考察了預(yù)灌裝注射器在隔離系統(tǒng)汽化過氧化氫(VHP) 滅菌過程中的容器密封完整性，并對其潛在風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行探討。將金黃色葡萄球菌菌液加至預(yù)灌裝注射器中，按無菌檢查的方式置隔離器中，采用已驗(yàn)證的無菌檢查VHP 滅菌方式進(jìn)行表面滅菌，同時以紫外(UV) 滅菌作為對照試驗(yàn)，對經(jīng)2 種滅菌方式處理的預(yù)灌裝注射器內(nèi)容物進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，VHP 滅菌方式下，部分企業(yè)使用的預(yù)灌裝注射器容器密封完整性被破壞，內(nèi)容物中的金黃色葡萄球菌死亡率高達(dá)90％。表明此類預(yù)灌裝注射器在進(jìn)行VHP 滅菌方式的無菌檢查時，VHP 會透過包裝系統(tǒng)進(jìn)入內(nèi)部，滅活待測樣品中可能存在的微生物。
無菌檢查隔離器是為無菌檢查提供無菌環(huán)境的一種設(shè)備，通常采用汽化過氧化氫(vaporized hydrogen peroxide，VHP) 滅菌的方式進(jìn)行待檢樣品的表面滅菌。無菌檢查隔離器滅菌完成后，艙體內(nèi)部環(huán)境的微生物負(fù)載應(yīng)符合A 級空氣潔凈度要求，對其滅菌效果的評價包括物品表面的滅菌效果、對物品及待測樣品內(nèi)部微生物的影響程度和滅菌殘留物對物品及待測樣品微生物的影響程度[1]。無菌產(chǎn)品的包裝系統(tǒng)具有防止內(nèi)容物損失、微生物侵入、影響產(chǎn)品質(zhì)量的氣體( 氧氣、空氣、水蒸氣等) 或其他物質(zhì)進(jìn)入的能力，其包裝完整性即容器密封完整性(container closure integrity，CCI) 應(yīng)符合相關(guān)規(guī)定。
為保證無菌產(chǎn)品的質(zhì)量和安全，各國藥監(jiān)部門和機(jī)構(gòu)組織不斷升級更新藥品包裝完整性的監(jiān)管要求和法規(guī)指南，在產(chǎn)品的國際注冊和認(rèn)證過程中，越來越注重包裝完整性對無菌保障的影響，目的是通過科學(xué)和先進(jìn)的技術(shù)手段來確保產(chǎn)品整個生命周期的安全有效性[2]。本研究主要關(guān)注隔離系統(tǒng)中的VHP 滅菌對樣品包裝完整性的影響情況?！吨腥A人民共和國藥典》2020 年版(ChP 2020) 無菌檢查用隔離系統(tǒng)驗(yàn)證和應(yīng)用指導(dǎo)原則(9206) 在關(guān)于隔離系統(tǒng)的應(yīng)用中明確列出“包裝完整性驗(yàn)證”，提到滅菌劑對某些包裝物會產(chǎn)生不利影響，建議用化學(xué)和微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)測試包裝物對滅菌劑滲透的抵制能力。滅菌劑對包裝物產(chǎn)生不利影響的樣品，其內(nèi)部微生物的生長可能會被抑制，存在假陰性風(fēng)險(xiǎn)[3]?，F(xiàn)有研究表明，由于VHP 具有極強(qiáng)的氧化性，呼吸袋、單層聚乙烯(PE) 袋在進(jìn)行VHP 滅菌時均可被穿透[4]。
預(yù)灌裝注射器通常為小容量注射劑無菌藥品的包裝密封形式，以專用灌裝機(jī)將藥液直接灌裝在針管中，針管前端有預(yù)先裝好針頭和保護(hù)針頭的塑料針帽，針管灌裝入藥液后，再用可與推桿配合連接的彈性活塞加塞密封[5]。預(yù)灌裝注射器在生產(chǎn)過程中進(jìn)行了嚴(yán)格的CCI 檢查和控制，但在進(jìn)行無菌檢查時，表面滅菌的循環(huán)過程是在一定的艙體壓力和強(qiáng)氧化性氣體VHP 的共同作用下進(jìn)行的，存在CCI 被破壞的可能性[6]。VHP 可能會穿透膠塞，進(jìn)入包裝內(nèi)部，最終影響供試品中低水平微生物污染的檢出結(jié)果。
因此，本試驗(yàn)選取3 家企業(yè)使用的預(yù)灌裝注射器，灌裝確定濃度和體積的菌液作為生物指示劑，經(jīng)VHP 滅菌后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)以確認(rèn)微生物的存活情況，以期為此類產(chǎn)品的無菌檢查及挑戰(zhàn)性試驗(yàn)研究提供參考。
1、儀器與試藥
CH-4123 型無菌檢查隔離器( 瑞士SKAN AG 公司) ；KB720 型生化培養(yǎng)箱( 德國BINDER 公司) ；電DMXD-0.36 型熱脈動真空滅菌器( 山東新華制藥醫(yī)療器械股份有限公司) ；1300 系列A2 型生物安全柜( 美國Thermo Fisher Scientific 公司)。
胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基( 批號20200618) 和胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基( 批號20200618) 均購于美國BD 公司；0.9％氯化鈉注射液( 石家莊四藥有限公司，規(guī)格500 ml，批號1905033202) ；生物指示劑( 美國TOOSKA 公司，批號G0601) ；預(yù)灌裝注射器(A、B、C，分別來自不同企業(yè))。
金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，CMCC(B)26003，中國食品藥品檢定研究院醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心，菌株傳代數(shù)為第Ⅲ代]。
2、方法與結(jié)果
2.1無菌檢查隔離器VHP 滅菌效果的確認(rèn)
采用SCAN 無菌檢查隔離器進(jìn)行VHP 滅菌效果確認(rèn)。滅菌時VHP 高濃度約為1.24×10–3，滅菌完成通風(fēng)結(jié)束后，VHP 濃度為0。在隔離器的腔體內(nèi)放入VHP 滅菌化學(xué)指示卡和生物指示劑( 嗜熱脂肪地芽孢桿菌，生物指示劑布點(diǎn)位置見圖1)。
圖1 生物指示劑布點(diǎn)圖
滅菌過程初始化參數(shù)：相對濕度(RH) ≤20.0％ ；溫度<40.0 ℃ ；過氧化氫溶液濃度 50.0％～50.7％ ；過氧化氫每泵投料速率 4.0 ～ 5.0 g/min。
隔離器參數(shù)：時間參數(shù)(開始30 s，初始化100 s，補(bǔ)氣7 200 s，負(fù)壓補(bǔ)氣7 200 s，緊急模式300 s，檢漏保壓300 s，泄露測量60 s) ；加藥參數(shù)( 主加藥70 g，再加藥7 g，加藥次數(shù)11) ；隔離器允許泄露值 435 ml/min ；綜合允許泄露量 435 ml/min。
參照ChP 2020 四部通則9207，根據(jù)化學(xué)指示卡是否變色、生物指示劑滅菌后是否下降3 ～ 6 個對數(shù)值來驗(yàn)證表面滅菌效果。結(jié)果顯示，滅菌后化學(xué)指示卡全部變色；布點(diǎn)位置1 ～ 27 的生物指示劑經(jīng)胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(55 ℃ ) 培養(yǎng)7 d 后，均無菌生長，符合藥典要求；而陽性對照( 沒有經(jīng)過滅菌的生物指示劑) 有菌生長，即表明設(shè)定的滅菌參數(shù)能夠保證隔離器內(nèi)的無菌環(huán)境。
2.2金黃色葡萄球菌挑戰(zhàn)試驗(yàn)
2.2.1 菌液制備
使用0.9％氯化鈉注射液制備一定濃度的金黃色葡萄球菌菌液，使每1 ml 菌液中的含菌量為30 ～ 100 cfu。
2.2.2 培養(yǎng)基的適用性檢查
所有培養(yǎng)基均在驗(yàn)證合格的滅菌程序下滅菌，并按ChP 2020 四部通則1105 微生物計(jì)數(shù)法進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，結(jié)果均符合要求。
2.2.3 微生物計(jì)數(shù)
選取A、B、C 3 種不同的預(yù)灌裝注射器，每種10 支。將制備好的菌液以抽吸的方式定量灌入注射器。根據(jù)預(yù)灌裝注射器的刻度標(biāo)識，灌裝不同體積的菌液，其中注射器A 每支灌裝菌液0.8 ml，注射器B 和注射器C 每支灌裝菌液1 ml。灌裝完成時，取A、B、C 3 種預(yù)灌裝注射器各10 支進(jìn)行零時計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示，A、B、C 3 種預(yù)灌裝注射器零時的微生物計(jì)數(shù)結(jié)果平均值(n=10) 分別為65、82、76 cfu，RSD 分別為10.4％、7.8％、9.9％。
2.3VHP 對預(yù)灌裝注射器中菌液的影響
取A、B、C 3 種預(yù)灌裝注射器各40 支，隨機(jī)選取A、B、C 3 種預(yù)灌裝注射器各20 支作為第1組(A-1、B-1、C-1)，另外20 支作為第2 組(A-2、B-2、C-2)。將第1 組放入隔離器進(jìn)行VHP 滅菌；同時將第2 組置生物安全柜中，紫外(UV) 照射滅菌30 min，作為對照組。6 h 后VHP 滅菌過程結(jié)束，將2 組分別計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，A-1、B-1、C-1組的微生物平均值(n=20) 分別為52、83、8 cfu，RSD 分別為13.6％、14.8％、161％，總數(shù)分別為1 038、1 668、171 cfu ；A-2、B-2、C-2 組的微生物平均值(n=20) 分別為55、82、80 cfu，RSD 分別為13.0％、13.2％、10.5％，總數(shù)分別為1 093、1 644、1 597 cfu。
圖2 金黃色葡萄球菌挑戰(zhàn)試驗(yàn)的菌落計(jì)數(shù)對比圖
根據(jù)上述結(jié)果，繪制微生物計(jì)數(shù)結(jié)果的均值對比圖( 圖2)，觀察到A 和B 2 種預(yù)灌裝注射器在經(jīng)VHP 滅菌循環(huán)后，菌液計(jì)數(shù)結(jié)果的總數(shù)和平均值與零時數(shù)據(jù)及對照組均無顯著差異。但是，預(yù)灌裝注射器C 在經(jīng)歷VHP 滅菌循環(huán)后，微生物計(jì)數(shù)結(jié)果的總數(shù)和平均值與零時數(shù)據(jù)及對照組相比，顯著降低，絕對值約為零時和對照組的1/10，其內(nèi)部微生物致死率約為90％。表明預(yù)灌裝注射器C 的容器密封完整性與預(yù)灌裝注射器A 和B 存在顯著性差異。A、B 2 種預(yù)灌裝注射器在該VHP 滅菌循環(huán)條件下，菌液計(jì)數(shù)結(jié)果顯示滅菌前后的菌液濃度基本無變化，說明在此過程中VHP 未能穿透膠塞，或穿透較少，未影響其內(nèi)部微生物活性。而預(yù)灌裝注射器C 在該表面滅菌循環(huán)條件下，菌液計(jì)數(shù)結(jié)果顯示滅菌后的菌液濃度顯著降低，表明在該表面滅菌循環(huán)過程中，VHP 穿透了包裝系統(tǒng)，預(yù)灌裝注射器C 的容器密封完整性被破壞，最終影響了內(nèi)部微生物的狀態(tài)。
此外，隔離器VHP 滅菌過程中，艙體內(nèi)的壓力也會對滅菌劑的滲透有一定影響，壓力較大時，VHP 的穿透力較正常壓力下會更大。本試驗(yàn)中采用的SCAN 無菌隔離器在整個表面滅菌循環(huán)中，具體的壓力值情況為泄露測試50 ～ 130 Pa，預(yù)消毒準(zhǔn)備、預(yù)消毒、消毒起效過程、負(fù)壓補(bǔ)氣、補(bǔ)氣( 通風(fēng))均為50 ～ 70 Pa，整個過程的壓力值都處在較高水平，可能在一定程度上促進(jìn)了滅菌劑的滲透。
3、討論
3.1挑戰(zhàn)性試驗(yàn)菌的選擇
嗜熱脂肪地芽孢桿菌對VHP 的耐受程度較高，常作為滅菌循環(huán)驗(yàn)證的生物指示劑。同時，金黃色葡萄球菌是制藥生產(chǎn)環(huán)境和檢驗(yàn)環(huán)境的一種常見微生物，具有一定的代表性，因此，選擇金黃色葡萄球菌作為挑戰(zhàn)性試驗(yàn)菌進(jìn)行容器密封完整性考察，以區(qū)分不同品牌預(yù)灌裝注射器密封完整性的優(yōu)劣。
3.2假陽性和假陰性
在無菌檢查過程中，本研究做了大量工作以確保沒有假陽性情況的發(fā)生，避免樣品污染，如采取過度消毒的方式等。但是，在過度追求避免假陽性的同時，會增大假陰性的發(fā)生概率，作為安全性檢查試驗(yàn)，假陰性的出現(xiàn)比假陽性的風(fēng)險(xiǎn)和產(chǎn)生的危害更大。
在使用無菌檢查用隔離器進(jìn)行無菌檢查的過程中，常遇到的假陰性情況包括殘留滅菌劑的影響和表面滅菌過程中包裝完整性被破壞，試驗(yàn)用培養(yǎng)基過度滅菌使?fàn)I養(yǎng)被破壞以及方法適用性試驗(yàn)沒有充分消除產(chǎn)品的抑菌作用[7]。為避免出現(xiàn)前2 種假陰性情況，可采取的措施有：①改用密封完好的包裝方式或采用耐受性的包裝材料；②改變VHP 滅菌參數(shù)，在保證表面徹底滅菌的前提下，降低滅菌劑的濃度或縮短表面滅菌周期。
總之，沒有一種“表面滅菌循環(huán)”適合所有種類的待測樣品，滅菌方法的選擇應(yīng)基于具體情況綜合考慮，針對存在二次滅菌風(fēng)險(xiǎn)的樣品，應(yīng)實(shí)施“定制方案”，針對每一種樣品進(jìn)行相關(guān)的表面滅菌循環(huán)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并對相應(yīng)的表面滅菌循環(huán)進(jìn)行充分驗(yàn)證。同時，應(yīng)評估樣品是否適合在隔離器中進(jìn)行無菌檢查，對于不適合的樣品可以選擇傳統(tǒng)的B+A潔凈室進(jìn)行無菌檢查。
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