前言
方法學(xué)驗(yàn)證的目的是證明所開(kāi)發(fā)的方法能夠滿(mǎn)足檢測(cè)的要求。檢測(cè)的目的不同，對(duì)方法的要求也不同，驗(yàn)證的程度也就不同。進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是遵循官方指導(dǎo)原則（各國(guó)藥典、CDE、ICH等），對(duì)方法的專(zhuān)屬性、系統(tǒng)適用性、定量限、檢測(cè)限、線(xiàn)性與范圍、精密度、準(zhǔn)確度、耐用性等進(jìn)行驗(yàn)證，證明其符合相關(guān)要求。
由于各項(xiàng)指導(dǎo)原則只是寬泛的描述與規(guī)定，并沒(méi)有具體操作和實(shí)施的細(xì)節(jié)，每個(gè)人對(duì)指導(dǎo)原則的理解不盡相同，因此對(duì)于方法學(xué)驗(yàn)證可以說(shuō)是千人千面，各有各的特色。方法學(xué)驗(yàn)證并沒(méi)有絕對(duì)的對(duì)與錯(cuò)之分，只要能客觀合理的證明方法的可行性，就是合格的方法學(xué)驗(yàn)證。下面我將結(jié)合自己的方法學(xué)驗(yàn)證經(jīng)驗(yàn)談一談對(duì)方法學(xué)驗(yàn)證的理解，探討方法驗(yàn)證應(yīng)該怎么做，為什么要這么做，歡迎各位同仁多多交流。
一、 需要驗(yàn)證哪些指標(biāo)？
驗(yàn)證指標(biāo)的確認(rèn)與方法的性質(zhì)相關(guān)，如對(duì)樣品雜質(zhì)限度檢查進(jìn)行驗(yàn)證只需對(duì)其專(zhuān)屬性、檢測(cè)限和耐用性進(jìn)行驗(yàn)證即可滿(mǎn)足限度檢查需求，無(wú)需對(duì)準(zhǔn)確度、精密度、檢測(cè)限、定量限、線(xiàn)性與范圍等與定量相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)于雜質(zhì)的定量檢測(cè)，則需進(jìn)行專(zhuān)屬性、準(zhǔn)確度、精密度、檢測(cè)限、定量限、線(xiàn)性與范圍、耐用性等一系列的驗(yàn)證方能證明其用于雜質(zhì)定量測(cè)定的可靠性。不論是哪種檢測(cè)需求，專(zhuān)屬性和耐用性驗(yàn)證是必不可少的，這也是每一個(gè)分析方法必須滿(mǎn)足的基本要求。具體的驗(yàn)證指標(biāo)設(shè)置可參照下表1。
▲ 表1-檢驗(yàn)項(xiàng)目和驗(yàn)證指標(biāo)
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指標(biāo)／項(xiàng)目 |
鑒別 |
雜質(zhì)測(cè)定 |
含量測(cè)定—特性參數(shù)—含量或效價(jià)測(cè)定 |
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定量 |
限度 |
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專(zhuān)屬性b |
+ |
+ |
+ |
+ |
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準(zhǔn)確度 |
- |
+ |
- |
+ |
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精密度 |
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重復(fù)性 |
- |
+ |
- |
+ |
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中間精密度 |
- |
+a |
- |
+a |
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檢測(cè)限 |
- |
-c |
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- |
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定量限 |
- |
+ |
- |
- |
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線(xiàn)性 |
- |
+ |
- |
+ |
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范圍 |
- |
+ |
- |
+ |
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耐用性 |
+ |
+ |
+ |
+ |
a：已有重現(xiàn)性驗(yàn)證，不需要驗(yàn)證中間精密度
b：如一種方法不夠?qū)伲捎闷渌治龇椒ㄓ枰匝a(bǔ)充
c：視具體情況予以驗(yàn)證
二、 方法驗(yàn)證內(nèi)容
2.1 專(zhuān)屬性
專(zhuān)屬性指在雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等其他組分可能存在的情況下，采用的分析方法能正確測(cè)定出被測(cè)物的能力。對(duì)于專(zhuān)屬性不強(qiáng)方法，需采用不同原理的方法予以補(bǔ)充。
在方法學(xué)驗(yàn)證過(guò)程中專(zhuān)屬性考察的方法包括定位試驗(yàn)和降解試驗(yàn)。
2.1.1 定位試驗(yàn)
在雜質(zhì)對(duì)照品和輔料可以獲得的情況下，對(duì)于含量測(cè)定，可向供試品中加入雜質(zhì)或者輔料，與未加雜質(zhì)或者輔料的供試品測(cè)定結(jié)果比較，以此考察測(cè)定結(jié)果是否受干擾；對(duì)于雜質(zhì)檢查，可向供試品中加入一定量的雜質(zhì)，考查雜質(zhì)之間分離度是否符合要求。
在做定位試驗(yàn)時(shí)需要將各雜質(zhì)或輔料單獨(dú)進(jìn)樣，再將雜質(zhì)或輔料與API混合后進(jìn)樣，考察雜質(zhì)及輔料是否干擾目標(biāo)組分的測(cè)定。通常情況下，混合溶液中各雜質(zhì)的保留時(shí)間和峰面積與單獨(dú)定位時(shí)基本一致，但有時(shí)也會(huì)發(fā)生保留時(shí)間漂移或峰面積減小且同時(shí)產(chǎn)生新的雜質(zhì)峰的情況，對(duì)于保留時(shí)間漂移，最可能原因是受到了供試品溶液基質(zhì)的影響，由于實(shí)際情況下雜質(zhì)與供試品總是同時(shí)存在的，因此需以混合溶液中雜質(zhì)的保留時(shí)間為準(zhǔn)，而不以單獨(dú)定位時(shí)的保留時(shí)間為準(zhǔn)。對(duì)于峰面積減小且產(chǎn)生新雜質(zhì)的情況我們需要確定是哪些組分發(fā)生反應(yīng)，做定位時(shí)需現(xiàn)配現(xiàn)進(jìn)或?qū)l(fā)生反應(yīng)的組分分成兩個(gè)混合溶液分別進(jìn)行考察，避免反應(yīng)的發(fā)生。
2.1.2 降解試驗(yàn)
降解試驗(yàn)的目的是通過(guò)強(qiáng)制降解來(lái)研究潛在的降解雜質(zhì)和降解途徑對(duì)含量和雜質(zhì)測(cè)定的影響，以進(jìn)一步考察方法的專(zhuān)屬性。降解程度建議主峰歸一化純度降低5%~10%，如果通過(guò)很劇烈的條件供試品仍未發(fā)生明顯降解那么說(shuō)明供試品很穩(wěn)定，在日常的運(yùn)輸儲(chǔ)存和使用過(guò)程中不會(huì)發(fā)生難以預(yù)料的降解，因此無(wú)需進(jìn)一步降解。降解試驗(yàn)完成后應(yīng)統(tǒng)計(jì)新增雜質(zhì)，同時(shí)對(duì)新增雜質(zhì)進(jìn)行LC-MS研究，結(jié)合API結(jié)構(gòu)特征和降解條件推測(cè)其結(jié)構(gòu)。
專(zhuān)屬性要求：
1）在專(zhuān)屬性試驗(yàn)中各雜質(zhì)及輔料不干擾目標(biāo)組分的測(cè)定，待考察組分與相鄰峰分離度大于1.5。
2）各降解雜質(zhì)不干擾目標(biāo)組分的測(cè)定，降解物料守恒90%~110%之間（僅有關(guān)物質(zhì)）。
3）定位及降解試驗(yàn)中目標(biāo)組分的色譜峰純度符合要求。
2.2 系統(tǒng)適用性
與儀器核查中的系統(tǒng)適用性不同，方法學(xué)驗(yàn)證中的系統(tǒng)適用性是將儀器設(shè)備、試驗(yàn)操作和被分析樣品作為一個(gè)整體來(lái)考察。凡是樣品檢測(cè)中需要用到的溶液（如有關(guān)物質(zhì)測(cè)定中的自身對(duì)照溶液、供試品溶液、混合溶液，含量測(cè)定的對(duì)照品溶液、供試品溶液等）均需要進(jìn)行系統(tǒng)適用性考察。
系統(tǒng)適用性考察時(shí)將待考察溶液連續(xù)6針進(jìn)樣，計(jì)算保留時(shí)間、峰面積或雜質(zhì)含量RSD，同時(shí)考察待測(cè)組分的理論塔板數(shù)和拖尾因子及與相鄰峰的分離度是否符合要求。通常保留時(shí)間RSD≤1%，峰面積RSD≤2%，雜質(zhì)含量RSD可參照藥典四部9101方法學(xué)驗(yàn)證指導(dǎo)原則精密度項(xiàng)下要求（見(jiàn)下表2）來(lái)設(shè)置。待測(cè)組分與相鄰雜質(zhì)分離度不小于1.5，理論塔板數(shù)可依據(jù)樣品及色譜柱的特點(diǎn)來(lái)設(shè)置，一般C18色譜柱理論塔板數(shù)會(huì)高些，SEC色譜柱塔板數(shù)會(huì)稍差，此外小分子化合物的理論塔板數(shù)高些，生物大分子理論塔板數(shù)低些，這個(gè)只要在規(guī)定的理論塔板數(shù)下能夠滿(mǎn)足專(zhuān)屬性、靈敏度或準(zhǔn)確性等驗(yàn)證指標(biāo)的要求即可，沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。拖尾因子一樣也沒(méi)有固定的要求，藥典中指出對(duì)于采用峰高計(jì)算的方法應(yīng)盡量將拖尾因子控制在0.95~1.05之間。在實(shí)際的驗(yàn)證中通常都是采用峰面積計(jì)算，因此對(duì)拖尾因子的要求可適當(dāng)放寬，尤其是有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)，在其他指標(biāo)符合要求的前提下拖尾因子可進(jìn)一步放寬。
2.3 檢測(cè)限
檢測(cè)限是指供試品中被測(cè)組分能被檢測(cè)出的最低量。檢測(cè)限的測(cè)定方法包括直觀法、信噪比法和基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率法，最常用的是信噪比法，要求檢測(cè)限信噪比≥3。
2.4 定量限
定量限是指供試品中待測(cè)組分能被定量測(cè)定的最低量。定量限的測(cè)定方法包括直觀法、信噪比法和基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率法，最常用的是信噪比法，要求定量限信噪比≥10。
在驗(yàn)證方法的定量限時(shí)還需驗(yàn)證定量限精密度及回收率。
定量限精密度是平行配制6份定量限溶液，計(jì)算6份溶液待測(cè)組分峰面積RSD，RSD限度要求參見(jiàn)精密度項(xiàng)下表2。
定量限回收率是向供試品中添加定量限水平的雜質(zhì)對(duì)照品（平行配制6份），外標(biāo)法計(jì)算其回收率并計(jì)算回收率RSD，回收率限度要求參見(jiàn)準(zhǔn)確度項(xiàng)下表3。
2.5 線(xiàn)性
線(xiàn)性關(guān)系是定量分析的基礎(chǔ)和必要條件，具體做法是采用對(duì)照品配制一系列濃度的溶液，有關(guān)物質(zhì)濃度設(shè)置范圍通常為定量限~限度200%，采用歸一化計(jì)算時(shí)主成分需做到100%供試品濃度；含量測(cè)定的線(xiàn)性范圍至少包含80%~120%，也可以根據(jù)需要放寬范圍，但要保證80%、100%和120%在線(xiàn)性考察點(diǎn)上。線(xiàn)性考察至少要設(shè)置5個(gè)濃度，然后以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作線(xiàn)性回歸，記錄線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)、線(xiàn)性圖、殘差平方和，除此之外還應(yīng)考察Y軸截距和響應(yīng)因子。通常相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.999，截距應(yīng)不大于100%相應(yīng)2%（含量）或25%（雜質(zhì)含量），響應(yīng)因子RSD不大于10%。
校正因子：校正因子表示主成分與雜質(zhì)單位濃度相應(yīng)的比值，通常是采用主成分與雜質(zhì)線(xiàn)性斜率的比值計(jì)算，計(jì)算校正因子允許的誤差通常為10%，需由不同試驗(yàn)人員在不同的儀器上進(jìn)行測(cè)定，以增加其準(zhǔn)確性和耐用性。通常校正因子在0.9~1.1可以采用不加校正因子的方法計(jì)算雜質(zhì)含量；當(dāng)校正因子超出這個(gè)范圍但在0.2~5.0時(shí)可以采用加校正因子的方法計(jì)算雜質(zhì)含量；當(dāng)校正因子<0.2或>5.0時(shí)需采用外標(biāo)法計(jì)算雜質(zhì)含量。校正因子小于1時(shí)保留兩位小數(shù)，大于1時(shí)保留一位小數(shù)，也就是保留兩位有效數(shù)字。舉個(gè)例子：如主成分線(xiàn)性斜率為56000，雜質(zhì)1線(xiàn)性斜率為59000，雜質(zhì)2線(xiàn)性斜率為52000，那么雜質(zhì)1的校正因子是0.95，雜質(zhì)2的校正因子是1.1。
2.6 范圍
范圍是指所開(kāi)發(fā)方法能達(dá)到符合要求的精密度、準(zhǔn)確度和線(xiàn)性時(shí)的高低限濃度或量的區(qū)間。不同的驗(yàn)證指標(biāo)范圍設(shè)置不同，通常線(xiàn)性≥準(zhǔn)確度≥精密度。推薦的范圍設(shè)置見(jiàn)下圖1。
▲ 圖1-線(xiàn)性、精密度及回收率通常設(shè)置的范圍
2.7 精密度
精密度指同一份均勻供試品在規(guī)定測(cè)定條件下經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度，一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。精密度可以分為三個(gè)層次，重復(fù)性是在相同條件下，由同一個(gè)分析人員測(cè)定所得結(jié)果之間的精密度；中間精密度是在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)發(fā)生分析人員、檢測(cè)時(shí)間、儀器設(shè)備等隨機(jī)變動(dòng)情況下所獲得測(cè)定結(jié)果之間的精密度；重現(xiàn)性是不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果之間的精密度。
精密度考察有兩種方式，一是在規(guī)定范圍內(nèi)，取至少6份同一濃度（相當(dāng)于測(cè)定濃度100%水平）供試品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)；二是設(shè)計(jì)不少于3種不同濃度（通常為測(cè)定濃度80%、100%、120%水平），每種濃度配制不少于3份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定和評(píng)價(jià)。目前第一種做法是普遍的做法。精密度結(jié)果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照下表2設(shè)置。
▲ 表2-樣品中待測(cè)定成分的含量與精密度可接受范圍關(guān)系
2.8 準(zhǔn)確度：
準(zhǔn)確度一般用回收率來(lái)表示，表示方法測(cè)定值與真實(shí)值的接近程度，準(zhǔn)確度的測(cè)定方法參見(jiàn)下圖2。
▲ 圖2-準(zhǔn)確度測(cè)定方法
準(zhǔn)確度的限度設(shè)置可以參考下表3，當(dāng)基質(zhì)較復(fù)雜或待分析組分含量較低時(shí)也可適當(dāng)放寬限度。
▲ 表3-樣品中待測(cè)定成分的含量和回收率限度
2.9 耐用性
耐用性考察包含兩部分內(nèi)容，一是溶液穩(wěn)定性，二是色譜條件波動(dòng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。
2.9.1 溶液穩(wěn)定性
溶液穩(wěn)定性影響應(yīng)用此方法所獲得數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、可靠性、有效性。凡是樣品檢測(cè)中需要用到的溶液（如有關(guān)物質(zhì)測(cè)定中的自身對(duì)照溶液、供試品溶液、混合溶液，含量測(cè)定的對(duì)照品溶液、供試品溶液等）均需要進(jìn)行穩(wěn)定性考察，以確保樣品檢測(cè)的可靠性。在進(jìn)行溶液穩(wěn)定性考察時(shí)首先應(yīng)考察25℃的穩(wěn)定性，如穩(wěn)定性較差可考察更低溫度下的穩(wěn)定性，此外如果25℃穩(wěn)定性極差應(yīng)注意樣品臨用新配或者考慮更換配制溶劑。考察的時(shí)間可根據(jù)需要或早期穩(wěn)定性的結(jié)果來(lái)設(shè)置。溶液穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)可以采用偏差、平均偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。對(duì)于含量測(cè)定的供試品溶液、對(duì)照品溶液或有關(guān)物質(zhì)的自身對(duì)照溶液可以比較峰面積的變化，對(duì)于有關(guān)物質(zhì)的供試品溶液則應(yīng)考察單個(gè)雜質(zhì)含量、總雜質(zhì)含量、雜質(zhì)個(gè)數(shù)等多個(gè)指標(biāo)。
2.9.2 色譜條件耐用性
指測(cè)定結(jié)果不受測(cè)定條件微小變動(dòng)影響的承受程度，考察耐用性可以為所建立的方法用于常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。通常方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中就應(yīng)考慮其耐用性，如果測(cè)試條件要求苛刻，應(yīng)在方法中注明可以接受范圍。
色譜條件耐用性考察常見(jiàn)的波動(dòng)范圍如下表4：
▲ 表4-耐用性色譜條件變化示意表
耐用性中色譜條件的變化范圍可以根據(jù)方法實(shí)際的耐用性作調(diào)整。在耐用性考察中除了考察含量、雜質(zhì)含量等，重要的一點(diǎn)是要考察各耐用性條件下的專(zhuān)屬性如何，可以通過(guò)考察各耐用性條件下混合溶液中待測(cè)組分與相鄰峰的分離度來(lái)評(píng)價(jià)。
三、 小結(jié)
依據(jù)QbD理念，藥品不是檢驗(yàn)出來(lái)的是設(shè)計(jì)出來(lái)的，與藥品一樣，分析方法不是驗(yàn)證出來(lái)的，是設(shè)計(jì)出來(lái)的。在方法開(kāi)發(fā)的過(guò)程中就應(yīng)充分考慮后續(xù)方法驗(yàn)證的可行性，建立穩(wěn)健性較好的方法，為方法驗(yàn)證提供一個(gè)較好的輸入。
其次，方法學(xué)驗(yàn)證與所建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是緊密相關(guān)的，當(dāng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)發(fā)生變更如雜質(zhì)限度修訂、殘留溶劑種類(lèi)、生產(chǎn)工藝或制劑處方調(diào)整等都可能涉及到方法學(xué)的部分或重新驗(yàn)證。在開(kāi)展方法學(xué)驗(yàn)證的過(guò)程中要理清到底為什么做方法學(xué)驗(yàn)證，做哪些試驗(yàn)可以證明方法的可靠性，怎樣合理設(shè)置各項(xiàng)指標(biāo)的控制限度，不要為了驗(yàn)證而驗(yàn)證，也不要做得千篇一律，要根據(jù)當(dāng)前研究階段對(duì)樣品質(zhì)量控制的需求進(jìn)行驗(yàn)證，既不要過(guò)于粗獷也不要過(guò)度驗(yàn)證。以上是我對(duì)于方法學(xué)驗(yàn)證的一點(diǎn)個(gè)人看法，歡迎各位藥學(xué)同仁交流探討。
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