摘 要Abstract
近年來(lái)，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和研究的不斷深入，溶瘤病毒產(chǎn)品對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性和有效性不斷提高，對(duì)正常細(xì)胞的影響進(jìn)一步降低，產(chǎn)品的安全性穩(wěn)步提升，逐步成為國(guó)內(nèi)外研發(fā)熱點(diǎn)。為鼓勵(lì)和促進(jìn)溶瘤病毒產(chǎn)品的發(fā)展，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心于2023 年2 月13 日正式發(fā)布了《溶瘤病毒產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》。本文結(jié)合指導(dǎo)原則制定背景，對(duì)指導(dǎo)原則內(nèi)容和重點(diǎn)問(wèn)題進(jìn)行詳細(xì)解讀，以供業(yè)界更好的理解和運(yùn)用指導(dǎo)原則技術(shù)要求，進(jìn)一步促進(jìn)國(guó)內(nèi)溶瘤病毒產(chǎn)品研發(fā)和申報(bào)規(guī)范性。
In recent years, with the continuous development of technology and research, the selectivity and effectiveness of oncolytic virus products in targeting tumor cells have been improving, while their impact on normal cells has been reduced.The safety of these products has steadily increased, making them a research and development hotspot around the world. To encourage and facilitate the development of oncolytic virus products, the Center for Drug Evaluation of the National Medical Products Administration officially issued the Guidance on CMC Study and Evaluation Techniques of Oncolytic Virus Products (Trial) on February 13, 2023. This paper provides a detailed interpretation of the main content and some important issues of the guidance, combined with the drafting background, aiming to provide the industry with a better understanding and application of the technical requirements specified in the guidance and promote the standardization of oncolytic virus products development and application in China.
關(guān)鍵詞Key words：
溶瘤病毒產(chǎn)品；藥學(xué)研究；解讀
oncolytic virus products; CMC research; interpretation
近年來(lái)，溶瘤病毒作為腫瘤免疫治療的一類(lèi)產(chǎn)品在臨床上得到應(yīng)用，也取得了一定的臨床進(jìn)展。截至2023 年5 月， 全球已批準(zhǔn)4 款溶瘤病毒產(chǎn)品上市：2004 年，Latima 公司開(kāi)發(fā)的ECHO-7（ 商品名：Rigvir） 在拉脫維亞獲得批準(zhǔn)， 用于治療黑色素瘤[1] ；2005 年， 上海三維生物公司開(kāi)發(fā)的H101（商品名：安柯瑞）在中國(guó)獲得批準(zhǔn)，用于治療鼻咽癌和頭頸部癌[2-3] ；2015 年，Amgen 公司開(kāi)發(fā)的T-VEC（ 商品名：Imlygic） 在美國(guó)獲得批準(zhǔn)，用于治療黑色素瘤，隨后該產(chǎn)品在歐盟也獲得批準(zhǔn)[4] ；2022 年， 第一三共株式會(huì)社（Daiichi Sankyo）開(kāi)發(fā)的G47Δ（商品名：Delytact）在日本獲得批準(zhǔn)，用于治療惡性膠質(zhì)瘤[5]。同時(shí)，近年來(lái)我國(guó)批準(zhǔn)的用于各類(lèi)惡性腫瘤臨床試驗(yàn)的溶瘤病毒產(chǎn)品數(shù)量也迅速增加，主要病毒類(lèi)型包括腺病毒、呼腸孤病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒等。為規(guī)范溶瘤病毒產(chǎn)品的研發(fā)和申報(bào)，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心（CDE）于2023 年2 月13 日正式發(fā)布了《溶瘤病毒產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》（以下簡(jiǎn)稱(chēng)：指導(dǎo)原則）。本文旨在結(jié)合溶瘤病毒產(chǎn)品的特點(diǎn)，對(duì)指導(dǎo)原則制定背景、內(nèi)容和需要關(guān)注的重點(diǎn)問(wèn)題進(jìn)行介紹，以便業(yè)界更好地理解和應(yīng)用該指導(dǎo)原則。
1、指導(dǎo)原則制定背景
1.1 制定目的
本指導(dǎo)原則是根據(jù)國(guó)家頒布的相關(guān)法律法規(guī)要求，參考國(guó)外相關(guān)指導(dǎo)原則，結(jié)合國(guó)內(nèi)溶瘤病毒產(chǎn)品的研發(fā)現(xiàn)狀，以《中國(guó)藥典》（2020 年版）“人用基因治療制品總論”和《體內(nèi)基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》為基礎(chǔ)制定的。
溶瘤病毒產(chǎn)品和體內(nèi)基因治療產(chǎn)品在產(chǎn)品設(shè)計(jì)和質(zhì)量研究上有一定相似性，但兩者之間也存在一定差異，如適用的病毒類(lèi)型不同、病毒復(fù)制特性不同、作用機(jī)制不同。體內(nèi)基因治療產(chǎn)品一般是非復(fù)制型病毒，如腺病毒、腺相關(guān)病毒、單純皰疹病毒等[6]，而溶瘤病毒產(chǎn)品一般是具有復(fù)制能力的病毒，如痘苗病毒、腺病毒、呼腸孤病毒、單純皰疹病毒等。另外，體內(nèi)基因治療產(chǎn)品的作用機(jī)制一般是通過(guò)對(duì)人體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)進(jìn)行修飾、表達(dá)外源基因、操縱細(xì)胞基因表達(dá)或調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)活性等達(dá)到治療疾病目的[6]，而溶瘤病毒產(chǎn)品通常是通過(guò)直接裂解腫瘤細(xì)胞、表達(dá)外源基因、刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)等達(dá)到治療疾病的目的，因而有必要針對(duì)溶瘤病毒產(chǎn)品制定藥學(xué)指導(dǎo)原則。指導(dǎo)原則的試行一方面為行業(yè)研發(fā)和申報(bào)提供技術(shù)支撐，另一方面也為監(jiān)管機(jī)構(gòu)統(tǒng)一審評(píng)尺度提供依據(jù)。
1.2 起草思路
指導(dǎo)原則整體思路涵蓋了以下幾點(diǎn)考慮。
指導(dǎo)原則重點(diǎn)圍繞溶瘤病毒產(chǎn)品藥學(xué)研究中的生產(chǎn)用物料、生產(chǎn)工藝、質(zhì)量研究、外源病毒因子控制、穩(wěn)定性研究和包裝系統(tǒng)等方面提出技術(shù)要求。技術(shù)要求涵蓋了特殊性問(wèn)題考慮，如不同類(lèi)型生產(chǎn)/ 包裝細(xì)胞系的風(fēng)險(xiǎn)層級(jí)和基本要求，不同用途質(zhì)粒DNA 的技術(shù)要求等。技術(shù)要求也涵蓋了共性問(wèn)題考慮，比如外源病毒因子控制策略、分子變體的檢測(cè)和控制等。
指導(dǎo)原則提出的是科學(xué)性建議，并非強(qiáng)制要求，希望申請(qǐng)人在開(kāi)展產(chǎn)品研究時(shí)根據(jù)具體品種的適用性，具體問(wèn)題具體分析，并加強(qiáng)與監(jiān)管機(jī)構(gòu)的溝通和交流。
指導(dǎo)原則中的建議和要求僅反映了現(xiàn)階段對(duì)溶瘤病毒產(chǎn)品的認(rèn)識(shí)和一般性考慮，隨著技術(shù)和理念的進(jìn)步，申請(qǐng)人可以考慮采用其他更適宜或更優(yōu)的策略和方法，CDE 也會(huì)隨著行業(yè)發(fā)展和認(rèn)知深入，適時(shí)對(duì)指導(dǎo)原則進(jìn)行修訂。
2、指導(dǎo)原則介紹
指導(dǎo)原則共包括12 個(gè)部分，前10 個(gè)部分為指導(dǎo)原則主要內(nèi)容，其中前言、適用范圍、一般原則、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與控制屬于總括性章節(jié)，生產(chǎn)用物料、生產(chǎn)工藝、質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、外源病毒因子檢測(cè)和控制、穩(wěn)定性研究、包裝及密封容器系統(tǒng)等是按照產(chǎn)品研發(fā)的幾個(gè)重要方面進(jìn)行論述。考慮到這類(lèi)產(chǎn)品溶瘤病毒外源病毒因子控制的特殊性，在第八章“外源病毒因子檢測(cè)和控制”中進(jìn)行了全面的論述，下文將對(duì)外源病毒因子檢測(cè)和控制策略重點(diǎn)解讀。
另外，指導(dǎo)原則結(jié)合目前溶瘤病毒的類(lèi)型，盡可能在相應(yīng)章節(jié)針對(duì)不同類(lèi)型病毒把當(dāng)前的審評(píng)考慮進(jìn)行了說(shuō)明。以下將對(duì)指導(dǎo)原則中部分重點(diǎn)內(nèi)容及相關(guān)考慮予以說(shuō)明，以進(jìn)一步提高業(yè)界同仁的理解和認(rèn)識(shí)。
2.1 一般原則
溶瘤病毒產(chǎn)品作為藥品開(kāi)發(fā)，應(yīng)遵守藥品研發(fā)相關(guān)法律法規(guī)和規(guī)范性文件，同時(shí)還需要遵循藥品研發(fā)的一般規(guī)律。溶瘤病毒產(chǎn)品活性成分和作用機(jī)制特殊，因此在基因設(shè)計(jì)、生產(chǎn)工藝、質(zhì)量研究和控制、貯存和運(yùn)輸以及臨床使用等各個(gè)階段均應(yīng)建立基于產(chǎn)品特點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)控制策略。另外，其為一類(lèi)具有復(fù)制能力的“活病毒”，因此需要特別關(guān)注產(chǎn)品研發(fā)、生產(chǎn)、使用和廢棄處理過(guò)程中的生物安全性風(fēng)險(xiǎn)。
觀察溶瘤病毒產(chǎn)品的全球研發(fā)現(xiàn)狀，處在臨床試驗(yàn)階段的產(chǎn)品較多，批準(zhǔn)上市的產(chǎn)品較少，行業(yè)對(duì)于臨床試驗(yàn)階段的藥學(xué)技術(shù)要求有較大的迫切性。在此背景下，指導(dǎo)原則在一般原則章節(jié)中針對(duì)溶瘤病毒不同研發(fā)階段的考慮進(jìn)行了重點(diǎn)說(shuō)明，包括臨床試驗(yàn)階段、臨床試驗(yàn)期間、上市申報(bào)階段的技術(shù)要求。例如，在臨床試驗(yàn)階段，重點(diǎn)關(guān)注與產(chǎn)品安全性相關(guān)的問(wèn)題，確保臨床試驗(yàn)用產(chǎn)品的安全性。申報(bào)臨床階段用于非臨床研究用產(chǎn)品的質(zhì)量對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行后續(xù)開(kāi)發(fā)提供重要依據(jù)，臨床試驗(yàn)用產(chǎn)品的質(zhì)量應(yīng)不劣于非臨床研究用產(chǎn)品質(zhì)量。另外，病毒本身的安全性、生產(chǎn)用物料的控制等對(duì)確保產(chǎn)品安全也非常重要，雖然在該內(nèi)容項(xiàng)下未詳細(xì)闡述技術(shù)要求，但可以參考第五章“生產(chǎn)用物料”中的基本要求。同時(shí)，為了初步證明生產(chǎn)工藝的可行性及穩(wěn)健性，還需對(duì)臨床試驗(yàn)用產(chǎn)品生產(chǎn)工藝進(jìn)行初步確認(rèn)，建立初步的中間體控制項(xiàng)目和標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)量研究方面需進(jìn)行必要的方法確認(rèn)，建立適用于臨床的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，保證臨床樣品的質(zhì)量。產(chǎn)品的穩(wěn)定性研究結(jié)果應(yīng)能支持樣品開(kāi)展臨床試驗(yàn)。在包裝及密封容器方面，應(yīng)有相應(yīng)數(shù)據(jù)以證明其適用性。
2.2 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與控制
該章節(jié)按照此類(lèi)產(chǎn)品的特點(diǎn)對(duì)主要風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了列舉，并提出了相應(yīng)的質(zhì)量控制策略。需要關(guān)注的是溶瘤病毒產(chǎn)品類(lèi)型較多，基因設(shè)計(jì)、生物學(xué)特性和作用機(jī)制復(fù)雜，使用到的生產(chǎn)/ 包裝細(xì)胞類(lèi)型多樣，生產(chǎn)工藝和質(zhì)量研究也各有不同，因此指導(dǎo)原則所列舉的風(fēng)險(xiǎn)因素未必包含了產(chǎn)品所有的風(fēng)險(xiǎn)因素，同時(shí)指導(dǎo)原則列舉的風(fēng)險(xiǎn)因素也未必在所有產(chǎn)品中均存在。指導(dǎo)原則通過(guò)列舉這些風(fēng)險(xiǎn)因素，希望申請(qǐng)人在開(kāi)展產(chǎn)品研究時(shí)，充分結(jié)合自身產(chǎn)品特點(diǎn)建立風(fēng)險(xiǎn)控制理念，并且制定相應(yīng)的控制策略，以確保臨床試驗(yàn)用樣品的安全性和有效性。
2.3 生產(chǎn)用物料
該章節(jié)針對(duì)不同類(lèi)型生產(chǎn)用物料提出相應(yīng)技術(shù)要求。生產(chǎn)用物料包括用于生產(chǎn)溶瘤病毒產(chǎn)品的物質(zhì)或材料，包括起始原材料（如病毒種子、生產(chǎn)/ 包裝細(xì)胞）；生產(chǎn)過(guò)程中使用或添加的原材料（如培養(yǎng)基及其添加成分、純化試劑等）、輔料、以及生產(chǎn)用耗材（如培養(yǎng)袋、儲(chǔ)液袋、移液管路、濾膜等）等。
病毒種子作為產(chǎn)品中重要的起始原材料，應(yīng)根據(jù)初始病毒來(lái)源不同開(kāi)展相應(yīng)的研究，還應(yīng)根據(jù)基因修飾類(lèi)型不同關(guān)注其潛在風(fēng)險(xiǎn)并開(kāi)展相應(yīng)研究。同時(shí)，病毒種子的篩選、建立、檢定及傳代穩(wěn)定性研究均應(yīng)結(jié)合具體產(chǎn)品具體分析，并開(kāi)展相應(yīng)研究。目前常用于溶瘤病毒產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的病毒來(lái)源包括野生型病毒、減毒病毒和基因修飾病毒。除野生型病毒產(chǎn)品以外，其他2 種類(lèi)型的病毒產(chǎn)品可能在傳代和（或）生產(chǎn)過(guò)程中通過(guò)回復(fù)突變或同源 / 非同源重組形成親本基因型病毒或野生型病毒，這種形式的病毒通常稱(chēng)為初始病毒（或野生型病毒），下文在“重點(diǎn)問(wèn)題說(shuō)明”中將對(duì)初始病毒（或野生型病毒）的具體含義和技術(shù)要求重點(diǎn)說(shuō)明。
通常情況下，溶瘤病毒產(chǎn)品中用于制備病毒種子的質(zhì)粒DNA是一次性使用的，但指導(dǎo)原則的制定應(yīng)兼顧包容性和全面性，因此也納入了需要建立細(xì)菌種子批生產(chǎn)質(zhì)粒DNA 的技術(shù)要求。希望申請(qǐng)人在開(kāi)展產(chǎn)品研究時(shí)可以結(jié)合自身產(chǎn)品特點(diǎn)開(kāi)展相關(guān)研究。
生產(chǎn)/ 包裝細(xì)胞作為建立病毒種子或者生產(chǎn)溶瘤病毒產(chǎn)品的關(guān)鍵起始原材料需要開(kāi)展研究和控制。通常情況下，無(wú)論是用于包裝病毒以獲得病毒種子的細(xì)胞基質(zhì)，還是生產(chǎn)溶瘤病毒的細(xì)胞基質(zhì)，均應(yīng)滿(mǎn)足來(lái)源清晰、歷史培養(yǎng)過(guò)程清楚、風(fēng)險(xiǎn)可控及全面檢定的要求。
2.4 生產(chǎn)工藝
該章節(jié)對(duì)溶瘤病毒產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝開(kāi)發(fā)、工藝過(guò)程控制以及工藝驗(yàn)證研究進(jìn)行了介紹。
工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程中常伴隨工藝優(yōu)化和調(diào)整，因此需要開(kāi)展可比性研究，可比性研究策略需要根據(jù)變更發(fā)生的階段、變更的類(lèi)型、變更的影響來(lái)綜合分析變更的風(fēng)險(xiǎn)，從而確定可比性研究?jī)?nèi)容、研究批次數(shù)量、可接受標(biāo)準(zhǔn)，以及是否需要開(kāi)展非臨床和臨床橋接研究。
2.5 質(zhì)量研究與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
產(chǎn)品研發(fā)過(guò)程中需對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行系統(tǒng)、深入的研究，制定科學(xué)、合理、可行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并不斷地修訂和完善，以控制產(chǎn)品質(zhì)量，確保其在有效期內(nèi)安全有效。
該章節(jié)分別從鑒別和結(jié)構(gòu)分析、生物學(xué)活性、含量、純度、雜質(zhì)、污染物以及其他特性等方面對(duì)此類(lèi)產(chǎn)品的主要研究項(xiàng)目進(jìn)行了列舉，并針對(duì)相對(duì)較成熟的分析方法進(jìn)行了說(shuō)明，但所列舉的項(xiàng)目和分析方法并不一定適用于所有產(chǎn)品，具體的研究項(xiàng)目和分析方法還需要結(jié)合具體品種特點(diǎn)研究確定。
例如，產(chǎn)品純度研究方面，由于病毒類(lèi)型不同，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難采用一種準(zhǔn)確的分析方法對(duì)純度進(jìn)行衡量，因而多數(shù)情況下產(chǎn)品的純度需要結(jié)合病毒特點(diǎn)、生產(chǎn)特點(diǎn)等控制多種質(zhì)量項(xiàng)目綜合評(píng)估產(chǎn)品純度。生物學(xué)活性方面，由于不同產(chǎn)品設(shè)計(jì)不同，作用機(jī)制也存在差異，通常情況下采用體外細(xì)胞法檢測(cè)溶瘤病毒產(chǎn)品對(duì)易感腫瘤細(xì)胞的毒性/ 裂解作用和（或）其在細(xì)胞中的復(fù)制能力是衡量產(chǎn)品對(duì)腫瘤細(xì)胞選擇性的重要指標(biāo)，但在某些情況下，選擇的腫瘤細(xì)胞系/ 株與動(dòng)物/ 人體腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)物之間可能存在一定差異，所以在選擇體外細(xì)胞系/ 株需要考慮是否具有代表性。體外實(shí)驗(yàn)可能并不能完全反映溶瘤病毒產(chǎn)品的體內(nèi)效應(yīng)，有些情況下，需要考慮采用動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)法對(duì)體外生物學(xué)活性檢測(cè)方法進(jìn)行確認(rèn)。對(duì)于一些溶瘤病毒產(chǎn)品在設(shè)計(jì)時(shí)通常會(huì)插入一些特定基因，以提高其相應(yīng)的生物學(xué)功能，這種情況下還需要對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和生物學(xué)特性進(jìn)行定量和定性分析，并作為生物學(xué)活性的一個(gè)指標(biāo)。
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一般根據(jù)產(chǎn)品的質(zhì)量研究確定，質(zhì)量研究中需要確定關(guān)鍵質(zhì)量屬性，一般情況下，關(guān)鍵質(zhì)量屬性應(yīng)納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本章節(jié)中從檢驗(yàn)項(xiàng)目、標(biāo)準(zhǔn)限度和分析方法3 個(gè)方面對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的主要技術(shù)要求進(jìn)行說(shuō)明，目前指導(dǎo)原則中并未規(guī)定具體的檢測(cè)項(xiàng)目和驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)，是考慮到病毒類(lèi)型復(fù)雜多樣，生產(chǎn)工藝也各有不同，希望申請(qǐng)人根據(jù)自身產(chǎn)品特點(diǎn)、生產(chǎn)工藝和質(zhì)量研究情況，建立科學(xué)合理的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
2.6 外源病毒因子的檢測(cè)和控制
溶瘤病毒產(chǎn)品的病毒污染可能來(lái)源于細(xì)胞庫(kù)，動(dòng)物/ 人源性材料、生產(chǎn)過(guò)程的偶然引入等，因此對(duì)溶瘤病毒進(jìn)行外源病毒的檢測(cè)和控制非常重要。
溶瘤病毒產(chǎn)品本身是一種“活病毒”，采用傳統(tǒng)的檢測(cè)方法（如培養(yǎng)法）區(qū)分“溶瘤病毒”和“外源病毒”存在一定困難。另外，采用中和抗體法中和后進(jìn)行檢測(cè)也存在一定困難，一是某些病毒很難篩選到可以有效中和“溶瘤病毒”的中和抗體；二是使用大量抗體進(jìn)行中和可能會(huì)稀釋檢測(cè)樣本從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果；三是證明篩選的中和抗體不會(huì)中和“外源病毒”需要測(cè)試足夠種類(lèi)的陽(yáng)性病毒，對(duì)測(cè)試方法提出了挑戰(zhàn)。為更好地控制這類(lèi)產(chǎn)品被外源病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)該充分結(jié)合這類(lèi)產(chǎn)品特點(diǎn)、工藝特點(diǎn)制定多階段的控制策略，具體可從以下幾個(gè)方面考慮。
首先，細(xì)胞庫(kù)、病毒種子批和工藝中使用的動(dòng)物/ 人源性材料均具有引入外源病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)，因此在使用這些物料前需進(jìn)行外源病毒的全面檢測(cè)。細(xì)胞庫(kù)的外源病毒因子檢測(cè)可參考《中國(guó)藥典》（2020 年版）和人用藥品技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)理事會(huì)（ICH）指南Q5D 相關(guān)要求，結(jié)合細(xì)胞來(lái)源、傳代或改造歷史、建庫(kù)過(guò)程中使用原材料情況等進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估后確定[7-8]。病毒種子批的外源病毒因子檢測(cè)可通過(guò)加入中和抗體或設(shè)置對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，也可考慮增加聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、深度基因測(cè)序技術(shù)等敏感檢測(cè)技術(shù)排除特異性的外源病毒因子污染的風(fēng)險(xiǎn)[7]。生產(chǎn)過(guò)程中使用的動(dòng)物/ 人源材料應(yīng)結(jié)合原材料來(lái)源進(jìn)行特異性病毒檢測(cè)，還需要加強(qiáng)這類(lèi)原材料的供應(yīng)商審計(jì)，建立規(guī)范的質(zhì)量管理體系，并結(jié)合供應(yīng)商檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估建立企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)。
其次，生產(chǎn)過(guò)程中可能存在引入外源病毒的風(fēng)險(xiǎn)，以及在生產(chǎn)用物料階段某些外源病毒可能未被檢測(cè)到，因而需要在生產(chǎn)過(guò)程中選擇適宜階段的工藝中間體進(jìn)行檢測(cè)，工藝中間體外源病毒的檢測(cè)方法同病毒種子批。
最后，考慮到任何病毒檢測(cè)方法都可能會(huì)受到定量方法本身的限制，以及不同類(lèi)型病毒的生產(chǎn)工藝不同，因而除在生產(chǎn)用物料和生產(chǎn)過(guò)程中開(kāi)展外源病毒因子的檢測(cè)和控制外，還需結(jié)合具體產(chǎn)品的情況，根據(jù)研究與驗(yàn)證結(jié)果增加必要的病毒去除/ 滅活步驟、終產(chǎn)品中特異性病毒檢測(cè)等，但是這兩個(gè)階段的控制并不是一個(gè)強(qiáng)制要求，也不是對(duì)所有產(chǎn)品都適用，需要具體問(wèn)題具體分析。
3、 重點(diǎn)問(wèn)題說(shuō)明和解讀
3.1 初始病毒（或野生型病毒）的具體含義
目前常見(jiàn)的溶瘤病毒產(chǎn)品包含三種類(lèi)型：一是天然的具有一定腫瘤選擇性的野生型病毒，二是對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定選擇性的減毒病毒，其可通過(guò)減毒操作獲得，也可通過(guò)自然發(fā)生（即非基因修飾）篩選獲得；三是將特定類(lèi)型的病毒，采用分子克隆、基因合成等技術(shù)進(jìn)行基因修飾后獲得的重組病毒。其中基因修飾的重組病毒作為一類(lèi)比較常見(jiàn)的溶瘤病毒產(chǎn)品被廣泛應(yīng)用到臨床，在構(gòu)建重組病毒前需要采用來(lái)源清晰的起始病毒進(jìn)行基因修飾，起始病毒來(lái)源較為廣泛，一般包括野生型病毒、經(jīng)過(guò)減毒或適應(yīng)的病毒、已經(jīng)過(guò)基因修飾技術(shù)改造的病毒等，在本指導(dǎo)原則中統(tǒng)稱(chēng)為“初始病毒”。由于重組病毒在傳代和（或）生產(chǎn)過(guò)程中可能通過(guò)回復(fù)突變或同源 / 非同源重組形成“初始病毒”，而這些“初始病毒”可能會(huì)對(duì)產(chǎn)品的安全性和有效性產(chǎn)生影響，因此需要在病毒種子批檢定、傳代穩(wěn)定性和質(zhì)量研究中對(duì)“初始病毒”進(jìn)行檢測(cè)和控制。
在某些特定情況下， 例如當(dāng)“ 初始病毒” 來(lái)源于野生型病毒， 那么在傳代和（ 或） 生產(chǎn)過(guò)程中回復(fù)突變或同源/ 非同源重組形成的病毒也可以稱(chēng)為野生型病毒。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA） 在2020年發(fā)布的指導(dǎo)原則Chemistry，Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs) 中對(duì)類(lèi)似概念的表述為 “Parental（or WT）genotype”[8]，本指導(dǎo)原則為了與美國(guó)FDA 指導(dǎo)原則的表述保持一致，采用了“初始病毒（或野生型病毒）”的表述。
3.2 生產(chǎn)/ 包裝細(xì)胞成瘤性/ 致瘤性檢測(cè)要求
目前溶瘤病毒產(chǎn)品開(kāi)發(fā)中可能適用的生產(chǎn)/ 包裝細(xì)胞類(lèi)型較多，如正常細(xì)胞群連續(xù)傳代建立的細(xì)胞系/ 株（如Vero）、腫瘤細(xì)胞系/ 株（如Hela、A549 等）、攜帶致瘤基因的傳代細(xì)胞系/ 株（ 如HEK293） 等。不同類(lèi)型細(xì)胞風(fēng)險(xiǎn)不同，在成瘤性/ 致瘤性檢測(cè)方面的要求也有所不同。
首先，由于新型細(xì)胞基質(zhì)和新建細(xì)胞株/ 系的成瘤性/ 致瘤性風(fēng)險(xiǎn)尚不完全清楚，建議參照《中國(guó)藥典》（2020 年版）三部“ 生物制品生產(chǎn)檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制”相關(guān)要求，進(jìn)行成瘤性和（或）致瘤性檢測(cè)，如果成瘤性檢測(cè)為陽(yáng)性，則需要進(jìn)一步進(jìn)行致瘤性檢測(cè)，檢測(cè)出致瘤性的細(xì)胞基質(zhì)一般不建議使用。
其次，對(duì)于腫瘤細(xì)胞來(lái)源和攜帶致瘤基因的連續(xù)傳代細(xì)胞系，其成瘤性或致瘤性風(fēng)險(xiǎn)較高。已知明確具有成瘤性的傳代細(xì)胞，在細(xì)胞庫(kù)檢定中可不再要求開(kāi)展成瘤性檢測(cè)，但需要評(píng)估使用的必要性、合理性和安全性，同時(shí)建議開(kāi)展致瘤性研究。
最后，對(duì)于正常細(xì)胞群連續(xù)傳代建立的細(xì)胞系/ 株具有在體外連續(xù)傳代的能力，理論上具有成瘤性和（或）致瘤性風(fēng)險(xiǎn)。某些傳代細(xì)胞系已證明在一定代次內(nèi)不具有成瘤性，而超過(guò)一定代次具有成瘤性（如Vero），因此需要對(duì)限傳代次細(xì)胞進(jìn)行成瘤性和（或）致瘤性檢測(cè)。
3.3 分子變體的類(lèi)型及技術(shù)要求
指導(dǎo)原則中分子變體指在病毒包裝或生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的非預(yù)期的變異體，可能包括某些基因序列和（或）氨基酸序列突變形成的變異體，也可能包括重組或回復(fù)突變形成的初始病毒（或野生型病毒）等。
不同類(lèi)型的溶瘤病毒開(kāi)展分子變體研究的方法可能不同?；蛐揎椀娜芰霾《井a(chǎn)品，病毒種子制備前通常會(huì)進(jìn)行病毒的單克隆篩選，分子變體可能在病毒種子批制備和病毒生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生，可通過(guò)分子生物學(xué)方法（如PCR、限制性?xún)?nèi)切酶、基因測(cè)序、蛋白鑒別）等對(duì)分子變體進(jìn)行研究和控制。野生型或減毒病毒，其本身可能包含不同的分子變體，采用基因測(cè)序方法可能無(wú)法檢測(cè)到較低水平的分子變體，建議考慮采用其他檢測(cè)方法以反映分子變體的數(shù)量和性質(zhì)，重點(diǎn)關(guān)注可能改變病毒復(fù)制特性和溶瘤活性的分子變體。通常情況下，對(duì)病毒種子和生產(chǎn)限傳代次病毒應(yīng)進(jìn)行全基因組分析，關(guān)注多次傳代后病毒在基因序列和（或）氨基酸序列上的變化?？刹捎渺`敏的、可量化的檢測(cè)方法識(shí)別病毒全基因組中的所有突變，尤其關(guān)注改造區(qū)域或編碼區(qū)域基因突變情況，充分評(píng)估突變對(duì)產(chǎn)品安全性和有效性的影響。另外，產(chǎn)品質(zhì)量研究中，除采用PCR、限制性?xún)?nèi)切酶法對(duì)特征性序列進(jìn)行鑒別外，還建議采用代表性生產(chǎn)工藝的若干批次進(jìn)行全基因組測(cè)序，如在測(cè)序中發(fā)現(xiàn)基因序列或位點(diǎn)的突變，應(yīng)對(duì)突變?cè)蜻M(jìn)行分析，開(kāi)展分子變體對(duì)產(chǎn)品安全性和有效性影響的評(píng)估，也可基于文獻(xiàn)報(bào)道和（或）根據(jù)其對(duì)蛋白質(zhì)相互作用或功能潛在影響的模型進(jìn)行評(píng)估。
3.4 產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)/ 物質(zhì)的考慮
指導(dǎo)原則中產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)/物質(zhì)主要類(lèi)型可能包括分子變體、非完整包裝病毒（如非包膜病毒顆粒、空殼病毒顆粒等）、錯(cuò)誤包裝病毒顆粒、無(wú)活性病毒顆粒、病毒顆粒聚集體等。
通常情況下，除目標(biāo)產(chǎn)品以外的其他成分一般定義為產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)或工藝相關(guān)雜質(zhì)，但是溶瘤病毒產(chǎn)品以外的其他成分可能無(wú)法簡(jiǎn)單定義為產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，如病毒顆粒集聚體，通常與病毒表面的電荷有關(guān)，且病毒在較高濃度下容易形成聚集體，對(duì)于部分溶瘤病毒產(chǎn)品如果已經(jīng)開(kāi)展研究證明聚集體對(duì)產(chǎn)品安全性和有效性無(wú)影響，則可考慮不納入產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)控制。另外，某些分子變體雖然發(fā)生了核苷酸和（或）氨基酸上的變化，但經(jīng)過(guò)研究證明未對(duì)產(chǎn)品的復(fù)制特性、溶瘤活性和體內(nèi)生物學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生影響，也可能不能直接歸類(lèi)到工藝相關(guān)雜質(zhì)。因此，為兼顧到不同的產(chǎn)品特點(diǎn)，指導(dǎo)原則中對(duì)工藝相關(guān)雜質(zhì)和工藝相關(guān)物質(zhì)的定義進(jìn)行了說(shuō)明，即把可能影響到產(chǎn)品安全性和（或）有效性的物質(zhì)歸類(lèi)為工藝相關(guān)雜質(zhì)，建議采用適宜的方法進(jìn)行殘留量檢測(cè)，并進(jìn)行安全性評(píng)估，必要時(shí)考慮納入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；研究數(shù)據(jù)表明對(duì)產(chǎn)品安全性和（或）有效性無(wú)影響的物質(zhì)歸類(lèi)為工藝相關(guān)物質(zhì)，需要在合適的階段進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以確保批間一致性。
4、結(jié)語(yǔ)
本文較為系統(tǒng)地介紹了《溶瘤病毒產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》的制定背景、一般要求、需要關(guān)注的主要問(wèn)題，希望有助于業(yè)界更好地理解和應(yīng)用該指導(dǎo)原則。由于溶瘤病毒產(chǎn)品創(chuàng)新性較強(qiáng)、發(fā)展較快，指導(dǎo)原則起草小組對(duì)其認(rèn)知也較為有限，因而指導(dǎo)原則中相應(yīng)的技術(shù)要求僅基于當(dāng)前技術(shù)發(fā)展和科學(xué)認(rèn)知，隨著科學(xué)的發(fā)展、對(duì)此類(lèi)產(chǎn)品認(rèn)知的不斷深入，起草小組會(huì)適時(shí)修訂該指導(dǎo)原則。
引用本文：崔靖，韋薇，何伍＊.《溶瘤病毒產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》解讀[J].中國(guó)食品藥品監(jiān)管.2023.05（232）：24-31.
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