透射電子顯微鏡（Transmission electron microscope, TEM）是使用最為廣泛的電子顯微鏡之一，和掃描電子顯微技術(shù)共同組成了電子顯微學(xué)的“兩大支柱”。TEM測試原理采用通過試樣電子成像并分析其結(jié)構(gòu)，因電子穿透能力弱，試樣厚度，導(dǎo)電性，磁性及分散性等性質(zhì)直接影響測試結(jié)果。所以，透射電鏡制樣比掃描電鏡制樣要復(fù)雜、精細(xì)得多，對不同材料應(yīng)按其性質(zhì)而采取適當(dāng)方法。本文將對透射電鏡常見的各種制樣方法進(jìn)行介紹與對比。
載樣工具介紹
TEM常用的載樣工具制成桿狀，稱樣品桿，針對不同的測試需求有不同的樣品桿（圖1），樣品搭載在支撐網(wǎng)（通常是銅網(wǎng)）里并放在樣品桿前端，每個(gè)樣品桿最多只能放1~2個(gè)銅網(wǎng)。采用樣品桿載樣具有載樣工具體積小，占用空間亦少，可布置于物鏡內(nèi)上部，利于電鏡分辨率提高等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是無法一次投入過多的樣品網(wǎng)，換樣時(shí)必須打破一次樣品室內(nèi)真空，且效率低下。
圖1 TEM樣品桿 【圖片來自網(wǎng)絡(luò)】
支撐網(wǎng)主要有超薄碳膜、微柵銅網(wǎng)、純碳膜、雙聯(lián)載網(wǎng)支持膜等，金屬支撐網(wǎng)的材質(zhì)有多種，如Cu、Ni、Be、尼龍等，選擇時(shí)要注意選擇成分有別于待分析樣品的支撐網(wǎng)。
圖2 樣品桿尖端結(jié)構(gòu)與支撐網(wǎng)種類
樣品要求
TEM的放大倍數(shù)高、觀測范圍有限、敏感度高，因此為了獲得清晰、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的信號，對TEM的樣品要求也很高。
TEM的樣品種類分為粉末試樣、薄膜試樣、表面復(fù)型和萃取復(fù)型。
①粉末式樣：主要用于粉末材料的形貌觀察、顆粒度的測定及結(jié)構(gòu)與成分分析等；
②薄膜試樣：樣品內(nèi)部的組織、結(jié)構(gòu)、成分、位錯(cuò)組態(tài)和密度、相取向關(guān)系等；
③表面復(fù)型和萃取復(fù)型：金相組織觀察、斷口形貌、形變條紋、第二相形態(tài)、分布和結(jié)構(gòu)等。一般而言，TEM的樣品要求如下：樣品一般應(yīng)為厚度小于100 nm的固體；樣品在電鏡電磁場作用下不會被吸出，附于極靴上；樣品在高真空中能保持穩(wěn)定；
④ 不含有水分或其它易揮發(fā)物，如果含有水分或其他易揮發(fā)物的試樣應(yīng)先烘干。
制樣方法
TEM具有制樣原則，即簡便，不損傷試樣表面，得到盡可能多的可觀察薄區(qū)。常見制樣方法按待測樣品性狀分為粉末制樣法與塊狀制樣法。
3.1粉末樣品的制樣方法
（1）溶液分散-滴落法樣品要求：對納米顆粒材料及其他樣品體積小或者微米顆粒樣品邊緣厚度薄、邊緣位置厚度低的情況下，可以采用溶液分散-滴落法直接制備TEM樣品。
圖3 銅網(wǎng)-支持膜結(jié)構(gòu)
步驟一：針對樣品特性及測試要求，選擇了適宜的支持膜。支持膜為負(fù)載于銅網(wǎng)之間的膜，可供攜帶樣品。支持膜一般都要求有
①要有相當(dāng)好的機(jī)械強(qiáng)度，耐高能電子轟擊；
②應(yīng)在高倍下不顯示自身組織，本身顆粒度要小，以提高樣品分辨率；
③有較好的化學(xué)穩(wěn)定性、導(dǎo)電性和導(dǎo)熱性。常用的支持膜主要有微柵膜、FIB微柵膜、純碳微柵膜、多孔碳膜、Quantifoil規(guī)則多孔膜、C-flat純碳多孔支持膜等。
支持膜的選擇標(biāo)準(zhǔn)如下表1所列。
表1 支持膜種類
除上表所示內(nèi)容之外，還有一些特殊情況：
①用能譜分析銅元素時(shí)，不能選用銅載網(wǎng)，要選用鎳、鉬等其他材質(zhì)的載網(wǎng)膜；分析碳元素時(shí)，要用氮化硅膜。
②在做高分子、生物樣品切片后需要染色時(shí)要用裸網(wǎng)或微柵，因?yàn)槿旧珓┩ǔ痉饺A膜。
③當(dāng)負(fù)載某些二維方向尺度大的薄膜樣品，例如大面積石墨烯膜和有機(jī)膜時(shí)，若采用碳支持膜背底效應(yīng)大，采用微柵膜低倍觀測時(shí)具有微柵孔結(jié)構(gòu)，可以選擇目數(shù)大的裸網(wǎng)樣品，例如1000目和2000目銅裸網(wǎng)樣品。
步驟二：選擇分散劑。根據(jù)樣品性質(zhì)選擇，通常采用無水乙醇。
步驟三：使用超聲波或攪拌將粉末分散在分散劑中，制成懸浮液。注意：懸浮液中的粉末密度不宜過高。
步驟四：將樣品負(fù)載到支持膜上，有滴樣和撈取兩種方法。
滴樣：使用鑷子將覆蓋有支持膜銅網(wǎng)夾緊，滴管滴入數(shù)滴懸浮液于支持膜表面并保持夾緊狀態(tài)直至晾干；
撈取：用鑷子夾持載網(wǎng)浸入溶液撈取液滴，這種方法會在支持膜兩面都負(fù)載上樣品。
步驟五：待支持膜上的液滴充分干燥后即可完成制樣，隨后即可進(jìn)行電鏡觀察。
（2）膠粉混合法試樣要求：一般用于磁性粉末樣品且觀察倍數(shù)不高的情況下。
步驟一：把火棉膠溶液滴入潔凈的玻璃片中，再往玻璃片的膠液中加入少量粉末，攪拌均勻后，把另外一片玻璃片壓緊，兩片玻璃片對研，驟然抽出，待膜片晾干即可。
步驟二：用刀片將膜片劃成小方格，將玻璃片斜插入水杯中，在水面上下空插，膜片逐漸脫落。
步驟三：用銅網(wǎng)將方形膜撈出，即可用于TEM觀察。
3.2塊狀樣品的制樣方法
（1）樹脂包埋法試樣要求：對于大的塊體材料需要切割成小塊后進(jìn)行后續(xù)的磨薄工藝；對微米量級的較大顆粒且經(jīng)機(jī)械研磨粉碎損傷樣品以致不能獲得理想樣品的情況下，此時(shí)可以嘗試采用包埋磨薄的方法制樣。
理想的包埋劑應(yīng)具有：高強(qiáng)度，高溫穩(wěn)定性，與多種溶劑和化學(xué)藥品不起反應(yīng)。目前常用國產(chǎn)環(huán)氧樹脂618、Epon812環(huán)氧樹脂、及低黏度包埋Spurr。具體制樣步驟如下：
步驟1：將待觀察的樣品塊放入灌滿包埋劑的適當(dāng)模具（如膠囊）中，恒溫箱內(nèi)加溫固化。Spurr70℃烤箱內(nèi)8h即可固化，國產(chǎn)樹脂618、Epon812環(huán)氧樹脂需37℃過夜，經(jīng)45℃ 12h、60℃ 24h可固化。
圖4 石蠟包埋組織樣本 【圖片來自網(wǎng)絡(luò)】
步驟2：出包埋固化的試樣，采用超薄切片機(jī)切片或者如下減薄方法使其在與電子束垂直的二維方向尺寸均在3 mm以下，就可以得到與透射電鏡試樣桿兼容尺寸一致的試樣。
步驟3：將獲取的樣品薄片分散于載網(wǎng)上，即可制得透射觀察所需要的樣品。包埋劑配制及使用過程中的注意事項(xiàng)：
① 所有容器及玻璃棒等應(yīng)是清潔和干燥的；
② 配制過程中應(yīng)攪拌均勻，使用過程中應(yīng)避免異物，特別是水、乙醇、丙酮等混入包埋劑；
③ 配制好的包埋劑應(yīng)密封保存，避免受潮。剩余包埋劑可密封并儲存在-10 — -20℃冰箱中，延長其使用期。
（2）機(jī)械減薄法
圖5 機(jī)械減薄所用機(jī)器 【圖片來自網(wǎng)絡(luò)】
步驟1：用砂紙手工研磨減薄樣品薄片平行于電子束方向的厚度，這一過程砂紙型號依次遞增，即砂紙顆粒度遞減，砂紙達(dá)到理想厚度時(shí)，由于砂紙引起的機(jī)械損傷刮痕最小。試樣厚度達(dá)5μm左右后，磨薄工藝停止；
步驟2：采用凹坑儀對試樣進(jìn)行連續(xù)磨薄，直至達(dá)到1 μm厚；
步驟3：使用拋光機(jī)去掉表面的劃痕損傷；
步驟4：用離子減薄儀不斷地對試樣進(jìn)行減薄，直到最后有一定區(qū)域的薄區(qū)和數(shù)十納米厚的試樣；
注：上述步驟2到4可以替換為使用磨拋機(jī)直接作出楔形樣品后，利用離子減薄獲得最終的樣品。
（3）超薄切片法超薄切片方法多用于生物組織、高分子和無機(jī)粉體材料等。相較于包埋后機(jī)械磨薄的方法，超薄切片方法可非?？旖莸販?zhǔn)確地獲取特定位置、特定取向、特定厚度的樣品。
試樣要求：對于觀察特定方向的試樣制備有其優(yōu)點(diǎn)，但是不適用于延展性較強(qiáng)的試樣，如金屬，更適用于生物組織，高分子及無機(jī)粉體材料。
步驟1：將試樣包埋固定好，如果有具體晶體取向或者位置要求，包埋過程中需仔細(xì)放置試樣位置，使得最終所要觀測方向和切片機(jī)金剛石刀片相互垂直；
步驟2：選取特定步長（即樣品厚度）及切割速度，直接切出可供透射電鏡觀測的樣品。
注意事項(xiàng)：
操作要迅速：要在最短時(shí)間內(nèi)完成取樣并迅速投入固定液。所取樣品體積不超過1 mm3。
操作要精細(xì)：輕輕操作，使用鋒利器械時(shí)避免拉、鋸、壓等暴力動作。低溫：在0～4℃內(nèi)操作。
圖5 超薄切片機(jī) 【圖片來自網(wǎng)絡(luò)】
（4）離子減薄法離子減薄通常用于己被機(jī)械減薄過的試樣的最終變薄。同時(shí)在清潔試樣表面的損傷層、非晶層和污染物層方面也得到了廣泛的應(yīng)用。通常用于TEM制樣過程中最后一個(gè)環(huán)節(jié)，整個(gè)過程靠儀器來進(jìn)行，相對簡單。
試樣要求：由于轟擊作用所帶來的試樣減薄是在比較微觀的水平上進(jìn)行的，因此要求試樣自身己經(jīng)減薄到非常薄時(shí)才會產(chǎn)生明顯的作用。離子減薄法不受材料電性能的影響，即不管材料是否導(dǎo)電，金屬或非金屬或者二者混合物，不管材料結(jié)構(gòu)多復(fù)雜均可用此方法制備薄膜。
步驟1：將樣品制成薄片（<100 μm）。
步驟2：將樣品放入離子減薄儀，根據(jù)薄片厚度和TEM測試要求選擇合適的工作電壓（一般是kV量級）和工作電流（一般是mA量級）。對于試樣本身已經(jīng)非常薄的薄片，這類離子減薄例如PIPS, Nano Mill和Ion Mill。另一類型減薄力度大，例如Ion Slicer等，可將100 μm厚試樣直接減薄，最后獲得可用于TEM觀察的試樣。
圖6 TEM mill精密離子減薄儀 【圖片來自網(wǎng)絡(luò)】
（5）電解拋光減薄法電解拋光是靠電化學(xué)的作用使試樣磨面平整、光潔，具有操作簡單、快速、低成本等優(yōu)點(diǎn)。一般處理大批量的電子背散射衍射（EBSD）試樣首選電解拋光。
試樣要求：儀器工作原理要求利用物質(zhì)的電性能所以只能在金屬樣品中使用。移到電解拋光儀上的試樣要求先磨拋粗細(xì)一致，以免穿孔位置發(fā)生偏移，此外還應(yīng)確保試樣干凈。
圖7 電解雙噴減薄儀 【圖片來自網(wǎng)絡(luò)】
步驟二：首先接通電源并將固定樣品置于電解液內(nèi)，調(diào)節(jié)拋光電流達(dá)到額定值，邊攪拌邊充分降溫或升溫以維持電解液溫度處于額定值。在此步驟中應(yīng)注意選用適當(dāng)拋光劑，電源，陰極板等。試樣連接正極，電解液連接負(fù)極，電解液由兩邊噴射到試樣上，陰極板有豎直與L型之分，L型電極可增加電解拋光試樣的成功率。
步驟二：完成拋光操作，將試樣從電解液中移出，再切斷電源，然后要迅速在清水中沖洗，也可先沖洗然后用超聲波清洗，去除樣品表面的電解液以免與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。
注意事項(xiàng)：拋光后的試樣不能太大，電流密度雖可調(diào)節(jié)，但運(yùn)行經(jīng)驗(yàn)證明面積越小試樣成功率越大。不同材料的試樣電解拋光工藝不一樣，所以有必要綜合文獻(xiàn)并通過大量試驗(yàn)摸索出適宜的拋光劑與拋光參數(shù)(如：試劑配方、拋光時(shí)間、溫度、電解液濃度、攪拌速度等）。
（6）聚焦離子束切割法聚焦離子束（Focused ion beam milling, FIB）掃描電鏡雙束系統(tǒng)是在SEM的基礎(chǔ)上增加了聚焦離子束鏡筒的雙束設(shè)備，使用FIB-SEM切割薄片是獲取TEM樣品的一種最常用手段，是使用來源于液態(tài)金屬鎵的離子束，通過調(diào)整束流強(qiáng)度，快速、精細(xì)地加工指定區(qū)域。FIB制樣普適性強(qiáng)，在制樣過程中能夠?qū)崿F(xiàn)電子束-離子束雙束成像且易于定位切割，同時(shí)也能夠通過離子束對試樣進(jìn)行直接轟擊減薄得到透射電鏡中能夠觀測到的試樣。
試樣要求：樣品大小5×5×1 cm，當(dāng)樣品過大需切割取樣。樣品需導(dǎo)電，不導(dǎo)電樣品必須能噴金增加導(dǎo)電性，要保證噴涂的導(dǎo)電鍍層不會影響觀察區(qū)域。切割深度必須小于10 μm。
步驟1：將樣品制樣后放入FIB-SEM當(dāng)中。
步驟2：在FIB-SEM中進(jìn)行薄片切割和減薄。
步驟3：取薄片樣品根據(jù)需要減薄表面離子，然后轉(zhuǎn)TEM觀察。
（7）復(fù)型技術(shù)復(fù)型技術(shù)是用對電子束透明的薄膜（碳、塑料、氧化物薄膜）把材料表面或斷口的形貌復(fù)制下來的一種間接樣品制備方法。復(fù)型法分為塑料一級復(fù)型、碳一級復(fù)型、塑料-碳二級復(fù)型、萃取復(fù)型等。
試樣要求：適合電鏡下容易起變的試樣，也可用于不易成膜的試樣。要求試樣呈非晶態(tài)，分子尺寸較小，導(dǎo)電性好，導(dǎo)熱性好，耐轟擊并具有足夠的強(qiáng)度與剛度。
圖9 塑料復(fù)型和碳復(fù)型原理
① 塑料一級復(fù)型
操作步驟：將特定溶液（火棉膠醋酸戊酯或醋酸纖維素丙酮溶液）滴在試樣上，溶液在試樣表面展平，多余部分用濾紙吸出，溶劑揮發(fā)后試樣表面留下一層100 nm左右的塑料薄膜。
試樣要求：相對于試樣表面來講，是一種負(fù)復(fù)型，即復(fù)型與試樣表面的浮雕相反。
② 碳一級復(fù)型
操作步驟：使用真空鍍膜裝置在樣品表面蒸鍍一層碳膜，樣品放入真空鍍膜裝置中，把樣品放入配好的分離液中進(jìn)行電解或化學(xué)分離后分離出的碳膜即可用于分析。碳膜一級復(fù)型是一種正復(fù)型，它與塑料一級復(fù)型的區(qū)別是：碳膜復(fù)型的厚度基本上相同，而塑料復(fù)型的厚度隨試樣位置而異。塑料復(fù)型不破壞樣品；而碳膜復(fù)型破壞樣品（分離膜與樣品時(shí)要電解腐蝕樣品）。塑料復(fù)型因塑料分子較大，分辨率低（10-20 nm)；碳離子直徑小，碳膜復(fù)型分辨率高(2 nm)。
③ 塑料-碳二級復(fù)型
操作步驟：簡單的說，是將碳復(fù)型重新制造到塑料的一級復(fù)型中，然后將一級復(fù)型溶解掉即為二級復(fù)型。為提高襯度，可向傾斜15-45綆方向噴施Cr和Au重金屬。
技術(shù)特點(diǎn)：在配制復(fù)型過程中不會對試樣原始表面造成損傷，最后復(fù)型帶重金屬投影；不會對試樣造成損傷，耐電子束輻照，襯度大，具有良好的穩(wěn)定性和導(dǎo)熱電性；分辨率不高，相當(dāng)于一級塑料的復(fù)型；膜厚度較薄。
圖10 二級復(fù)型原理圖
④ 萃取復(fù)型
圖11 萃取復(fù)型原理圖
試樣要求：用于對第二相粒子形狀、大小和分布以及物相和晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。
步驟1：將存在第二相析出相的樣品深腐蝕，以使第二相裸露出來。
步驟2：在樣品上鍍上一層碳膜。
步驟3：用電解腐蝕的方法，除去樣品基體，得到的就是只有碳膜和第二相粒子的萃取復(fù)型樣品。
技術(shù)特點(diǎn)：從萃取樣品中可以觀察到第二相顆粒尺寸，形狀，分布和晶體結(jié)構(gòu)分析等特征，同時(shí)還可以觀察到樣品基體的組織形態(tài)。
表2 不同復(fù)型方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較
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