃度所采用的方法的一致性進(jìn)行評價；并對整個試驗過程中都要涉及到的理論濃度與實際濃度的相互關(guān)系進(jìn)行評價；

— 對動物可能的死亡原因和主要的作用機制（是系統(tǒng)毒性或局部毒性）作出分析估測；

— 如果因為動物疼痛、或表現(xiàn)出嚴(yán)重的持久的痛苦狀態(tài)而被人道處死，要根據(jù)OECD人道終點標(biāo)準(zhǔn)的指導(dǎo)文件作出解釋說明。

 

7、  實驗步驟流程圖

圖1：各初始?xì)怏w濃度應(yīng)遵循的試驗程序（ppm/4 h）

對于每一種起始?xì)怏w濃度，本圖中所列的相應(yīng)檢測方案概述了應(yīng)遵循的試驗程序。根據(jù)實施人道處死或死亡動物的數(shù)量，試驗程序遵循箭頭指示。

圖1a:起始濃度為100 ppm

圖1b:起始濃度為500 ppm

圖1c:起始濃度為2500 ppm

圖1d:起始濃度為20000 ppm

圖1a：氣體的起始濃度為100 ppm/4 h的試驗程序

圖1b：氣體的起始濃度為500 ppm/4 h的試驗程序

圖1c：氣體的起始濃度為2500 ppm/4 h的試驗程序

圖1d：氣體的起始濃度為20000 ppm/4 h的試驗程序

 

圖2：蒸氣的各起始濃度應(yīng)遵循的程序（mg/L/4 h）

對于每一個起始?xì)怏w濃度，本圖中所列的相應(yīng)檢測方案概述了應(yīng)遵循的試驗程序。根據(jù)實施人道處死或死亡動物的數(shù)量，試驗程序遵循箭頭指示。

圖2a:起始濃度為0.5 mg/L

圖2b:起始濃度為2.0 mg/L

圖2c:起始濃度為10 mg/L

圖2d:起始濃度為20 mg/L

圖2a：蒸汽的起始濃度為0.5 mg/L/4 h的試驗程序

圖2b：蒸汽的起始濃度為2 mg/L/4 h的試驗程序

圖2c：蒸汽的起始濃度為10 mg/L/4 h的試驗程序

圖2d：蒸汽的起始濃度為20 mg/L/4 h的試驗程序

圖3：粉塵和霧的各起始濃度應(yīng)遵循的程序（mg/L/4 h）

對于每一個起始?xì)怏w濃度，本圖中所列的相應(yīng)檢測方案概述了應(yīng)遵循的試驗程序。根據(jù)實施人道處死或死亡動物的數(shù)量，試驗程序遵循箭頭指示。

圖3a:起始濃度為0.05 mg/L

圖3b:起始濃度為0.5 mg/L

圖3c:起始濃度為1 mg /L

圖3d:起始濃度為5 mg /L

 

圖3a：粉塵和霧的起始濃度為0.05 mg/L/4 h的試驗程序

                            圖3b：粉塵和霧的起始濃度為0.5 mg/L/4 h的試驗程序

圖3c:粉塵和霧的起始濃度為1 mg/L/4 h的試驗程序

圖3d：粉塵和霧的起始濃度為5 mg/L/4 h的試驗程序

 

急性吸入毒性試驗急性毒性分級法起草說明

 

為配合《化妝品新原料注冊備案資料管理規(guī)定》的實施，有必要建立與其相適應(yīng)的化妝品原料急性吸入毒性試驗-急性毒性分級的試驗方法，從而為化妝品原料的安全性評估提供技術(shù)保障，中國食品藥品檢定研究院組織起草了《急性吸入毒性試驗急性毒性分級法》（征求意見稿）。現(xiàn)就起草的有關(guān)情況說明如下：

 

一、起草的必要性

隨著我國在2021年2月發(fā)布《化妝品新原料注冊備案資料管理規(guī)定》，針對化妝品新原料，要求提供相應(yīng)的毒理學(xué)安全性評價資料、安全風(fēng)險評估資料等內(nèi)容?；瘖y品原料種類眾多，接觸或進(jìn)入人體的方式多種多樣，有經(jīng)皮、經(jīng)口、經(jīng)過粘膜、經(jīng)過呼吸道等多種方式，產(chǎn)生的潛在安全影響均需要全面評價，以確保化妝品原料在注冊、備案的過程中的安全性得到充分的關(guān)注，從而為化妝品的安全應(yīng)用奠定堅實的技術(shù)基礎(chǔ)。

通過噴灑等方式使用的化妝品原料及產(chǎn)品，如具有香氛、除臭等功能的原料或產(chǎn)品，常?？赏ㄟ^吸入的方式進(jìn)入體內(nèi)，因此，盡快完善相應(yīng)原料的安全評價技術(shù)方法，具有重要的現(xiàn)實意義。

國際經(jīng)濟合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）基于科學(xué)技術(shù)的發(fā)展、管理規(guī)定及動物福利等方面的考慮，于1981年公布實施了急性吸入毒性測試導(dǎo)則（OECD 403），由于在2001年公布實施了急性經(jīng)口毒性分級法（TG 423）后，才考慮編制相應(yīng)的急性吸入毒性分級法（Acute toxic class, ATC）。對急性吸入毒性分級法（ATC）數(shù)據(jù)質(zhì)量的回顧性評估表明該方法非常適合與對化學(xué)物的毒性分級和產(chǎn)品標(biāo)簽規(guī)定的需要。2009年9月OECD公布實施了化學(xué)品測試導(dǎo)則NO.436（2009）《急性吸入毒性試驗：急性毒性分級法》，對急性吸入毒性的試驗原則、方法、數(shù)據(jù)和試驗報告、附錄等內(nèi)容進(jìn)行了規(guī)定。2012年7月，中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局、中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會發(fā)布了中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《化學(xué)品急性吸入毒性試驗急性毒性分級法》GB/T 28648-2012，對化學(xué)品急性吸入毒性試驗急性毒性分級法的適用范圍，原則、方法、數(shù)據(jù)、報告等內(nèi)容進(jìn)行了規(guī)定，其中核心的主要內(nèi)容是針對化學(xué)品的急性吸入毒性進(jìn)行分級。

2021年，我國發(fā)布了《化妝品新原料注冊備案資料管理規(guī)定》，對化妝品新原料注冊備案資料要求進(jìn)行了明確規(guī)定。因此，對化妝品原料的急性吸入毒性進(jìn)行分級評價，對未來化妝品原料的安全狀況、適用范圍、使用形式等都具有重要的參考意義，值得盡快將該類技術(shù)評價方法予以完善。

 

二、起草原則與思路

查閱國內(nèi)外關(guān)于化學(xué)品急性吸收毒性的試驗方法，重點針對OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則NO.436（2009）《急性吸入毒性試驗：急性毒性分級法》、中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《化學(xué)品急性吸入毒性試驗急性毒性分級法》GB/T 28648-2012中規(guī)定的相關(guān)內(nèi)容，對相應(yīng)的試驗方法進(jìn)行比對、分析，進(jìn)而轉(zhuǎn)化，建立適用于化妝品原料安全性評價的急性吸入毒性試驗急性毒性分級法。在建立急性毒性吸入毒性試驗急性毒性分級試驗方法時，明確了該方法適應(yīng)于化妝品原料評價的適用范圍，對試驗?zāi)康?、實驗原則、實驗方法中涉及的試驗動物、吸入染毒裝置、暴露監(jiān)測、試驗操作、試驗觀察、組織病理學(xué)結(jié)果、試驗數(shù)據(jù)及報告等內(nèi)容，進(jìn)行了詳細(xì)梳理和規(guī)定，起草了《急性吸入毒性試驗急性毒性分級法》（征求意見稿）。

 

三、主要內(nèi)容

（一）適用范圍

關(guān)于《急性吸入毒性試驗急性毒性分級法》適用范圍的問題，通過對OECD化學(xué)品測試導(dǎo)則NO.436（2009）《急性吸入毒性試驗：急性毒性分級法》、中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《化學(xué)品急性吸入毒性試驗急性毒性分級法》GB/T 28648-2012中相關(guān)內(nèi)容的研究、分析，從試驗方法的角度而言，該方法主要適用于原料急性毒性的分級，OECD和國標(biāo)都是適用于“化學(xué)品”，也即是歸屬于化學(xué)品的原料。關(guān)于該方法在化妝品領(lǐng)域的適用性問題，也召開過專題討論會，專家認(rèn)為，從急性吸入毒性分級試驗設(shè)置的目的來看，也只能是針對化妝品原料，只有原料才有必要對相應(yīng)的急性吸入毒性進(jìn)行分級，化妝品產(chǎn)品不存在急性吸入毒性分級的問題。因此，在該方法的適用范圍方面，還是確定該方法適用于化妝品原料的急性吸入毒性分級評價，并且認(rèn)為該方法適用于單一成分的原料，對非單一成分的原料，若應(yīng)用該方法進(jìn)行評價，需要提供更多的科學(xué)實驗數(shù)據(jù)來證明其可行性。

（二）實驗動物

根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)、動物倫理要求和試驗指導(dǎo)原則對試驗動物的種類、性別、周齡、體重、數(shù)量、飼養(yǎng)條件、適應(yīng)性飼養(yǎng)時間等條件進(jìn)行規(guī)定，并根據(jù)急性吸入毒性試驗的特點對普通試驗動物和敏感試驗動物的性別和數(shù)量進(jìn)行了特殊規(guī)定，即常規(guī)一般是每性別3只動物，或只使用敏感性別動物6只。

（三）吸入染毒途徑的選擇

根據(jù)試驗方法對中受試物可能的吸入途徑進(jìn)行了規(guī)定，吸入途徑包括僅頭部暴露、鼻部暴露和鼻口部暴露三種吸入模式，一般首選口-鼻式染毒。

（四）暴露染毒的控制和監(jiān)測

暴露條件是確保暴露染毒穩(wěn)定可控的關(guān)鍵，涉及暴露染毒時間、受試物制備、受試物顆粒粒徑分布、受試物載體配制的選擇、對照動物的設(shè)置等多個方面，該方法都進(jìn)行了相應(yīng)的規(guī)定。

在滿足暴露條件的前提下，如何對暴露情況進(jìn)行監(jiān)測，是確保后期染毒結(jié)果的核心，包括對染毒裝置氣流速率的嚴(yán)格控制，需連續(xù)在線監(jiān)測記錄或暴露期間至少每小時監(jiān)測記錄一次等，另外，還需要控制染毒裝置的相對溫度、濕度等，均是確保監(jiān)測結(jié)果能符合要求的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

（五）試驗操作要求

正式試驗一般每步使用雌雄各3只動物，或6只敏感性別動物。根據(jù)不同的受試物狀態(tài)，如氣體、蒸汽或氣溶膠，可根據(jù)附件中的試驗步驟圖，采用不同的起始濃度開展相應(yīng)的試驗。

（六）試驗結(jié)果采集

染毒后對試驗動物的觀察和試驗結(jié)果采集是確保試驗結(jié)果科學(xué)、可靠的關(guān)鍵。因此，方法規(guī)定了暴露染毒后，試驗觀察的頻率、周期、毒性體征的觀察記錄、動物人道主義處理的要求、試驗動物的體重、組織病理學(xué)的要求等各項內(nèi)容。

（七）試驗報告

試驗報告要求具體詳實，包括實驗動物、受試物、載體、吸入裝置、暴露數(shù)據(jù)、試驗條件、試驗結(jié)果等各個方面的內(nèi)容。

 

四、技術(shù)路線

 

 

體外皮膚變態(tài)反應(yīng)  U937細(xì)胞激活試驗

U937 cell line activation Test

（征求意見稿）

 

1、   范圍

本方法規(guī)定了體外皮膚變態(tài)反應(yīng)U937細(xì)胞激活試驗的基本原則、要求和方法。

本方法適用于化妝品用化學(xué)原料潛在致敏性的評價。

 

2、   試驗?zāi)康?/span>

本試驗用于檢測體外培養(yǎng)的人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞表面標(biāo)記物CD86的表達(dá)，以評價受試物引起皮膚變態(tài)反應(yīng)的可能性。

 

3、   定義

3.1  70%細(xì)胞存活率濃度值  70% cell viability（CV70）

受試物染毒后，細(xì)胞存活率為70%時對應(yīng)的受試物濃度值。

3.2  刺激指數(shù)  stimulation index（S.I.）

與溶劑對照相比，扣除同型對照后流式細(xì)胞儀測定的受試物陽性細(xì)胞相對強度值。

3.3  CD86有效作用濃度值  Effective Concentration 150（EC150）

CD86的相對熒光強度值達(dá)到150時對應(yīng)的受試物濃度值。

 

4、   試驗的基本原則

當(dāng)致敏物質(zhì)接觸皮膚后，樹突狀細(xì)胞在移動到淋巴器官的過程中分化成熟，并上調(diào)一系列表面分子的表達(dá)。體外培養(yǎng)類樹突狀細(xì)胞：人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞，并和受試物共暴露48h后，使用熒光抗體染料對細(xì)胞表面分子CD86染色并用流式細(xì)胞儀測定，從而評價受試物是否具有致敏性。

 

5、   試劑

5.1  細(xì)胞

選用人組織細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞（The human histiocytic lymphoma cell line，U937細(xì)胞）。細(xì)胞使用前應(yīng)進(jìn)行穩(wěn)定性檢測。推薦使用clone CRL1593.2細(xì)胞株。

5.2  培養(yǎng)基

RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清、適量抗生素，配制成1640完全培養(yǎng)基。

5.3  染色緩沖液

磷酸鹽緩沖液中加入5%的胎牛血清。

5.4  染料和抗體類物質(zhì)

7-氨基放線素菌-D染料（7-AAD）

FITC標(biāo)記的小鼠單克隆CD86抗體（FITC-CD86）

FITC標(biāo)記的小鼠IgG1（FITC- IgG1）

 

6、   試驗方法

6.1  細(xì)胞準(zhǔn)備

6.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

U937懸浮細(xì)胞使用1640完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。細(xì)胞復(fù)蘇一周并通過穩(wěn)定性檢測后可開展試驗。細(xì)胞最大培養(yǎng)濃度不超過2×106個/ mL，復(fù)蘇后使用不超過6周，傳代次數(shù)不超過21代。

6.1.2 細(xì)胞穩(wěn)定性檢測

細(xì)胞復(fù)蘇兩周后，選用松香酸（AA）或2,4,6-三硝基苯磺酸作為陽性對照，乳酸（LA）作為陰性對照。當(dāng)細(xì)胞可以準(zhǔn)確對陽性物質(zhì)和陰性物質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定區(qū)分時視為通過穩(wěn)定性檢測。

6.2  受試物處理

溶劑：完全培養(yǎng)基（優(yōu)先選擇）或二甲基亞砜（DMSO）

受試物儲備液：第一次運行至少選擇6個濃度。于試驗前一天制備，應(yīng)用1640完全培養(yǎng)基配制0.4 mg/mL的受試物溶液，或者應(yīng)用DMSO配制50 mg/mL的受試物溶液。由于沒有進(jìn)行劑量測定，因此在第一次運行時，應(yīng)在相應(yīng)的溶劑中配制6種系列濃度儲備液（最終濃度為1、10、20、50、100和200µg/mL）。

受試物工作液：于試驗當(dāng)天制備，用完全培養(yǎng)基配制的受試物溶液可以直接使用，用DMSO配制的受試物溶液需用完全培養(yǎng)基稀釋125倍得到工作溶液。將工作液等體積加入細(xì)胞懸液中進(jìn)行染毒，即最終細(xì)胞接觸濃度是工作液濃度再稀釋2倍。

連續(xù)運行的濃度選擇：基于第一次運行的結(jié)果選擇至少4個第二次運行的濃度，任何后續(xù)運行的濃度都是基于之前所有運行的單個結(jié)果來選擇。由于濃度間隔設(shè)置較小會影響濃度效應(yīng)，所以建議以下推薦使用的最終濃度(單位:µg/mL)進(jìn)行試驗: 1 – 2 – 3 – 4 – 5 – 7.5 – 10 – 12.5 –15 –20 – 25 – 30 – 35 – 40 – 45 – 50 –60 – 70 – 80 – 90 – 100 – 120 – 140 – 160 – 180 – 200。

如果以上濃度無法測得受試物的70%細(xì)胞存活率濃度值（70% cell viability，CV70），可以進(jìn)行濃度調(diào)整。但受試物最終細(xì)胞接觸濃度最高不超過200µg /mL；如果CD86的陽性值在1ug/mL，則對0.1ug/mL進(jìn)行評估，以確認(rèn)不會導(dǎo)致CD86超過陽性閾值的受試物的濃度；DMSO最終接觸濃度不得超過0.4%。

選擇標(biāo)準(zhǔn)：至少2個濃度與前一次試驗相同；確認(rèn)非細(xì)胞毒性下的最高CD86陰性濃度;確認(rèn)所有非細(xì)胞毒性CD86陽性濃度；確認(rèn)最低細(xì)胞毒性濃度；在EC150(或最高陰性非細(xì)胞毒性濃度)和CV70(或溶解度評估允許的最高濃度)之間均勻選擇其他所需濃度；若前兩次運行有差異，盡可能選擇多的共同濃度；若存在干擾，需重新選擇陽性濃度。

6.3  對照物處理

培養(yǎng)基對照、溶劑對照（與受試物同法稀釋）、陽性對照松香酸（DMSO溶解，最終濃度50µg/ml）、陰性對照LA（完全培養(yǎng)基溶解，最終濃度200µg/mL），每種對照需要準(zhǔn)備三對復(fù)孔。

6.4  細(xì)胞鋪板及染毒

以3 x105個/ml細(xì)胞傳代培養(yǎng)2天或以1.5 x105個/ml傳代培養(yǎng)3天后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個/ml，取100µL/孔受試物工作液和100µL/孔細(xì)胞懸液1:1混合接種于96孔無菌平板中，每種條件下一對復(fù)孔，一孔用于CD86染色，一孔用于IgG1同型對照染色。每次CD86表達(dá)檢測均需設(shè)置培養(yǎng)基對照、溶劑對照、陽性對照、陰性對照各三對復(fù)孔（當(dāng)使用培養(yǎng)基作為溶劑時，溶劑對照與培養(yǎng)基相同），用密封帶蓋住板，在37±2°C，5±1%CO2，≥95%濕度下培養(yǎng)孵育45±3小時。

6.5  CD86表達(dá)檢測

孵育結(jié)束后，檢查并確定溶解度（若在顯微鏡下觀察到晶體或液滴，則會產(chǎn)生干擾）。

用排槍將細(xì)胞吹兩下從96孔平板對應(yīng)移至V型板中，離心棄上清；

用100µL冰冷染色緩沖液清洗一次，然后在100µL染色緩沖液中重懸細(xì)胞；

用7-AAD染色細(xì)胞（5µL/孔，10min室溫，避光）；

用100µL冰冷染色緩沖液清洗一次，然后在100µL染色緩沖液中重新懸浮細(xì)胞；

用FITC標(biāo)記的抗CD86或小鼠IgG1（5µL/孔，30min，4°C，避光）染色細(xì)胞；

用100µL冰冷染色緩沖液清洗兩次；

用100µL冰冷PBS清洗一次；

在冰冷PBS中再懸浮細(xì)胞（96孔板中100µL或流式管中200µL）。

注意：整個染色操作應(yīng)在冰上進(jìn)行，在每一個洗滌步驟中，不要通過反復(fù)的移液來重懸細(xì)胞，而是在棄去上清液后通過短暫的渦旋來分散細(xì)胞即可。

用流式細(xì)胞儀對每組細(xì)胞的細(xì)胞存活率及CD86陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行測定。分別以下用公式計算出受試物的細(xì)胞存活率（CV70）和受試物的細(xì)胞刺激指數(shù)（S.I.）。

V1：大于70%最小細(xì)胞活性值

V2：小于70%最大細(xì)胞活性值

C1（μg/mL）：V1對應(yīng)的受試物濃度

C2（μg/mL）：V2對應(yīng)的受試物濃度

CD86+%：CD86陽性細(xì)胞百分比

6.6  流式細(xì)胞儀檢測

繪制SSC/FSC散點圖，調(diào)節(jié)儀器電壓，圈出U937細(xì)胞群P1門；繪制7-AAD直方圖，圈出活細(xì)胞P2門；繪制FITC/SSC散點圖，放置十字門，分析細(xì)胞表面標(biāo)記物CD86的表達(dá)。通過獲取完全培養(yǎng)基/ IgG1孔表達(dá)值，設(shè)置FITC/SSC十字門分析標(biāo)記，以便在可能的情況下，所有三個或至少兩個完全培養(yǎng)基對照的IgG1位于0.6至0.9%區(qū)域內(nèi)；如果這無法實現(xiàn)，則設(shè)置分析標(biāo)記，使一個完全培養(yǎng)基對照的IgG1在0.6至0.9%，另一個完全培養(yǎng)基對照的IgG1在0.9%至1.5%；如果這仍然無法實現(xiàn)，則IgG1數(shù)據(jù)分布太廣，必須放棄運行。之后在不移動分析標(biāo)記的情況下，測量每個孔中IgG1陽性細(xì)胞或CD86陽性細(xì)胞的百分比。

細(xì)胞顯示在大小(FSC)和粒度(SSC)的散點圖中，設(shè)置為對數(shù)比例（Log），以便清楚地識別第一門R1門中的（population）細(xì)胞群和消除碎片。

設(shè)置流式細(xì)胞儀，每孔獲得P1門細(xì)胞10000個或包括死亡細(xì)胞在內(nèi)的多達(dá)20,000個細(xì)胞，或在分析開始后一分鐘內(nèi)獲取數(shù)據(jù)。

 

7、   結(jié)果評價

7.1 試驗成立條件

7.1.1 完全培養(yǎng)基對照細(xì)胞平均存活率> 90%；至少兩個完全培養(yǎng)基對照的IgG1≥ 0.6且< 1.5%；若丟棄一個完全培養(yǎng)基對照的離群值后，剩下的兩個完全培養(yǎng)基對照的校正后的CD86表達(dá)值應(yīng)高于或低于其平均值的25%；完全培養(yǎng)基對照校正后的CD86基礎(chǔ)表達(dá)值≥ 2%且≤ 25%。

7.1.2 DMSO溶劑對照的平均存活率> 90%；若丟棄一個DMSO對照的異常值后，剩下的兩個DMSO對照的校正后的CD86表達(dá)值應(yīng)高于或低于其平均值的25%；丟棄異常值后，DMSO溶劑對照CD86 S.I.的平均值小于250%。

7.1.3 陽性對照三對復(fù)孔中至少兩個為陽性(CD86 S.I.≥ 150)，必要時配制陽性對照系列濃度，應(yīng)存在劑量反應(yīng)。

7.1.4 陰性對照三對復(fù)孔中至少有兩個為陰性(CD86 S.I. < 150%)，且細(xì)胞活性≥ 70%。

7.2 致敏性結(jié)果判定

每種受試物至少進(jìn)行兩次獨立的CD86表達(dá)檢測試驗。每種受試物表達(dá)檢測試驗，如果CD86 S.I.僅在最高非細(xì)胞毒性濃度下高于150%，則在第一次試驗中無法判定。每次表達(dá)檢測試驗，如果CD86 S.I.在所有非細(xì)胞毒性濃度下低于150%，且無干擾（溶解度、顏色、細(xì)胞毒性），則該次CD86表達(dá)判定為陰性；如果CD86 S.I.高于150%，不論有無劑量反應(yīng)和/或干擾，則該次CD86表達(dá)均判定為陽性。如果兩次試驗CD86表達(dá)結(jié)果一致，則可判定該受試物是否具有致敏性；如果兩次試驗CD86表達(dá)不具有一致性，則需進(jìn)行第三次試驗。如果第一次試驗無法判定，第二次與第三次結(jié)果不一致，則需進(jìn)行第四次試驗。最終的預(yù)測將基于三次或四次單獨運行的結(jié)果來綜合判定。

7.3 有效作用濃度計算

對于判定具有致敏性的物質(zhì)，進(jìn)一步計算其有效作用濃度值（Effective Concentration，EC），選用以下公式計算CD86的有效作用濃度值（EC150）。

S.I.1: S.I.< 150（EC150）最低刺激指數(shù)值

S.I.2: S.I.≥ 150（EC150）最低刺激指數(shù)值

C1（μg/mL）: S.I.1對應(yīng)的受試物濃度

C2（μg/mL）: S.I.2對應(yīng)的受試物濃度

8、   結(jié)果解釋 

本試驗結(jié)果能預(yù)測受試物的致敏性，但需應(yīng)用合適的整合測試和評估方法（IATA）進(jìn)一步評價受試物的致敏性，這些結(jié)果在有限的范圍內(nèi)外推到人類。

 

體外皮膚變態(tài)反應(yīng)U937細(xì)胞系激活試驗

起草說明

 

為加強化妝品的監(jiān)督管理，進(jìn)一步提高化妝品使用安全性，中國食品藥品檢定研究院組織開展了體外皮膚變態(tài)反應(yīng)U937細(xì)胞系激活試驗方法的起草工作?，F(xiàn)就起草工作有關(guān)情況說明如下：

 

一、起草原則

試驗要求和規(guī)定逐步與國際接軌，對于已經(jīng)比較成熟的、被多數(shù)國家和組織認(rèn)可的方法，原則上予以接受。對某些內(nèi)容進(jìn)行具體化和明確化，在盡量提高可操作性的同時，兼顧了技術(shù)發(fā)展的前瞻性。本方法制定過程中還注意了科學(xué)性和合理性、協(xié)調(diào)性和有效性，以及通俗性和規(guī)范性之間的關(guān)系。

 

二、起草過程

本研究由化妝品標(biāo)準(zhǔn)專家委員會于2018年立項，課題組在研究和分析國內(nèi)外相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，對9種推薦物質(zhì)進(jìn)行了方法驗證，并委托三家實驗室進(jìn)行實驗室間驗證，根據(jù)實驗室驗證過程和結(jié)果起草了試驗方法文本。

 

三、與我國已有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中用于檢測皮膚變態(tài)反應(yīng)的方法包括：皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗、皮膚變態(tài)反應(yīng)：局部淋巴結(jié)試驗:DA（LLNA:DA）、皮膚變態(tài)反應(yīng)：局部淋巴結(jié)試驗:BrdU-ELISA(LLNA: BrdU-ELISA)、化妝品用化學(xué)原料體外皮膚變態(tài)反應(yīng)：直接多肽反應(yīng)試驗(DPRA)。其中皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗、LLNA:DA、LLNA: BrdU-ELISA均使用動物（豚鼠、小鼠）進(jìn)行試驗；DPRA方法針對皮膚變態(tài)反應(yīng)AOP中的第一個關(guān)鍵分子事件進(jìn)行檢測。U937細(xì)胞系激活試驗（U-SENSTM）針對皮膚變態(tài)反應(yīng)AOP中的第三個關(guān)鍵分子事件進(jìn)行檢測。未來該方法可以應(yīng)用在皮膚致敏評價的整合策略中，進(jìn)一步提高替代試驗方法的準(zhǔn)確性和特異性。

本研究建立了皮膚變態(tài)反應(yīng)的替代試驗方法，以期與國際標(biāo)準(zhǔn)接軌，與《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中皮膚變態(tài)反應(yīng)檢測方法在技術(shù)上形成互補，建立我國動物實驗替代方法體系，增補、修訂和完善現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)與規(guī)范方法以及促進(jìn)我國未來的化妝品安全評價體系提供技術(shù)支持。

 

四、與國際同類標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系

2016年該方法通過歐盟替代方法驗證中心科學(xué)咨詢委員會（ESAC）獨立同行評議，2018年，經(jīng)濟合作和發(fā)展組織（OECD）正式發(fā)布U-SENS™方法的操作指南（OECD-442E），將其用于化學(xué)物質(zhì)皮膚致敏性的安全評價。

本方法涵蓋了OECD 2018年正式發(fā)布的“皮膚致敏反應(yīng)有害結(jié)局通路中關(guān)于樹突狀細(xì)胞活化的關(guān)鍵事件的體外試驗方法操作指南：U937細(xì)胞系激活試驗”（OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS In Vitro Skin Sensitisation assays addressing the Key Event on activation of dendritic cells on the Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation ANNEXⅡ:U937 CELL LINE ACTIVATION TEST (U-SENS™)）的要求，基本操作和OECD U-SENS™方法一致，具體變動內(nèi)容包括： 

（1）OECD方法中的陽性對照為“2,4,6-三硝基苯磺酸”屬于危險化學(xué)品，因此，在本試驗中增加陽性對照物質(zhì)“松香酸”。

（2）在標(biāo)準(zhǔn)中對操作方法進(jìn)行細(xì)化，如“鋪板過程混勻防止細(xì)胞沉降”“輕輕渦旋清洗細(xì)胞”，以提高方法的可操作性。

各項技術(shù)內(nèi)容的依據(jù)來源自O(shè)ECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS  In Vitro Skin Sensitisation assays addressing the Key Event on activation of dendritic cells on the Adverse Outcome Pathway for Skin SensitisationANNEXⅡ:U937 CELL LINE ACTIVATION TEST (U-SENS™)（OECD 《化學(xué)品測試指南》TG 442E，2018年），基本涵蓋了其對采用對象、實驗操作和結(jié)果分析的技術(shù)要求，并通過試驗確認(rèn)。

 

五、實驗室驗證結(jié)果

本方法實驗室內(nèi)驗證結(jié)果和OECD參考值范圍均一致；委托3家單位對方法進(jìn)行實驗室間驗證。所有單位對8種化學(xué)物的定性預(yù)測結(jié)果均一致；4家實驗室對8種OECD參考物質(zhì)的定量檢測結(jié)果（CV70、EC150）與OECD TG 442E附表中規(guī)定范圍相比，準(zhǔn)確率均為為100%。

 

化妝品禁用原料目錄增補表

序號	中文名稱	英文名稱
1286	比馬前列素	Bimatoprost（CAS No. 155206-00-1）
1287	拉坦前列素	Latanoprost（CAS No. 130209-82-4）
1288	他氟前列素	Tafluprost（CAS No.209860-87-7）
1289	他氟乙酰胺	Tafluprost ethyl amide，(5Z)-7-{(1R,2R,3R,5S)-2-[(1E)-3,3-Difluoro-4-phenoxy-1-buten-1-yl]-3,5-dihydroxycyclopentyl}-N-ethyl-5-heptenamide（CAS No. 1185851-52-8）
1290	曲伏前列素	Travoprost（CAS No. 157283-68-6）