編者按
中藥已經(jīng)在中國使用了數(shù)千年，并在維護中國人身體健康方面發(fā)揮了關鍵的作用。隨著全球普遍開始尋求自然、整體的疾病治療方式，世界范圍內對中藥的需求穩(wěn)步增長。這使得制定國際認可的質量標準比人類歷史上任何時候更為重要。更好地了解中藥的化學成分可以提高中藥整體質量控制的水平，特別是隨著人們對中藥高度復雜性的認識逐漸加深，多成分含量測定已成為中藥科學家的共識。
中國工程院院刊《Engineering》2019年第1期刊發(fā)中國科學院上海藥物研究所果德安研究員等研究人員的《對良好中藥標準的深層化學認知》一文。文章匯總了有關中藥化學分析技術和方法的最新探索性研究，這些方法的進展包括針對液相色譜-高分辨質譜（LC-HARMS）聯(lián)用技術的多維分離、LC-HRMS聯(lián)用技術的智能觸發(fā)數(shù)據(jù)依賴型采集、利用液相色譜-質譜聯(lián)用技術（LC-MS）進行靶向分析、超臨界流體色譜以及大的質譜（MS）數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)挖掘。為了節(jié)省對照品和中藥質量標準的分析時間，文章提出了應用一標多測（SSDMC）和一法多用法兩種質量策略，還介紹了一系列針對中藥分析方法的改進。
一、引言
中藥已經(jīng)在中國使用了數(shù)千年，并在維護中國人身體健康方面發(fā)揮了關鍵的作用。隨著全球普遍開始尋求自然、整體的疾病治療方式，世界范圍內對中藥的需求穩(wěn)步增長。這使得制定國際認可的質量標準比人類歷史上任何時候更為重要。藥品的主要質量標準以藥典中的說明為主?，F(xiàn)今，《中國藥典》《美國藥典》和《歐洲藥典》越來越重視增加草本藥物相關專論的數(shù)量和提高相關專論的水平。中藥正在走向全球化發(fā)展道路，《歐洲藥典》（9.2版）中共收載了81種中藥材標準，《美國藥典》（41版）中共收載了37種植物藥及其制劑。
更好地了解中藥的化學成分可以提高中藥整體質量控制的水平，現(xiàn)在應用創(chuàng)新質量控制技術使應對這些挑戰(zhàn)更具有可行性。盡管最新版的《中國藥典》（2005版）中收錄了618種中藥材和中藥飲片，但這些專論仍缺少重現(xiàn)性好的整體質量標準，有的甚至缺乏明確的定量指標。因此，可以看出傳統(tǒng)質量控制模型不適用于復雜的中藥質量評估。本文提出了一種系統(tǒng)的中藥質量研究方法，即在全面、系統(tǒng)的研究基礎上發(fā)展普遍適用的、簡化的標準。就本方法而言，更深入地認識中藥化學性質是理解和轉化中藥標準最重要的一環(huán)。這是因為化學成分是中藥的治療基礎，因此與中藥質量有著不可分割的緊密聯(lián)系。更深入地了解化學成分情況也有利于揭示中藥質量研究的四大挑戰(zhàn)和制定質量標準：①中藥植物中化學成分的分析和表征，尤其中藥復方中所含的化學成分；②單一成分質量控制方法不適用于多成分體系的中藥，迫切需要制定全面的質量控制模型；③需要闡明中藥中的活性成分，甚至有效成分；④需要制定可廣泛應用的科學的、實用的、可行的質量標準。如丹參包含兩種主要的化學成分：正是基于在20世紀30年代首次發(fā)現(xiàn)的丹參酮和依靠20世紀80年代分離技術的發(fā)展分離出的丹酚酸。《中國藥典》（1990版）首次將丹參酮IIA列為一種鑒定標記，《中國藥典》（2005版）將丹酚酸B選作一種定量指標。隨著更深入地了解丹參的化學性質和質量控制方法的進展，利用丹參酮IIA同時定量其他兩種丹參酮——隱丹參酮和丹參酮I，以便提高整體質量控制，同時保持檢測的總成本?！睹绹幍洹罚?8版）和《中國藥典》（2015版）中已經(jīng)收錄了最新的丹參專論。最近，提出了一種新的中藥質量標準物（Q-marker）概念，這將改變中藥質量控制模式的范式。它被定義為一種中藥的天然、可分析、功能性可追蹤的化學成分。這種中藥質量標準物概念也體現(xiàn)了深入了解各種中藥化學成分的重要性。
自1997年以來，液相色譜（LC）-質譜（MS）聯(lián)用技術已廣泛應用于中藥化學成分的深入分析。一種中藥的成分包含數(shù)千種初級代謝產(chǎn)物（多糖、脂類等）和次級代謝產(chǎn)物（生物堿、香豆素、三萜類、黃酮類、木酚素、多聚乙酰等）。在大多數(shù)情況下，分析研究均著重于次級代謝產(chǎn)物——分子量在2000 Da以下的小分子。色譜分離和結構解析等傳統(tǒng)的植物化學技術仍是獲得有關中藥化學成分復雜性準確信息的金標準。但是，若要快速了解中藥的化學組成，采用化學成分分離的方法就過于繁瑣耗時。將MS技術與色譜技術結合的聯(lián)用分析技術的發(fā)明提供了一種非常強大的手段，可以詳盡分析中藥中的微量成分，并通過單次實驗提供中藥化學復雜性的鳥瞰視圖。就這一點而言，超高效液相色譜（UPLC）-MS聯(lián)用技術和超臨界流體色譜（SFC）-MS聯(lián)用技術均是非常有效的手段。與簡單的色譜儀相比，科學家借由此類聯(lián)用儀器可以得知中藥中含有多少種成分，哪些成分可以提供準確的質荷比（m/z）、有規(guī)律的離子碎片信息和離子的碰撞橫截面積（CCS）。過去5年來，隨著LC-MS聯(lián)用技術的飛速發(fā)展，智能地探索中藥中數(shù)千種化學成分和定量數(shù)百種分析物成為可能。這種分析能力開辟了深入認識中藥化學性質的全新紀元，并開啟了結構解析的智能大數(shù)據(jù)時代。應當注意的是，探索大量化學成分應與整體質量和（或）功能活性相關聯(lián)，且應通過智能數(shù)據(jù)挖掘為中藥質量標準提供有用信息。
隨著對中藥高度復雜性的認識逐漸加深，多成分含量測定已成為中藥科學家的共識。但是，在中藥制藥行業(yè)實踐中應用多成分質量控制有兩個難題：一是對照物質成本高昂；二是在中成藥質量控制中，常常同一成分需要采用不同的處理方法，導致檢測工作耗時耗力。針對第一個難題，本文提出了一標多測（SSDMC）方法，該方法將廣泛應用于《中國藥典》（2020版），為了解決第二個問題，本文提出了一法多用法，可用于通過相同的樣品制備和分析方法定性或定量不同中成藥中的多個相同成分。
2009年，本課題組應用液質聯(lián)用技術系統(tǒng)分析了中藥中不同次級代謝產(chǎn)物分析方法的應用。Zhang等綜述了質普分析法在中草藥的體外和體內應用，He等報道了1997—2005年采用液質聯(lián)用技術進行中藥分析的文獻計量學評價。該文章主要涵蓋過去5年內深入探索中藥化學成分的新技術的發(fā)展，包括二維（2D）LC-MS聯(lián)用技術、儀器依賴型數(shù)據(jù)采集法、儀器非依賴型數(shù)據(jù)采集法、通過LC-MS聯(lián)用技術進行多成分定量測定、SFC-MS聯(lián)用技術的新應用以及智能數(shù)據(jù)挖掘法。本文還提出了兩種新的質量控制方法（即一標多測法和一法多用法）來建立完善的中藥質量標準（圖1）。
圖1. 良好中藥質量標準的深層次中藥化學認知。智能DDA：智能觸發(fā)數(shù)據(jù)依賴型采集；MRM：多反應監(jiān)測；SIM：選擇性離子監(jiān)測；DPI：診斷產(chǎn)物離子過濾；GNPS：全球天然產(chǎn)物協(xié)會分子網(wǎng)絡；PCA：主成分分析；PLS：偏最小二乘回歸。
二、關于深入了解中藥化學性質和質量標準的理念
（一）關于深入了解中藥化學性質的理念
利用物質信息數(shù)據(jù)庫對中藥進行全息描繪是加深中藥化學性質理解的基本思路。如上所述，中藥通常包含數(shù)千種化學成分。這些成分包括有關該中藥質量和功能活性的所有信息。因此，首先要探討的是以下3個問題：①中藥中含多少種化學成分？②這些化學成分的結構是什么？③這些化學成分的含量是多少？然而，即使這些問題相對簡單，仍然無法通過對某些類型的代謝產(chǎn)物（如多糖、鞣質等）使用現(xiàn)代分析技術來完全解答這些問題。
幸運的是，對于被廣泛認作主要活性物質的主要次級代謝產(chǎn)物，如香豆素、皂苷、生物堿和黃酮類，已經(jīng)報道了許多創(chuàng)新技術，這些技術可以更好地應對上述3個問題的挑戰(zhàn)。多維LC-MS聯(lián)用技術是目前最重要的技術，用于探索中藥中多樣又復雜的化學成分，該技術包括離線和在線全二維 LC-MS分析。若結合離子淌度（IM）作為參數(shù)，則可以實現(xiàn)四維分析方法。該方法使得采用2D LC-MS聯(lián)用技術解析化學成分的理論峰容量可達9000左右，完全滿足中藥的復雜程度。在沒有離子碎片信息的情況下很難表征和鑒定獲得的所有成分。因此，提出了許多用于獲取二級質譜（MS/MS）或多級質譜（MSn）碎片信息的智能觸發(fā)數(shù)據(jù)依賴型采集（智能DDA）方法，包括儀器依賴型方法和數(shù)據(jù)后處理方法。與LC-MS聯(lián)用法相比，SFC-MS用法提供了一種正交選擇性，更適合探索脂類和同分異構體成分。針對所探索化學成分的定量信息，已提出了廣泛靶向定量的多反應監(jiān)測（MRM）方法。隨著化學成分數(shù)據(jù)集的不斷積累，應采納智能數(shù)據(jù)挖掘方法，例如利用UNIFI軟件自動分析MS數(shù)據(jù)、利用全球天然產(chǎn)物協(xié)會分子網(wǎng)絡（GNPS）自動對離子碎片MS/MS分類、利用支持向量機（SVM）或神經(jīng)網(wǎng)絡（NN）技術關聯(lián)和預測質量。
（二）關于中藥質量標準的想法
應認真考慮中藥質量標準檢測的成本和效率。對于整體質量標準而言，對照物質的成本是實施專論的主要障礙之一，尤其是在企業(yè)環(huán)境中。一標多測法提出僅通過一種對照物質準確測定所有其他分析物的含量，這大大降低了對對照物質的需求。檢測時間長是使檢測過程變得繁瑣的另一個因素，尤其是在對不同復方中藥中相同成分進行定性或定量分析時。針對定性分析的一法多用法以UPLC-QDa MS技術為基礎，是通過采用一種低成本、緊湊的單四極桿MS技術。在本項技術中，通過選擇性離子監(jiān)測（SIM）方法監(jiān)測植物藥物的特征質量成分，那么含有該成分的所有中成藥（CPM）均可使用該方法進行定性控制。對于定量分析，則采用2D LC多次中心切割分離（MHC）技術。一個中藥的多個分析物可按順序轉移至第二個色譜柱，這將最大限度降低對紫外檢測器的干擾并通過紫外檢測器直接進行檢測。該方法也適用于含相同草本的所有中成藥。
三、中藥物質基礎解析技術的最新進展
（一） LC-MS 聯(lián)用技術的多維分離
事實證明，LC-MS聯(lián)用技術是一種非常實用的方法，可以揭示中藥的化學基礎、新陳代謝和作用機制。盡管在結構、色譜柱和檢測器靈敏度方面有所改善，但由于中藥的復雜性，傳統(tǒng)的LC-MS聯(lián)用法仍可能存在代謝產(chǎn)物共洗脫的問題，尤其是微量分析物和高豐度分析物之間。目前已提出了通過增加額外的分離維度（即2D LC和IM-MS）來提高性能的策略，尤其是在提高色譜和質量分離方面。
根據(jù)兩個維度之間接口的方式，2D LC可以大致分為離線2D LC和在線2D LC。在離線2D LC中，第一維分離出的各流分被收集、處理和重新注入第二維中。此過程自動化程度較低，因此未引入接口。在線2DLC分析中引入了一個特殊接口，自動將各流分轉移至第二維。根據(jù)是否所有1D洗脫液均經(jīng)過了2D分離，可將2D LC分為全2D LC分離和中心切割2D LC分離。在中心切割2D LC中，只有當前關注的那些成分轉移至第二維。
1. 離線 2D LC
離線2D LC不涉及溶劑的不相容問題，因為第一維分離出的各流分在注入第二維前已經(jīng)加以濃縮和重新溶解。因此，該系統(tǒng)體現(xiàn)了不同分離機制的正交聯(lián)用并提供了顯著增加的峰容量。盡管因為人為介入濃縮、重新溶解和重新注入程序而存在樣品損失、低效率、低自動化和潛在污染等問題，該系統(tǒng)仍然是對復雜中藥進行全面分析的最有效的方法。
通常，建立離線2D LC-MS聯(lián)用系統(tǒng)有4種組合模式，分別是正相（NP）×反相（RP）、親水作用色譜（HILIC）×RP、RP×RP、細胞膜色譜（CMC）×RP。在所有這些模式中，RP色譜柱通常充當?shù)诙S色譜柱，因為RP色譜柱經(jīng)觀察具有高峰容量且與MS良好相容。
（1）NP×RP：由于其獨特的保留機制，NP色譜柱是RP色譜柱良好的替代品。蟾蜍皮是最著名的中藥之一，具有很強的抗腫瘤活性。Zhang等提出了一種根據(jù)第一維的XAmide色譜柱和第二維的XUnion C18 色譜柱檢測蟾蜍甾二烯內酯的全離線2D NP/RPLC-MS聯(lián)用法。通過幾種面積算法，利用15種蟾蜍甾二烯內酯混合物研究了該系統(tǒng)的正交性，研究結果正交性達到49.6%。最終，在蟾蜍皮中鑒定處理64種蟾蜍甾二烯內酯，包括33種微量成分和11對異構體。該團隊還提出采用其他兩種離線二維系統(tǒng)（HILIC×RP和RP×RP）進行蟾蜍甾二烯內酯的制備法。
（2）HILIC×RP：盡管NP顯示與RP色譜柱存在高正交性，但由于其溶劑不環(huán)保且應用范圍有限，即使在2D LC系統(tǒng)中也未得到廣泛利用。HILIC通常被視為“高度含水的NP”色譜，以乙腈和水為主要流動相。和RP不同，水是強效洗脫溶劑。2016年，Jin等綜述了HILIC固定相的最新進展和應用。HILIC顯示了與常規(guī)RP固定相的互補分離，適用于糖苷、低聚糖、類固醇和酚酸。這種模式的重點在于HILIC用作第一維色譜柱的順序。這種模式已成功應用于人參屬的人參皂苷、紅花的查耳酮碳苷和黃酮類O-糖苷、丹參（根莖，Salvia miltiorrhiza）的酚酸以及銀杏（Ginkgo biloba）葉提取物的成分。為了表征人參根莖和人參葉中的人參皂苷，提出了結合XBridge Amide色譜柱（1D）和亞乙基橋雜化（BEH）-C18 色譜柱的2D LC系統(tǒng)，該系統(tǒng)與線性離子阱四極桿（LTQ）-Orbitrap系統(tǒng)連接。此離線2D LC系統(tǒng)的正交性為69%，峰容量可達到8925。共檢測出646種人參皂苷，其中427種為潛在的新代謝產(chǎn)物，而在2012年之前報道11種人參中僅有289種皂苷。在2018年，利用相同的2D LC系統(tǒng)并結合新的數(shù)據(jù)依賴性采集（DDA）技術，首次在三七（根莖，P.notoginseng）中篩查出945種人參皂苷，揭示了662種潛在的新型人參皂苷（圖2）。在這種模式下，分析物特點是具有中等極性，可以保留在HILIC和RP中。
圖2. 利用離線2D LC-高分辨質譜（HRMS）聯(lián)用技術和基于UNIFI軟件預測代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)匹配對三七（P. notoginseng）葉（PNL）進行全局分析的典型流程圖。首先，利用正交的HILIC×RPLC-四極桿飛行時間（QTOF）MS系統(tǒng)表征三七葉中的人參皂苷。其次，分別構建人參、三七和三七葉的人參皂苷庫，在三七庫中的每個成分均產(chǎn)生14種預測代謝產(chǎn)物。接著，通過UNIFI中的預測代謝產(chǎn)物篩查（PMS）和預測庫自動篩查出人參皂苷，并通過對照物質人參皂苷的裂解行為研究進行解釋。最后，通過LC-MS導向分離對兩種化合物進行提純，并通過核磁共振（NMR）波譜法明確鑒定這兩種化合物的結構，用于驗證該方法在新化合物發(fā)現(xiàn)中的可靠性。Glc：葡萄糖；Rha：鼠李糖；Xyl：木糖；Mal：丙二酰。
（3）RP×RP：此模式首次應用pH正交性。該模式由酸性條件流動相（1D）與帶正電荷的RP色譜柱（Acchrom XCharge C18）和堿性流動相（2D）與常規(guī)反相色譜柱（EVO C18 ）組成。利用此模式，首次系統(tǒng)解析了《中國藥典》（2015版）中收錄的鉤藤（鉤藤屬）5種植物來源的吲哚類生物堿。離線2D LC系統(tǒng)的正交性為74%。有效地顯示和表征了鉤藤5種植物來源的1227種吲哚類生物堿，表明該物種具有較高的化學多樣性。中藥中生物堿成分更適用于這種模式。
（4）CMC×RP：CMC是一種生物親和性色譜。具有特定受體的細胞膜吸附在活性硅表面，形成細胞膜固定相。只有與受體高度親和的成分才得以保留。將細胞膜色譜作為第一維構建2D LC系統(tǒng)有利于克服色譜柱壽命短、效率低、峰容量低以及結構鑒定效率低的缺陷。Yue等利用自制的β-1腎上腺素能受體（β1 AR）/CMC柱分析了黃連（根莖，Coptis chinensis）提取物，并通過UPLC-MS聯(lián)用技術分析了各流分。最后，鑒定黃連堿是抑制β-1 AR的主要活性成分。通過體外藥理學試驗進一步證實了該結果。此模式可以直接篩出有效的活性成分。
2. 在線 2D LC
在線2D LC分析中引入了一個特殊接口（包括切換閥和樣品環(huán)），將各流分自動轉移至第二維色譜柱。中藥全在線2D LC-MS分析的1D分離時間較長（1~2 h，為了提高分辨率），而2D分離時間較短（約30 s，受旁路采樣環(huán)路的體積限制）。因此，該方法的峰容量通常小于離線2D LC-MS聯(lián)用法的峰容量；但是，其重復性優(yōu)于離線2D LC-MS的重復性，且該方法更適用于多個樣品的分析。
（1）接口創(chuàng)新：在全在線2D LC系統(tǒng)中，接口是將所有流分從第一維自動轉移至第二維最重要的一環(huán)。HILIC×RP系統(tǒng)也在在線2D LC系統(tǒng)中顯示了良好的正交性；但是，在注入2D色譜柱前需要對1D洗脫液進行稀釋，以便消除溶劑效應。為了分析丹參中的酚酸，選擇反沖捕捉柱作為最佳接口，包括可調節(jié)分流器、100 μL樣品環(huán)管和100 μL溶劑混合器。從丹參中成功分離和檢測到196個色譜峰。該系統(tǒng)的正交性高達73%。
（2）色譜柱和流動相創(chuàng)新：正交性和1D色譜柱的有機相強度是在線2D LC-MS聯(lián)用的主要考慮因素。Zhou等提出了一種新開發(fā)的苯基/四唑硫醚（PTAS）鍵合固定相，用于構建RP×RP 2D LC系統(tǒng)。PTAS色譜柱（1D、2.1 mm × 150 mm、5 μm）與亞乙基橋雜化-C 18色譜柱（2D、3 mm × 50 mm、1.7 μm）的選擇性差異很大，主要在于其正交性可達93.2%，且疏水性較弱使其與C 18 色譜柱相容。該系統(tǒng)用于分析莪術（根莖，Curcuma kwangsiensis），該中藥共檢測出439個色譜峰（正/負離子模式），初步鑒定出105種化合物，包括73種以前未報告的代謝產(chǎn)物?；旌夏Ｊ降墓潭ㄏ噙€有利于提高正交性。與SAX-PFP×C 18 系統(tǒng)相比，改進的SAX-CN×C 18 系統(tǒng)在分析白花蛇舌草（全草，Hedyotis diffusa）和半枝蓮（全草，Scutellaria barbata）時顯示出更好的峰分布情況和更合理的分析時間。此外，在在線2D LC-MS系統(tǒng)中，可將細胞膜色譜柱用作1D色譜柱。使用該模式成功地從附子（根，Aconitum carmichaelii）中發(fā)現(xiàn)了16種抵抗阿霉素（DOX）誘導心力衰竭的潛在活性生物堿成分，并在黃芩（根，Scutellaria baicalensis Georgi）經(jīng)口給藥后的大鼠含藥血清中發(fā)現(xiàn)了3種潛在的抗肝癌成分——漢黃芩素、千層紙素A和黃芩新素。
對于在線全2D LC，在1D分離中采用超低流速將最大限度降低轉移量，并增加每個1D分離色譜峰的采樣，從而可在2D分離中進行多次切割。因此，為了分析甘草的次級代謝產(chǎn)物，在第一維中使用微徑SeQuant ZIC-HILIC色譜柱（1 mm×50 mm、3.5 μm），以便在降低洗脫強度的情況下降低第一維中的分離速度和實現(xiàn)最小的轉移量。最后，檢測出89種成分，有趣的是，根據(jù)檢測到的特定化合物可以區(qū)分不同地理位置的甘草樣品。對于RP×RP 2D LC系統(tǒng)，可以通過優(yōu)化流動相中的有機溶劑來提高正交性。在分析甘草中的酚類化合物和三萜皂苷時，利用同步梯度模式可以提高色譜分離，并且在40 min內共檢測出311種化合物。峰容量為1329，正交性為79.8%。同樣地，使用全RP×RP 2D LC-MS系統(tǒng)從皂莢（豬牙皂，Gleditsia sinensis）中分離和鑒定出72種三萜皂苷。
（3）結合多中心切割（MHC）技術：由于中藥（尤其是中藥復方）錯綜復雜，在全2D LC-MS分析后通過MHC技術對1D分離出的部分洗脫液進行再次分離。MHC可通過一系列環(huán)管收集、保留和分析連續(xù)的流分，該環(huán)管的采用可使第二維分離時間長達3~5 min。使用該技術可在全2D LC分析后發(fā)現(xiàn)更多成分。使用該技術分析了兩種中成藥葛根清涼湯（GQD）和燈盞生脈膠囊（DZS）。對于葛根清涼湯，使用與全2D液相色譜中相同的色譜柱結構，在4.4 min時將1D洗脫液裝入11個40 μl的環(huán)管。通過2D分離連續(xù)分離這11種餾分，共分解出13種其他的化合物。對于燈盞生脈膠囊，則將另一種手性高效液相色譜（HPLC）柱作為MHC的2D色譜柱，共分離出另外12對具有良好分離度的異構體。該技術也可用于去除主要化合物，以探索是否存在更多微量元素。通過這種方法，在35 min內分別從葛根（根，Pueraria lobata）和粉葛（根，Pueraria thomsonii）的提取物中分離出271個和254個峰。該技術還可用于解決中成藥多成分含量測定的難題。
3. 離子淌度
離子淌度光譜儀是帶電離子在電場的作用下通過離子遷移池中惰性氣體實現(xiàn)分離。作為確定CCS的關鍵參數(shù)，離子的漂移時間取決于離子的大小、形狀和電荷。CCS是給定化合物在特定條件下的物理性質。因此，它是構建庫的重要參數(shù)。色譜分離（s）、離子遷移（μs）和質量檢測（ms）的不同時間尺度使其可以串聯(lián)工作。在三者串聯(lián)時，除LC-MS分析的維度外還新增了一個維度，該維度有利于分離中藥、代謝體和蛋白質組等復雜系統(tǒng)中的異構化合物。
Tose等通過UPLC結合IM-MS聯(lián)用技術從大麻（Cannabis sativa）、印度大麻制劑和大麻植株花葉中分離出大麻素類異構體。利用改良型MOBCAL計算了大麻素類異構體的CCS，并將其與行波離子遷移質譜（TWIM-MS）結果相關聯(lián)。Pacini等使用超高效液相色譜（UHPLC）-紫外（UV）-TWIM MS聯(lián)用技術分析了微藻樣品中的色素。色素在450 nm處通過特征吸收突出顯示，接著通過TWIM-MS進一步分解和鑒定了31種不同的色素，而通過UHPLC-UV-MS聯(lián)用技術僅發(fā)現(xiàn)了26種色素。這些表征結果也有利于區(qū)分小球藻（Chlorella vulgaris）、杜氏鹽藻（Dunaliella salina）和三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）等不同微藻物種。Wang等在分析梔子（Gardenia jasminoides）果實時通過IM-MS實現(xiàn)了對異構體藏紅花素-3和藏紅花素-4的分離。Willems等根據(jù)主要產(chǎn)物離子的強度區(qū)分了咖啡?？鼘幩?，并通過電噴霧離子化（ESI）-高場不對稱波形離子遷移譜（FAIMS）-MS技術對其進行了分離。采用耗時不到1 min的新方法分離和鑒定了蘋果汁/梨汁樣品中的單咖啡?？鼘幩?。Zhang等提出了一種多級MS方法，通過整合源內碰撞誘導解離（ISCID）和時間排列平行碎裂提供母離子和子離子之間更可靠的碎裂關系，接著他們使用該方法研究了多環(huán)多異戊烯基取代間苯三酚類化合物（PPAP）的碎裂特性。從山竹子（果實，Garcinia oblongifolia）的粗提物中共檢測出140種PPAP，其中7對共洗脫、同分異構體的PPAP是通過UHPLC-IM-MS聯(lián)用技術分化出。2D LC系統(tǒng)串聯(lián)IM-MS構建四維分離系統(tǒng)，并用于分析銀杏（Garcinia oblongifolia）、白花蛇舌草和半枝蓮的植物提取物。在第二維中每種化合物均只呈現(xiàn)一個峰，對數(shù)調制時間為4 min。在IM的幫助下，可以根據(jù)高分辨質譜（HRMS）上的不同分子形狀區(qū)分相同的m/z離子，而在沒有IM的情況下不可能實現(xiàn)這一點。
（二） LC-HRMS 聯(lián)用技術的智能觸發(fā)數(shù)據(jù)依賴型采集（DDA）模式
利用多維分離可以發(fā)現(xiàn)更多中藥化學成分，但是，若沒有m/z和離子碎片信息，將無法鑒定大多數(shù)化學成分。隨著HRMS技術的廣泛使用，離子碎片采集成為最重要的一環(huán)。通過DDA和數(shù)據(jù)非依賴型采集（DIA）可以獲取離子碎片信息。一些文章已經(jīng)對這兩種模式進行了討論，但大部分中藥成分篩查研究傾向于根據(jù)DDA模式智能獲取離子碎片。獲得的靶離子碎片越多，破譯的中藥化學成分越多。最近總結了利用LC-MS聯(lián)用技術根據(jù)特征碎片信息分析微量成分的研究，本文歸納了獲取更多碎片的新型DDA策略。
根據(jù)離子強度、質量包含列表或排除列表、同位素模式、擬中性丟失（NL）和質量虧損觸發(fā)DDA模式。為了深入解析中藥的成分類型，這些智能觸發(fā)DDA可分為儀器依賴型和儀器非依賴型采集。
1. 儀器依賴型智能DDA模式
大多數(shù)儀器依賴型智能DDA模式均依賴于所使用的儀器，如LTQ-Orbitrap系統(tǒng)或離子阱（IT）-飛行時間（TOF）系統(tǒng)。最近提出了3種新方法，即NL觸發(fā)MS3（NL-MS3）法、質量標簽觸發(fā)DDA、根據(jù)逐步母離子列表（PIL）光柵質量虧損過濾（MDF）觸發(fā)DDA。
這些方法中，NL-MS3法的使用頻率最高。該方法已用于鑒定具有相同殘基或結合物的特定類別的化合物，如黃酮類O-糖苷、丙二酰基結合物和脂肪酸結合物。NL-MS3法旨在利用特定的NL列表確認二羧酸結合的蟾毒素（DACB），通過篩查高能C-阱解離（HCD）下的各種側鏈（二羧酸）可獲得該列表。最后，在蟾酥（Venenum bufonis）中共發(fā)現(xiàn)了78種DACB成分，其中68種為潛在的新化合物。
質量標簽觸發(fā)DDA已用于研究人參提取物中的丙二?；藚⒃碥铡Ｍㄟ^利用丙二?；藚⒃碥盏乃槠?guī)律，其中丙二?；藚⒃碥盏呢撾x子模式碰撞誘導解離（CID）更容易消除CO2 （43.9898 Da），采用了ISCID。然后，啟用“質量標簽”功能，使用LTQ-Orbitrap質譜儀確定MS1中的m/z值差異。如果全掃描譜（離子強度高于閾值）中存在與定義的質量標簽一致的質量對，質譜儀將關閉ISCID能量并觸發(fā)選中離子對的多級激活MS/MS。這樣，只有在MS1中離子碎片質量差值等于43.9898Da的成分才能獲得MS2。接著，結合NL（43.9898Da）觸發(fā)MS3法確認丙二酰基人參皂苷。該策略更智能且避免了復雜的數(shù)據(jù)處理過程。
逐步母離子列表（PIL）光柵MDF觸發(fā)DDA模式旨在篩查鉤藤（Uncariae Ramulus cum Uncis）5種植物來源的吲哚類生物堿[圖3（a）]。通過線方程和LTQ-Orbitrap中的最佳母離子質量寬度（PMW）參數(shù)創(chuàng)建理論吲哚類生物堿的逐步PIL。根據(jù)實驗室建立的鉤藤生物堿庫，以整數(shù)質量為x軸、以質量虧損為y軸建立方程。PMW經(jīng)過優(yōu)化，可以覆蓋潛在的吲哚類生物堿并盡可能排除其他成分。與傳統(tǒng)的MDF法相比，這種方法非常方便，可以鑒定更多潛在的新吲哚類生物堿。
圖3. 使用（a）逐步PIL光柵MDF掃描法和（b）多邊形MDF法篩查鉤藤中吲哚類生物堿的過程圖示。a、b、c、d、e、f、g、h表示多邊形的8個頂點。PMW：母離子質量寬度。
在這3種智能DDA方法中，NL-MS3法適用于糖苷類或脂類成分，而質量標簽觸發(fā)DDA法僅適用于在ISCID中存在固定質量差異的成分。最后一種DDA模式適用于在波動范圍較小的情況下MDF和質量之間存在線性關系的成分。
2. 儀器非依賴型智能DDA
母離子列表法（PIL）觸發(fā)DDA模式通常不依賴儀器，這意味著這類模式可用于大多數(shù)高分辨串聯(lián)質譜儀。為了智能地生成包含特定種類成分的PIL，目前已提出了3種新方法，分別是多邊形MDF法、源內多次碰撞（IMC）-中性丟失過濾法（NLF）和同位素模式精過濾法（FIPF）。
通常，通過軟件實現(xiàn)MDF，如AB Sciex PeakView、Waters MetaboLynx XS、Thermo Scientific MetWorks和Microsoft Excel。目前已經(jīng)相繼設計了經(jīng)典矩形MDF法和改良MDF法等不同算法，目的是在降低假陽性和擴大靶覆蓋范圍之間找到可接受的折衷方案。MDF法已用于通過高分辨質譜數(shù)據(jù)選擇性地檢測、提取或分析關注的成分。MDF法可有效鑒別中藥的不同化學成分。提出了兩種不同于常規(guī)矩形繪圖算法的多邊形MDF法。在篩查三七（P. notoginseng）中的皂苷時，設計了五邊形繪圖算法來挑選當前關注的母離子。在篩查華鉤藤（Uncaria sinensis）中的吲哚類生物堿時，提出了多邊形MDF法[圖3（b）]。這種算法以各鉤藤生物堿庫和分子設計為基礎。鉤藤中所有潛在的吲哚類生物堿均涵蓋在質量范圍-質量虧損范圍內（質量范圍指觀察值m/z的整數(shù)部分），并表現(xiàn)為由8個頂點描繪的八角形區(qū)域；然后可以根據(jù)全MS總離子列表的限制生成PIL，以確定吲哚類生物堿的種類。
IMC-NLF法用于生成人參中丙二酰基人參皂苷的PIL。該方法利用丙二酰基人參皂苷的碎片規(guī)律，即以低能量碎裂產(chǎn)生CO2或丙二?；Ｊ紫?，使用多源碰撞能量獲取全掃描原始數(shù)據(jù)，處理數(shù)據(jù)并將其導出至逗號分隔值（CSV）表格中。然后，使用NL-MS檢測器軟件生成PIL。最終從人參中提取和鑒定了69種丙二?；藚⒃碥铡?/span>
使用FIPF法篩查中藥中硫衍生物，在m/z=400時將分辨率設定為100 000半峰全寬（FWHM）。硫磺熏蒸中藥是一個關鍵問題，因為這種中藥能產(chǎn)生具有未知生物效應的硫衍生物。但是，很難通過傳統(tǒng)的同位素模式過濾法（IPF）找出新的硫衍生物，因為天然穩(wěn)定的 34S不如 37Cl和 81Br豐度高，也就是說， 34S信號將受 13C2 + 18O貢獻的巨大影響。根據(jù)M+2同位素組成（ 12Cx1Hy16Oz32S 13C218O、 12Cx+21Hy16Oz+134S），硫衍生物的M+2差異為Δm=0.0098 Da。采用這種細化的標準，從葛根和粉葛中初步鑒定出9種硫衍生物，并且快速比較了55種市售樣品，這表明可以從更多葛根樣品中鑒定出硫磺熏蒸過程。
在上述3種方法中，多邊形MDF法適用于大多數(shù)成分為相同類型的樣品。IMC-NLF法可用于通過DIA法獲取的大量原始數(shù)據(jù)。而FIPF法僅適用于具有特殊元素的成分。大多數(shù)PIL觸發(fā)DDA法會與動態(tài)排除（DE）結合使用，如葛根、陳皮葉（Citrus reticulata）和香砂六君子加減顆粒分析所示。應該指出的是，MS實驗過程中質量列表過長可能導致工作緩慢和數(shù)據(jù)丟失，PIL可以拆分為兩個或兩個以上的分列表。Shen等利用兩個各含約250種化合物的分列表表征了丹參中的190種聚合酚酸。
（三）使用 LC-MS 聯(lián)用技術進行靶分析
使用LC-MS聯(lián)用技術進行多維分離通常用于化學成分的非靶向分析。但是，靶分析同樣重要，因為靶分析可以提供更可靠的中藥定量信息或更具體的質量特征相關信息。目前存在兩種主要的采集模式：MRM和SIM。上述兩種方法已得以廣泛應用，但是，鑒于中藥的復雜性，本文也提及了一些創(chuàng)新方法。
1. 多反應監(jiān)測
MRM法應用三重四極桿LC-MS/MS聯(lián)用系統(tǒng)，同時監(jiān)測每種分析物的特定母離子和特征產(chǎn)物離子，現(xiàn)已成為廣泛用于同時對多種低豐度代謝產(chǎn)物進行定量研究的常用方法。然而，MRM法存在一些瓶頸，如濃度范圍、極性范圍、一次實驗中離子對數(shù)量有限以及缺乏真實的對照物質。為了解決甘草屬物種（根莖）中成分的濃度范圍問題，采用7種方法對3個來源的樣品中151種生物活性次級代謝產(chǎn)物進行了定量分析，通過UPLC/MRM法確定了微量成分。通過DNA條碼的相關性分析，發(fā)現(xiàn)甘草雜交可能顯著改變甘草的化學成分，而且父本對后代的貢獻大于母本。若極性范圍廣或存在對映異構體，則在連續(xù)通過模式或中心切割2D模式下采用兩個不同的色譜柱。在連續(xù)通過模式下使用RP LC和HILIC的色譜柱最終鑒定了肉蓯蓉（全草，Cistanche salsa）中的21種化合物，并在中心切割2D模式下結合非手性-手性柱同時對18種香豆素進行定量分析，包括前胡（根，Peucedanum praeruptorum）的7對對映異構體。定時MRM法或動態(tài)MRM法可用于增加同時檢測的離子對數(shù)量，從而可在提高靈敏度、優(yōu)化檢出限（LOD）和定量限（LOQ）的情況下鑒定更多化合物，包括牛黃上清丸中的41種成分以及人參和西洋參中的221種人參皂苷。而針對缺乏真實對照物質的問題，需要新的方法來優(yōu)化MRM參數(shù)和實現(xiàn)絕對定量。定量核磁共振氫譜（q1H-NMR）結合色譜分離用于產(chǎn)生假混合標準溶液，從而可以對更多化合物進行定量分析。在四極桿飛行時間（QTOF）儀器上使用步進式MSAll （sMSAll）技術可以預測沒有標準值的MRM參數(shù)，并將這些參數(shù)傳輸至三重四極桿MS系統(tǒng)。同樣地，IT/MS的 MS2可用于生成MRM模式的主要參數(shù)，這些參數(shù)在定量測定中可提供快速直接的轉換設計。
2. 選擇性離子監(jiān)測
由于需要對中藥中特征化合物進行表征，從而為中藥質量控制 、定性分析和鑒定研究提供支持數(shù)據(jù)，選擇性離子監(jiān)測法應運而生。與MRM法相比，SIM法在應用ACQUITY QDa MS系統(tǒng)等緊湊型單四極桿MS時易提供合理的選擇性、更好的適用范圍。因為可在ES– 和ES+ 之間快速切換、參數(shù)設置少、成本低、占用空間少，QDa MS是進行SIM的理想工具。本文提出的一法多用法主要依賴于選擇性離子監(jiān)測方法，并將在本文的后面部分進行描述。
（四）超臨界流體色譜（SFC）
SFC是一種傳統(tǒng)技術，該技術中將具有低黏度和高擴散性的超臨界流體作為流動相，如超臨界二氧化碳（sCO2）。隨著技術的進步，現(xiàn)已具有更優(yōu)良的重復性和穩(wěn)定性，使該技術更適用于中藥研究，如超高效超臨界流體色譜法（UHPSFC）。該技術具有分離效率高、流動相速度快、分析時間短和環(huán)境友好等特點。近年來，已有研究對SFC在中藥研究中的應用進行了綜述，文章將提到部分特殊應用。
1. 中藥脂質組學
脂質組學是對基質中的大量脂質進行全局分析的學科，在很大程度上依賴于分離科學技術的新發(fā)展。SFC-MS聯(lián)用技術可以在降低成本和減少分析時間的同時提高脂質覆蓋率，因此可以作為其他分析技術的替代方案。通過UHPSFC/QTOF-MS聯(lián)用技術綜合分析和比較了使用甲基叔丁基醚從三種人參同屬種（人參、西洋參和三七）中提取的脂質組。將甲醇（CO2中）作為改性劑、甲醇/0.2 mmol·L−1 乙酸銨作為補充流體，利用1.7 μm填料粒徑的Torus 2-吡啶甲基胺色譜柱分析樣品。成功分離了6種脂質亞類，且與RP系統(tǒng)相比，實現(xiàn)了對極性脂質和脂質異構體更好的分離。在分析了60批人參樣品后，共發(fā)現(xiàn)了24種三?；视?。該技術還用于探索不同產(chǎn)地薏仁的脂類標記物，在這種情況下，二酰甘油酯可作為主要的質量標記物。
2. 中藥的極性化學成分
除脂類之外，還通過有效應用SFC技術研究中藥的極性化學成分。呋甾皂苷類化合物C-22位羥基具有活性，且易與低級醇發(fā)生反應。在40 ℃時，使用甲醇（含0.2%NH3 ·H2O和3%水，作為改性劑）在二醇基色譜柱上分離了22 min，成功分離出10種相似的呋甾皂苷類結構。SFC技術也可用于分離具有相同糖苷配基和不同糖鏈的螺甾皂苷類化合物，該技術對糖苷配基中羥基的數(shù)量和位置非常敏感。但是，使用UHPSFC技術分離具有不同糖苷配基和相同糖配基的螺甾皂苷類化合物并不是一種理想的手段，可以用UHPLC法取代。UHPLC法可有效鑒別糖苷配基的變化，且顯示是否受糖苷配基中雙鍵的影響。將甲醇/乙腈（體積比70:30）、1%三氟乙酸（TFA）作為改性劑，流速為0.8 mL·min−1 ，使用亞乙基橋雜化色譜在25 min內對蒼耳子（果實，Xanthium sibiricum Patr）中的8種酚酸進行了定量分析。針對類黃酮，將0.1%磷酸甲醇溶液作為極性流動相，使用Zorbax Rx-SIL色譜柱在15 min內對菊花（花，Chrysanthemum morifolium Ramat）中的5種類黃酮進行了定量分析。對于藥用真菌牛樟芝（Antrodia camphorata）中的7對25R/S-麥角甾烷 類化合物，Chiralcel OJ-H色譜柱（4.6 mm×250 mm、5 μm、手性）和Princeton乙基吡啶色譜柱（2-EP、4.6 mm×250 mm、3 μm、非手性）具有不同的分析優(yōu)勢。手性色譜柱有效分離每對化合物，而非手性色譜柱能有效分離不同的對，即使每個25R/S差向異構對的分離效果不如OJ-H色譜柱的分離效果好。此外，SFC-MS聯(lián)用技術優(yōu)化了3種三萜皂苷（苦丁冬青苷、甾體皂苷和人參皂苷）。為了綜合判斷SFC技術的代謝產(chǎn)物分析性能，采用120種高度多樣化的天然化合物（根據(jù)親油性、氫鍵能力、酸堿性、分子質量和化學結構）對15種不同固定相色譜柱進行了比較。研究發(fā)現(xiàn)，3種固定相（二醇、未封端C18 和2-EP）適用于非靶向監(jiān)測分析和方法開發(fā)，因為這些固定相可以對120種天然化合物中的101種進行適當洗脫。研究發(fā)現(xiàn)，未封端T3 C18 和極性P-PFP可以為特定天然分子亞類提供更大的選擇性。
3. 制備對照化合物
制備高純度對照物質是中藥質量控制的關鍵。然而，由于極性溶劑或水溶劑可能出現(xiàn)快速結構變化，或由于熱不穩(wěn)定性，一些天然化合物純度不高，無法用作標準物質。使用無水流動相在兩個非手性Torus 1-氨基蒽（1-AA）色譜柱和Torus DIOL色譜柱上分別分離了兩對7-螺羥吲哚類生物堿（鉤藤堿和異鉤藤堿、柯諾辛堿和柯諾辛堿B）。離線2D SFC-RP LC聯(lián)用系統(tǒng)具有良好的正交性，已成功從牛蒡子（果實，Arctium lappa L.）中分離出12種木酚素。
（五）大數(shù)據(jù)庫集的數(shù)據(jù)挖掘
通過LC-HRMS法或SFC-HRMS聯(lián)用法對中藥進行全面的非靶向分析，獲取高維度大型數(shù)據(jù)集。即使與代謝組學相比，從這些大數(shù)據(jù)庫集中收集數(shù)據(jù)挖掘信息也非常困難，因為中藥的化學組成多樣性明顯多于生物內源性化學組成。此外，很少有科學家涉足該領域（包括天然產(chǎn)品、食品化學和草藥），能夠獲取的專業(yè)數(shù)據(jù)庫屈指可數(shù)。因此，借助各種生物信息學策略，試圖從大量數(shù)據(jù)集中挖掘數(shù)據(jù)。本文將介紹數(shù)據(jù)挖掘的3個方面。
數(shù)據(jù)匹配：通常是第一步，利用精確的質量或分子式檢索化學庫，從而識別潛在的化合物。但是，庫中儲存的化學結構數(shù)量有限，因此利用化學庫鑒定植物代謝產(chǎn)物非常具有挑戰(zhàn)性。代謝產(chǎn)物預測算法可以在枚舉中使用預先定義的子結構或“構筑塊”，以便預測代謝產(chǎn)物中是否存在結構成分；這將增加可用化學庫的化學覆蓋空間，實現(xiàn)更高效、結構去重復且預測更準確。該方法尤其適用于結構多樣的糖苷分子，如皂苷類和糖化黃酮類化合物中的糖苷分子，這些分子通常由與各種糖基和酰基軛合的糖苷配基組成。借助商業(yè)軟件UNIFI或內部軟件PlantMATM，在庫中生成使用葡萄糖、木糖、鼠李糖和丙二酰基單元一步修飾和兩步修飾的人參皂苷。利用這種方法匹配了三七葉中的更多人參皂苷（721種來自改良庫，282種來自傳統(tǒng)庫）。這種方法也適用于木酚素和多酚（單寧和原花青素）。
數(shù)據(jù)篩選/分類：基于LC-HRMS聯(lián)用技術原始數(shù)據(jù)（包括MS1和MS/MS或MS n 數(shù)據(jù)）中包含的大量信息進行數(shù)據(jù)篩選/分類仍是一項艱巨的任務。目前，已提出許多后采集數(shù)據(jù)處理策略，用于數(shù)據(jù)篩選或分類。對于MS1數(shù)據(jù)，無處不在的基質干擾使微量成分的表征難上加難。因此，通過結合各種篩選方法（包括氮規(guī)則、質量虧損和中性丟失/診斷碎片離子過濾），提出了整合的篩選策略和R腳本。該策略成功快速地從艾葉（葉，Artemisiae argyi）的UPLC-HRMS數(shù)據(jù)集中篩查出16種甲氧基化黃酮類化合物和55種綠原酸類似物。
對于MS/MS數(shù)據(jù)，從碎片離子信息中獲取大量結構信息。因此，提出了關鍵離子過濾策略，用于篩選和劃分黃芩中的不同黃酮類化合物。最后，從黃芩中鑒定出132種化合物，其中59種首次報道。同樣地，根據(jù)診斷產(chǎn)物離子劃分了威靈仙（根莖，Clematis chinensis Osbeck） 中的三萜皂苷、 紫草（ 根，Arnebia euchroma）中的紫草寧和紫草呋喃以及杜仲（皮，Eucommia ulmoides Oliv）和蒺藜（果實，Tribulus terrestris）中的成分。全球天然產(chǎn)物協(xié)會分子網(wǎng)絡（http://gnps.ucsd.edu）是另一種高效劃分大量MS/MS數(shù)據(jù)集的方法，這是一個面向全社區(qū)組織的開放知識庫，可以共享原始的、處理后的或鑒定的串聯(lián)（MS/MS）MS數(shù)據(jù)。該平臺可用于根據(jù)改良的余弦評分方案創(chuàng)建分子網(wǎng)絡，這種方案可判定兩個MS/MS的相似性并使大量MS/MS數(shù)據(jù)的歸類過程可視化；它將成為一種寶貴的中藥化學研究手段。
對于MSn 數(shù)據(jù)，可使用Mass Frontier軟件中的質譜樹狀圖相似度過濾技術（MTSF）來鑒定化合物和獲取子結構信息。該技術可以篩選有用的HRMS和MSn 數(shù)據(jù)，并通過計算相似度匹配分數(shù)建立未知化合物和模板化合物之間的聯(lián)系。在分析二仙湯時，使用該技術成功排除了不相關的離子。
對于混合模式，不同裂解模式可以提供互補的碎片離子信息。通過在LTQ-Orbitrap中結合傳統(tǒng)的CID-MS3和HCD-MS2 ，使用診斷產(chǎn)物離子（DPI）過濾法和NLF法對紅花中黃酮類O-糖苷的糖苷配基和糖分類。
數(shù)據(jù)挖掘：利用化學計量學進行數(shù)據(jù)挖掘已成為一種廣泛使用的中藥質量研究手段。主成分分析（PCA）和（正交性）偏最小二乘判別分析[(O)PLS-DA]是最常用的監(jiān)督和非監(jiān)督數(shù)據(jù)挖掘方法?？梢宰R別對應不同物種、植物不同部分、不同產(chǎn)地、不同“炮制”、不同供應商]以及不同批次的質量標記物。然后，利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡（ANN）或支持向量機（SVM），根據(jù)這些質量標記物預測中藥的質量。此外，可以通過主成分分析鑒定新型化合物。在三重四極桿質譜儀上通過12種不同NL/母離子（PRE）掃描得到了12份姜黃（根莖，Curcuma longa）離子色譜圖。接著，PCA能夠將具有相似NL/PRE模式的數(shù)據(jù)進行聚集，而無需了解其分子量，而那些具有不同NL/PRE模式的化合物很容易被識別為可能具有新結構的異常值。
四、中藥質量控制的應用
隨著對中藥化學性質認識的加深，可以確認哪些質量標記物可用作中藥質量標準。為了節(jié)省標準物質的使用和檢測時間，提出了兩種質量策略。
（一） 一標多測（SSDMC）法
SSDMC法僅需要一種標準物質就能同時鑒定十余種化合物。盡管該方法非常方便，但是其校正因子對UV檢測器和峰測量參數(shù)極度敏感。此外，用于計算校正因子的對照溶液的濃度應在合理范圍內。目前，SSDMC法已廣泛用于中藥的質量控制，包括薏苡仁（種子，Coix lacryma-jobi L.）中的7種三酰甘油、附子中的6種生物堿、人參中的9種人參皂苷、黃芩中的4種黃酮類化合物、靈芝（Ganoderma）中的17種三萜類化合物、天麻塊莖（根莖，Gastrodia elata）中的11種成分、丹參酮提取物中的4種丹參酮、金銀花中的6種化合物（花，Lonicera）、虎杖（根莖和根，Polygonum cuspidatum）中的4種化合物、功勞木（枝，Mahoniae Caulis）中的4種生物堿、紅景天（根莖和根，Rhodiola crenulata H. Ohba）中的3種酚類化合物以及甘遂（根，Euphorbia kansui）中的13中成分。波長程序、蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）和MS檢測器已用于一標多測法中。但是，對于質譜檢測器，在將該方法用作質量標準方法前需要考慮更多影響因素。除了SSDMC法，通過對照物質提取物進行定量分析（QASRE）和定量核磁共振（qNMR）光譜技術在節(jié)省標準物質方面均具有獨特的優(yōu)勢。每種方法各有利弊，應具體情況具體分析。
（二） 一法多用法
由幾種到幾十種中藥制成的中成藥是中藥的主要利用形式。一方面，中成藥極大地豐富了中藥的應用范圍，促進個性化的藥物治療方案；另一方面，中成藥形成了極其復雜的基質，妨礙質量控制?？紤]到中成藥的龐大數(shù)量及其質量控制的難度，針對每種中成藥構建定性和定量方法將非常耗時且相當困難。因此，本文提出了一法多用法，便于對不同中成藥中的相同中藥成分進行鑒定和定量測定。
1. 鑒定
中藥質量控制的主要化學鑒定方法是薄層色譜法（TLC）和高效薄層色譜法（HPTLC）。TLC法和HPTLC法的靈敏度低，峰容量差，表明需要針對不同中成藥中的相同中藥成分開發(fā)新的方法。因此，這將導致樣品制備程序復雜，實驗時間長，甚至造成無法實施任何鑒定方法的情況。
紅花常用于多種中成藥中，但因為中成藥中紅花含量較少，大多數(shù)使用紅花的中成藥無法鑒定紅花的成分。因此，通過UHPLC/QTOF-MS聯(lián)用技術對20批紅花進行了化學分析，并進行了熱穩(wěn)定性試驗后，選擇6種查耳酮C-糖苷作為化學分類學標記物。接著，在這6個標記物的基礎上建立了一種靈敏且具有高度特異性的SIM方法，鑒定了28種不同中成藥的紅花成分。令人驚訝的是，在其中10批樣品中，這6個標記物無法全部檢出，而在其中兩批樣品中，幾乎檢測不出這6個標記物中的任意一個標記物。同樣地，在鑒定舒胸片的3種中藥成分即三七、川芎（根莖，Rhizoma Chuanxiong）和紅花（花）時，《中國藥典》（2015版）中采用了3種繁瑣的TLC法。通過QDa MS檢測儀，選取覆蓋3種中藥的11個標記物來評估12批疏血通片。在一次實驗中鑒定出所有3種中藥，表明QDa MS技術擁有與QTOF-MS聯(lián)用技術相同的鑒定能力。
2. 定量測定
不同中成藥中相同中藥的定量測定涉及復雜的樣品制備程序和案例依賴型色譜參數(shù)。因此，需要建立一套通用的方法，可以同時對涉及相同植物的不同中成藥進行質量評估。
三七是許多中成藥中常用的一種中藥。三七皂苷R1及人參皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd是主要活性成分，因此被視為標記物成分?！吨袊幍洹罚?015版）收錄了80多種涉及三七的中成藥，其中11種中成藥將三七作為君藥。研究發(fā)現(xiàn)，某些中成藥沒有質量控制或其質量控制的少量幾個成分分析條件受色譜條件影響較大。構建了中心切割2D LC系統(tǒng)，同時測定8種不同中成藥中的5種標記物皂苷。2D LC技術具有高峰容量，因此簡化和統(tǒng)一了樣品制備方法。從專屬性、線性、重復性、穩(wěn)定性和準確性等方面對該方法進行了驗證，結果證明該方法具有高特異性、良好分辨率和高分析效率等優(yōu)點。對于那些具有相同定量指標的中成藥，這種統(tǒng)一的方法極大地促進了質量控制（圖4）。
圖4. 一法多用法與中心切割2D HPLC-UV聯(lián)用系統(tǒng)的圖示。（a）5種對照物質的1D HPLC-UV和2D HPLC-UV聯(lián)用技術色譜圖（203 nm）：三七皂苷（noto-R1），人參皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd；（b）腰痹通膠囊樣品（含人參等8種中草藥的中成藥），顯示1D碎片與2D分離之間存在4次轉移。虛線框表示4次轉移的1D碎片的中心切割時間跨度。Fra：碎片；WVL：波長。
五、展望
文章系統(tǒng)地總結了中藥非靶向和靶向分析化學的最新技術和方法學進展，并描述了兩種制定中藥質量標準的質量控制策略。隨著LC-HRMS聯(lián)用技術、液相色譜-固相萃取（SPE）-NMR聯(lián)用技術和SFC-HRMS聯(lián)用技術等聯(lián)用分析方法的不斷發(fā)展，可以輕松快速地識別中藥中的更多微量成分。針對非靶向分析，離線 2D LC-HRMS聯(lián)用技術是最有效的方法，可用于鑒定中藥中的多種成分，尤其是該技術與離子淌度聯(lián)用時。在自動化和標準操作以及計算機輔助數(shù)據(jù)挖掘等方面的更多進展將提高重復性并減少該方法的數(shù)據(jù)分析時間。應該指出的是，大多數(shù)非靶向研究僅關注中藥中的幾種次級代謝產(chǎn)物，如皂苷、黃酮類、生物堿、酚酸和萜烯類，普遍認為這些產(chǎn)物與生物活性相關。但是，應該更多地重視中藥中其他含量豐富的成分，如單寧、多糖、脂類和蛋白質，這些成分也可能影響藥理活性，從而影響質量。對于在線全2D LC-HRMS聯(lián)用技術，改進第二維色譜柱的分析時間將顯著提高峰容量。而針對中心切割2D LC方法，更好地集成接口可能使該方法更適用于中藥的質量控制。在LC-MS分析中，IM技術為成分分析提供了一個額外的參數(shù)，非常有利于鑒定。提高IM分離將使其更適用于中藥的化學分析。在LC-HRMS分析中，采用DDA模式最大程度地暴露中藥化學成分的二級碎片需要及其精巧的設計。然而，只有特定類型的化合物能產(chǎn)生DDA模式所需的碎片離子信息。DIA是一種生成MS/MS碎片的非靶向模式，它需要通過計算方法來解決碎片離子信息。DIA領域仍需要更多創(chuàng)新方法。實用性和覆蓋率是靶分析的兩大主要方面。MRM的覆蓋范圍越廣，驗證效果越好，就越能提供更可靠的中藥質量信息的相關信息。SIM方法結合使用緊湊穩(wěn)健的質譜儀，其實用性可能引起行業(yè)內中藥質量標準模式的變革。隨著SFC-MS聯(lián)用技術重復性和穩(wěn)健性的提高，一旦設計出更多專用色譜柱，就可以將該方法用于更多化學分析中。R、Python或MATLAB等計算機語言非常有利于理解和處理從LC-HRMS中獲取的大數(shù)據(jù)集。GNPS是一個非常有用的MS/MS數(shù)據(jù)分類和數(shù)據(jù)匹配平臺。在不遠的將來，人工智能（AI）必將成為數(shù)據(jù)挖掘最重要的手段。隨著對中藥化學性質認識的加深，所有質量相關化學信息均可以以全息方式儲存在物質數(shù)據(jù)庫中。
檢測成本和檢測時間是評估中藥質量標準實用性的兩個重要因素。采用SSDMC法和一法多用法執(zhí)行更多應用和標準規(guī)范。“深入研究，淺出標準”的理念將提高中藥質量標準，并更容易將中藥轉化為藥品。
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