多肽藥物作為分子量介于小分子化學(xué)藥物和生物大分子之間的藥物類型，為藥物化學(xué)家提供了更多的選擇，近些年來(lái)也成為研究熱點(diǎn)。本文針對(duì)多肽藥物有關(guān)物質(zhì)（肽相關(guān)雜質(zhì)1）分析方法開(kāi)發(fā)進(jìn)行探討。
多肽分子是由多個(gè)氨基酸通過(guò)肽鍵（酰胺鍵）連接而形成的化合物，其有以下幾個(gè)特點(diǎn)：
多肽藥物分子量較大，如多肽類明星藥物索馬魯肽（司美格魯肽）分子量為4114Da，雖低于大分子藥物，但分子量是小分子藥物的數(shù)倍。分子量的增加使其在色譜行為上有了一些重要的變化，如其對(duì)溶劑強(qiáng)度更加敏感，B%的微小變化會(huì)引起保留時(shí)間的快速變化，另外其在流動(dòng)相中的擴(kuò)散也更慢，會(huì)導(dǎo)致柱效的降低和峰寬的增加2；
多肽分子存在高級(jí)結(jié)構(gòu)。多肽鏈通過(guò)α螺旋和β折疊等方式形成二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，有其特殊的三維結(jié)構(gòu)形式。由于分子體積和三維結(jié)構(gòu)，使得所有的氨基酸不會(huì)同時(shí)接觸固定相，只有位于表面的殘基才可以產(chǎn)生相互作用；
多肽分子通過(guò)酰胺鍵相連，酰胺鍵有部分雙鍵性質(zhì)，互變的順?lè)串悩?gòu)體可能會(huì)使峰型變差；
多肽分子為兩性分子，具備酸性基團(tuán)羧基和堿性基團(tuán)氨基，有其特定的等電點(diǎn)。
多肽藥物雜質(zhì)譜十分復(fù)雜，如CDE發(fā)布的《合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（以下簡(jiǎn)稱指導(dǎo)原則）中提到的，合成多肽分子有多種類型的工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)，特別是差相肽雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與主成分非常接近，色譜行為也相近，大大增加了分離分析的難度。
針對(duì)多肽分子上述特點(diǎn)，其在有關(guān)物質(zhì)分析方法開(kāi)發(fā)上也有一些特殊之處。多肽藥物有關(guān)物質(zhì)分析的常用方法是高效液相色譜法，可采用反相色譜、離子交換色譜和體積排阻色譜等模式。
1、反相色譜法（RP）：
1.1 色譜柱的選擇：上文中提到的多肽分子在流動(dòng)相中擴(kuò)散慢的特點(diǎn)，在色譜柱選擇時(shí)需要找著重考慮。
硅膠載體機(jī)械強(qiáng)度高，技術(shù)成熟穩(wěn)定，可選擇性高；
由于多肽分子緩慢擴(kuò)散的特點(diǎn)，在表面多孔型硅膠顆粒上，溶質(zhì)分子只進(jìn)入顆粒表面的硅膠層，在顆粒中走過(guò)的路徑更短，減少了顆粒內(nèi)部擴(kuò)散，因此在該類型顆粒上引起的譜帶展寬更小，見(jiàn)圖1。小粒徑色譜柱也有助于解決譜帶展寬和柱效降低的問(wèn)題，雖然粒徑越小，柱壓會(huì)大大提高，但多肽分子在粒徑減小上的收益要高于小分子化合物。同樣，選擇窄徑柱也減少在色譜柱縱向擴(kuò)散時(shí)的譜帶展寬。
圖13，全多孔與表面多孔顆粒傳質(zhì)路徑對(duì)比
常見(jiàn)的10nm，12nm孔徑的色譜柱可以滿足大多數(shù)多肽的分析，允許多肽分子進(jìn)入顆粒內(nèi)部孔隙。
烷基鍵合相，特別是C18是目前最常用的固定相類型，同樣用于多肽藥物的分析，但各種類型的苯基柱可提供不同的選擇性，特別是對(duì)含有酪氨酸等芳香結(jié)構(gòu)殘基的多肽。另外一些表面修飾，封端/不封端，嵌合基團(tuán)的色譜柱也可提供不同的選擇性。
目前市場(chǎng)上有諸多廠家，不同工藝和類型的反相色譜柱，品類繁多，而在方法探索階段需要嘗試不同選擇性的色譜柱，可借鑒一些表征方法，如使用H、S、A、B、C參數(shù)的Snyder/Dolan法，或通過(guò)USP或供應(yīng)商網(wǎng)站查找選擇性差異大的色譜柱；另外使用自動(dòng)化、智能的方法開(kāi)發(fā)軟件可大大節(jié)約開(kāi)發(fā)時(shí)間，更適用于多肽有關(guān)物質(zhì)方法開(kāi)發(fā)。
1.2 流動(dòng)相的選擇：
三氟乙酸是多肽分析時(shí)常用的緩沖液，有良好的緩沖能力，且和多肽的氨基形成離子對(duì)作用，增加保留，常用濃度為0.1%（V/V）；
磷酸鹽是最常用的反相色譜緩沖鹽，可以配置成不同的pH，高濃度的磷酸鹽如50mmol/L可以提供較高的離子強(qiáng)度，減輕因多肽分子相互排斥造成的峰型展寬；離液劑如六氟磷酸鹽和高氯酸鈉等，不僅可以提高離子強(qiáng)度，改變選擇性，且在乙腈水中的溶解度更高。
多肽做為兩性物質(zhì)，流動(dòng)相pH的變化對(duì)分離有深遠(yuǎn)的影響，因此pH的篩選非常重要；需要注意的是多肽分子在等電點(diǎn)附近溶解度最低，應(yīng)避開(kāi)等電點(diǎn)pH至少±1.0個(gè)單位。
乙腈作為有機(jī)相（B%）有其明顯的優(yōu)點(diǎn)，紫外吸收低，粘度低，峰型優(yōu)于醇類溶劑等。醇類溶劑（甲醇、異丙醇），可以少量加入提供不同的選擇性；
前文中提到多肽分子對(duì)有機(jī)相B%敏感，微量變化可以導(dǎo)致保留時(shí)間明顯改變，因此需要設(shè)置梯度程序時(shí)需緩慢增加B%，達(dá)到最佳分離；
1.3 其他色譜參數(shù)：
高柱溫降低流動(dòng)相粘度，提高分子擴(kuò)散速度，改善峰型，以及選擇性的變化，提高分離度，還能解決順?lè)椿プ儺悩?gòu)峰型差的問(wèn)題，這也是多肽分析的一個(gè)特點(diǎn)，如圖2的案例。需要注意的是如果使用高柱溫需要對(duì)柱前流動(dòng)相進(jìn)行預(yù)熱2，高柱溫也有一些缺點(diǎn)，如樣品降解和色譜柱壽命下降。
圖22柱溫對(duì)多肽分子分離度的影響
多肽缺少共軛結(jié)構(gòu)，一般選擇末端吸收波長(zhǎng)210nm~220nm，即酰胺鍵的吸收；雖然有些多肽含苯丙氨酸等芳環(huán)側(cè)鏈的氨基酸，但吸收強(qiáng)度明顯低于末端吸收。
保證稀釋液的pH和溶劑強(qiáng)度與初始流動(dòng)相相同或接近，避免產(chǎn)生溶劑效應(yīng)；
超高效液相色譜儀是多肽藥物分析的首選，部分高效液相也可能滿足性能要求。
2、離子交換色譜法（IEC）
由于多肽藥物有豐富的雜質(zhì)譜，很多時(shí)候僅僅使用反相色譜無(wú)法滿足雜質(zhì)分析研究的目的，離子交換色譜法提供了不同的分離選擇性，可以作為反相色譜法的有效補(bǔ)充。
2.1流動(dòng)相的選擇：
緩沖液調(diào)控流動(dòng)相pH，進(jìn)而改變樣品的電離程度，影響保留和選擇性。對(duì)于多肽藥物，流動(dòng)相pH一般至少控制在等電點(diǎn)±1個(gè)pH單位。陽(yáng)離子交換流動(dòng)相pH至少低于等電點(diǎn)1個(gè)pH單位；陰離子交換，流動(dòng)相pH至少高于等電點(diǎn)1個(gè)pH單位；緩沖液可選用反相色譜的常見(jiàn)種類，但磷酸鹽仍是首選。
反離子在IEC中發(fā)揮著重要作用，其種類和濃度用于調(diào)控保留和選擇性；陰離子：Cl-等鹵負(fù)離子、ClO4-、SO42-；陽(yáng)離子：Na+等堿金屬離子；如果具備流動(dòng)相選擇的軟件，則省時(shí)省力。
有機(jī)溶液：乙腈仍是首選，影響峰型和選擇性；
2.2色譜柱的選擇：
載體可選擇硅膠，但要保證pH的耐受性，許多色譜柱廠家也提供聚合物載體；
規(guī)格參考反相色譜法的建議；
IEC固定相一般有以下四種：強(qiáng)陰離子交換-N(CH3)3+；強(qiáng)陽(yáng)離子交換-SO3-；弱陰離子交換：-NH2；弱陽(yáng)離子交換：-COOH；
2.3其它色譜參數(shù)：可參考反相色譜。
3 尺寸排阻色譜法（SEC）：常用于多肽藥物中聚合物雜質(zhì)的分離，根據(jù)聚合物分子與藥物分子體積的不同進(jìn)行分離。
3.1 色譜柱：填料選擇硅膠表面采用硅烷醇（二醇基柱）修飾，以降低硅膠與多肽分子的作用。一般廠家推出的12nm孔徑SEC柱可滿足多肽聚合物的分離。色譜柱規(guī)格沒(méi)有反相色譜柱多，可選較較小粒徑。
3.2流動(dòng)相：
緩沖液：可選常用的三氟乙酸、磷酸緩沖液，調(diào)控pH和離子強(qiáng)度減少離子化作用，根據(jù)需要可使用較高濃度；
有機(jī)溶劑：乙腈或甲醇，減少疏水作用；
流速：常用1ml/min，但由于多肽分子擴(kuò)散系數(shù)低，可用較低流速以提高柱效。
小結(jié)
多肽藥物有關(guān)物質(zhì)分析方法開(kāi)發(fā)難度大，周期長(zhǎng)。正如指導(dǎo)原則中所述，需要摸索多種分離模式，以及每個(gè)模式下的各種參數(shù)，如不同固定相的色譜柱，不同流動(dòng)相pH等等，隨著雜質(zhì)研究工作的推進(jìn)還需不斷優(yōu)化各個(gè)參數(shù)?；谝陨咸攸c(diǎn)，多肽藥物有關(guān)物質(zhì)方法開(kāi)發(fā)是一個(gè)系統(tǒng)性，技術(shù)性的高難度工作，需要方法開(kāi)發(fā)人員不斷學(xué)習(xí)，在實(shí)踐中加深對(duì)分子特性和分離原理的了解，最后還要保持足夠的耐心和信心。
參考文獻(xiàn)
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[2]Snyder,L.R.等著.陳小明等譯.《現(xiàn)代液相色譜技術(shù)導(dǎo)論（第3版）》.2012年
[3]安捷倫科技（中國(guó)）有限公司.《多肽類藥物分析策略PPT》
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