藥物的溶出度試驗是膠囊劑質(zhì)量控制的重要指標之一，目前進行體外溶出試驗是各國藥典中檢驗膠囊劑溶出度的一種手段。明膠膠囊在膠囊劑中應用最多。但是由于明膠膠囊原材料、填充物和貯存條件等因素，會出現(xiàn)明膠交聯(lián)現(xiàn)象。此類明膠膠囊在進行體外溶出試驗中會出現(xiàn)崩解和溶出遲緩的現(xiàn)象，不能反映膠囊劑的實際溶出度，導致不能正確地控制明膠膠囊劑的質(zhì)量。本文對明膠膠囊的交聯(lián)現(xiàn)象及體外溶出試驗中該問題的解決方案和研究進行綜述。
1.明膠膠囊交聯(lián)現(xiàn)象
1.1.明膠
明膠是一種水溶性蛋白質(zhì)混合物，由皮膚、韌帶、肌腱中的膠原經(jīng)酸或堿部分水解或在水中煮沸制得。按生產(chǎn)方式分類，可分為酸法明膠(A型明膠)、堿法明膠(B型明膠)和酶法明膠。其中B型明膠產(chǎn)量最高。3種明膠可以單獨使用，也可以混合使用，得到的明膠性質(zhì)有所不同，如B型明膠穩(wěn)定性比A型明膠強，而A型明膠可塑性強，透明度高。使用明膠制備的膠囊，凍力強度越高， 在水中崩解所用時間越長。
明膠含有18種氨基酸，主要的氨基酸含量為：甘氨酸25.5%、脯氨酸18.0%、羥脯氨酸14.1%、谷氨酸11.4%、丙氨酸8.5%、精氨酸8.5%、賴氨酸4.1%、亮氨酸3.2%、纈氨酸2.5%。
1.2.明膠膠囊交聯(lián)現(xiàn)象
明膠膠囊交聯(lián)現(xiàn)象指明膠囊殼在貯存過程中發(fā)生交聯(lián)反應，使制劑在不加酶的溶出介質(zhì)中的崩解、溶出、釋放效率降低的現(xiàn)象。實驗表明，發(fā)生交聯(lián)現(xiàn)象的膠囊在人體內(nèi)未發(fā)生部分不溶現(xiàn)象，但是在進行體外溶出試驗時，膠囊發(fā)生交聯(lián)部分表現(xiàn)為橡膠質(zhì)脹大的水不溶膜，從而阻止藥物的釋放。其主要原因是由于明膠自身發(fā)生交聯(lián)反應，即明膠中賴氨酸、精氨酸的側(cè)鏈氨基被氧化，生成醛基，并與其他氨基發(fā)生胺縮醛反應。Duconseille等對明膠膠囊的交聯(lián)反應原理進行了綜述，但仍有部分交聯(lián)方式的原理未確定。其中賴氨酸的交聯(lián)率最高，其生成的交聯(lián)鍵也最穩(wěn)定。此外，天然提取明膠中存在的微量醛和藥物以及藥用輔料中的含醛物也會與賴氨酸、精氨酸的氨基發(fā)生胺縮醛反應，形成交聯(lián)明膠。
使用常規(guī)溶出條件對明膠交聯(lián)膠囊進行體外溶出試驗，并繪制溶出曲線，溶出曲線表明交聯(lián)膠囊會出現(xiàn)溶出延遲現(xiàn)象。這種現(xiàn)象導致的溶出延遲一般出現(xiàn)在溶出試驗初始時間段。由于人體胃液的環(huán)境與體外溶出環(huán)境不同，胃液中含有酶，此溶出延遲現(xiàn)象對于體內(nèi)溶出并沒有參考意義。
2.影響明膠膠囊囊殼交聯(lián)的因素
2.1.囊內(nèi)交聯(lián)
2.1.1.囊殼處方因素
囊殼處方是決定囊殼交聯(lián)的主要因素：(1)明膠的選擇：明膠的交聯(lián)程度主要是受明膠中氨基酸的殘基量影響，明膠中賴氨酸和精氨酸的含量越低，則交聯(lián)發(fā)生程度和可能性越低。(2)囊殼的含水量：囊殼中含水量高時，可以加快明膠的氧化，使亞胺中間體的產(chǎn)生加快。(3)增塑劑：甘油和山梨醇等增塑劑會使明膠的自氧化作用增強。(4)遮光劑和著色劑：加入的遮光劑和著色劑可能誘導醛類分子產(chǎn)生，從而與明膠發(fā)生胺縮醛反應。(5)鐵離子：膠囊中含有鐵離子，使氨基酸經(jīng)芬頓化學反應，生成羥基自由基(OH)，羥基自由基氧化氨基酸的氨基和中心碳原子，導致明膠交聯(lián)，但鐵離子含量對交聯(lián)現(xiàn)象的影響不能確定。(6)鐵離子和鋁離子：Fe3+除催化羥基自由基生成外，F(xiàn)e3+和Al3+能與明膠游離的羥基形成配合物。
2.1.2.充填物處方因素
充填物處方是明膠囊內(nèi)交聯(lián)的主要因素：(1)藥物：含有醛基的藥物與明膠殘基發(fā)生反應，使明膠發(fā)生交聯(lián)。(2)藥用輔料：加入的輔料中含有防腐劑、脂肪類物質(zhì)或聚氧乙烯類化合物等，均有可能促使明膠發(fā)生交聯(lián)。
2.1.3.貯存條件
膠囊應貯存在溫度15~25℃，相對濕度30%~40%，陰涼干燥避光處貯存。當溫度升高時，膠囊的交聯(lián)程度明顯提高，而在溫度不變時，相對濕度變化對膠囊交聯(lián)程度的影響較小。
2.2.囊外交聯(lián)
由于膠囊外部因素引起的膠囊交聯(lián)現(xiàn)象屬于囊外交聯(lián)。膠囊貯存環(huán)境中含有微量醛類，使膠囊外部與醛類發(fā)生交聯(lián)反應。Colgan等針對囊外交聯(lián)現(xiàn)象，在膠囊包裝中添加活性炭，吸附包裝中的少量甲醛，減少膠囊交聯(lián)現(xiàn)象。與未添加活性炭的包裝明膠膠囊對比，在高溫潮濕地區(qū)環(huán)境中，該包裝中明膠膠囊更穩(wěn)定。
3.體外溶出試驗中明膠膠囊交聯(lián)現(xiàn)象的解決方案及研究
3.1.添加蛋白酶
目前體外溶出試驗均使用脫氣去離子水，根據(jù)樣品的不同調(diào)整pH，添加適量的表面活性劑，從而促進藥物的溶出。但是此方法不足以模擬胃液的環(huán)境。Meyer等認為現(xiàn)有的溶出方式存在極大的缺陷，需要在溶出介質(zhì)中添加蛋白酶，從而能夠更真實地模擬胃液的環(huán)境。蛋白酶能夠切斷明膠分子中交聯(lián)反應產(chǎn)生的酰胺鍵，因此可以加速高度交聯(lián)的明膠水解，從而消除明膠膠囊交聯(lián)導致的體外溶出延遲現(xiàn)象。由于膠囊交聯(lián)現(xiàn)象的影響，USP對溶出度測定項進行了修訂，部分試驗的溶出介質(zhì)中加入蛋白酶，進行二級試驗來驗證。但是其他藥典均未在溶出度項加入添加酶試驗項，若膠囊劑樣品出現(xiàn)囊殼交聯(lián)現(xiàn)象，易被判定為不合格。
Clair等根據(jù)USP<711>中的二級溶出試驗系統(tǒng)，即添加酶和不添加酶系統(tǒng)部分，對交聯(lián)后的膠囊和未交聯(lián)膠囊進行了溶出度試驗。結(jié)果表明，即便是交聯(lián)程度很高的硬膠囊，在添加酶的溶出介質(zhì)中進行試驗，得到的溶出曲線與未交聯(lián)膠囊在未加酶的溶出介質(zhì)中的溶出曲線有高度一致性。但其并未對溶出介質(zhì)中添加酶的最佳條件進行試驗。
USP溶出度<711>中提出使用的蛋白酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶。胃蛋白酶在pH為2時活性最高，當pH<1.5或>4.5時，活性明顯降低。木瓜蛋白酶選擇的最佳pH為6.0~7.0，但是底物為明膠時最佳pH為5.0，當pH<2.8時，活性明顯下降。菠蘿蛋白酶一般在pH為5.0~7.0時使用，在pH為3.0~6.5時，菠蘿蛋白酶與底物結(jié)合后，其活性將不受到pH影響。胰蛋白酶在pH為 6.0~8.0時具有良好的活性，但在酸性和強堿性環(huán)境將迅速失活。USP溶出度<711>修訂建議對于溶出度試驗的溶出介質(zhì)添加酶的條件給出了建議。胃蛋白酶建議pH≤4.0，木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶建議4.0≤pH≤6.8，胰蛋白酶建議pH≥6.8。
添加酶雖然能夠解決明膠膠囊的交聯(lián)問題，但是目前部分品種藥物的溶出試驗中，為增加藥物的溶解度加入了表面活性劑，而酶對環(huán)境條件較為敏感，溶出介質(zhì)不同，酶的活性也不同。在建立添加蛋白酶的溶出方法時，需要確保溶出環(huán)境適合藥物溶出，同時要確保蛋白酶有足夠的活性以切除交聯(lián)明膠產(chǎn)生的肽鍵，使交聯(lián)膠囊的溶出與未交聯(lián)膠囊的溶出行為一致。
Guzman等就胃蛋白酶分別在含十二烷基硫酸鈉(SDS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)和吐溫-80 4 種表面活性劑的溶出介質(zhì)中的活性進行了實驗。結(jié)果表明，添加SDS會降低胃蛋白酶的活性，即使低濃度SDS仍會明顯降低其活性。而添加任意濃度的CTAB、Triton X-100 和吐溫-80 均不會影響胃蛋白酶的活性。Guncheva等對胰蛋白酶進行相似研究，結(jié)果為非離子型表面活性劑(吐溫-80和Triton X-100)能夠增強胰蛋白酶的活性，而離子型表面活性劑(SDS和CTAB)會抑制其活性，因此在添加胰蛋白酶的體外溶出試驗中建議使用非離子型表面活性劑。關于表面活性劑對溶出介質(zhì)中木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶活性的影響研究尚未見報道。
目前對于出現(xiàn)明膠交聯(lián)現(xiàn)象的膠囊劑，即溶出試驗中不能正常崩解，膠囊表現(xiàn)為橡膠質(zhì)脹大的水不溶膜，可參照USP溶出度<711>添加酶，解決體外溶出試驗中交聯(lián)膠囊溶出延遲問題，正確控制膠囊劑的質(zhì)量。
3.2.模擬胃部機械運動
USP溶出度方法中包括幾種生理學因素，如溶解介質(zhì)的pH和組成，表面活性劑和酶。但是目前各國藥典的溶出方法仍不能體現(xiàn)動態(tài)和復雜的體內(nèi)環(huán)境。除了添加酶外，胃部的動態(tài)環(huán)境也可能對交聯(lián)明膠的崩解產(chǎn)生一定影響。
Gao開發(fā)了一種新的溶出裝置，能更加真實地模擬體內(nèi)環(huán)境，結(jié)構(gòu)見圖1。由于胃部會進行收縮，該溶出裝置通過下方樣品托盤伸縮來模擬胃部收縮，上方使用探針施加恒定的力(約 0.01 g)，來探測膠囊的膨脹或收縮變化，并且可以防止膠囊浮動。底部添加磁力攪拌器，使溶出介質(zhì)流動。實驗結(jié)果表明通過調(diào)整伸縮力的大小和方式，可與USP溶出度二法結(jié)果達到基本一致，并同時監(jiān)測膠囊表面的收縮變化。實驗中通過對交聯(lián)軟膠囊施加較為復雜的力變化，并未促使膠囊溶出加快，且膠囊未直接崩解，藥物逐步釋放，溶出時間也較慢。
該研究表明復雜的胃部收縮運動對于交聯(lián)軟膠囊的崩解影響有限，仍需要添加適量蛋白酶，從而解決膠囊崩解延遲的問題。但為解決人體溶出條件和現(xiàn)有溶出條件相差較大的問題，新溶出方法的設計需要生理學相關的條件，以便體外試驗可以更接近人體內(nèi)的實際狀態(tài)，此新裝置為新溶出方法的的建立提供了一定的基礎。
4.小結(jié)與展望
明膠膠囊交聯(lián)現(xiàn)象廣泛存在于各類明膠膠囊劑中，使現(xiàn)有溶出裝置不能正確反映交聯(lián)膠囊的溶出度。USP針對此現(xiàn)象最先提出了解決指導意見。目前已有較多針對添加酶對溶出結(jié)果的研究，并且建立了部分藥物的新溶出方法，使交聯(lián)膠囊溶出度結(jié)果與未交聯(lián)膠囊保持一致，為新溶出方法修訂提供了理論支撐。各國藥典在修訂時，建議參考USP<711>以及現(xiàn)有關于交聯(lián)明膠膠囊的研究，制定更為符合實際溶出條件的新方法。但是目前的溶出條件仍然與體內(nèi)溶出條件相差較大，開發(fā)更加接近體內(nèi)溶出環(huán)境的新方法，對藥物產(chǎn)品開發(fā)、質(zhì)量評價和生物相關性評價有重要作用。
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