HPLC方法設定時有一個重要的參數(shù)，那就是流速。對于不同規(guī)格(柱管內(nèi)徑、填料粒徑等)的色譜柱，往往能發(fā)揮它們最佳性能的流速（即最佳流速）也會不一樣。
記得在讀研期間第一次接觸到有機狗必備技能“過柱子”時，指導我們的師兄給我們推薦了一篇1976年發(fā)表的JOC“神文”——“Rapid chromatographic technique for preparative separations with moderate resolution”，這篇文章的引用超過9000次（如圖1），這是一個非常驚人的數(shù)據(jù)，可見影響之廣泛深遠。
圖1 谷歌學術上的檢索結果
這篇文章的核心就是發(fā)現(xiàn)硅膠柱的分離性能對洗脫速度很敏感，最好是采用相對高的洗脫液流速，而文章采用給硅膠柱加壓，通過氣流控制閥來控制洗脫速度（比如文章中控制的流速為2 in./min），從而實現(xiàn)快速而高效的分離。其實早在1956年，J. J. van Deemter就提出了van Deemter曲線及其方程式，這個方程描述了線速度與理論塔板高度（或柱效）的關系，它不僅適用于氣相色譜，也適用于液相色譜。
這個方程比較復雜，如果只關心理論塔板高度（HETP或H）、流速（線速度，u）及填料顆粒度（dp）的關系，van Deemter方程可以簡化為：
第一項[a(dp)]代表顆粒度和柱床填裝的優(yōu)劣程度，第二項(b/u)代表軸向擴散，第三項[c(dp)2u]代表傳質(zhì)。所擬合的理論曲線如圖2：
圖2 理論上的van Deemter曲線
從圖中可以看到曲線上存在一個最低點，這個點所對應的橫坐標就是最佳的流速（線速度）。因此，當我們使用填料粒徑相同而柱管內(nèi)徑（i.d.）不同的柱子時，可以由已知的一個規(guī)格色譜柱（如5μm，4.6 mmi.d.）的最佳流速F（1 ml/min）通過簡單的換算，即保持線速度不變就可以得到另一個規(guī)格的色譜柱（如5μm，2.1 mm i.d.）的最佳流速F（0.2 ml/min）,即：
但是填料的顆粒度也同樣影響最佳流速。隨著填料技術的發(fā)展，越來越小粒徑的填料被用于實際分析中，圖3是不同顆粒度的填料的理論踏板高度與線速度關系的實測曲線：
圖3 不同粒徑填料的理論塔板高度與線速度關系的實測曲線
可以看出顆粒度越小，其實現(xiàn)最佳柱效的線速度越高；同時，顆粒度越小，曲線后端越平緩——即柱效隨流速升高而降低的程度越小，特別是亞2 μm的顆粒，這也就是為什么亞2 μm的顆粒常被稱為UPLC級別的顆粒，因為它可以在儀器允許的范圍內(nèi)不斷加大流速，在基本不降低分離度的前提下不斷提高分析效率。
對于內(nèi)徑不同、顆粒度不同的色譜柱之間最佳流速的轉換有個經(jīng)驗公式，即：
流速F與柱內(nèi)徑（i.d.）的平方成正比，與顆粒度（dp）成反比。一般來說，亞2μm填料的UPLC色譜柱所需要的最佳流速通常是常規(guī)流速的1.5-2倍，因此在UPLC中有“二倍流速”的習慣說法，和上面介紹的公式計算出來的結果差別不大。
在這里要說明一下，上面的流速轉換方程只適用于同類填料之間，比如都是全多孔的或者都是表面多孔的，否則上述公式不適用。
有了這個轉換公式，我們就可以根據(jù)一個已知的最佳流速很方便地得到同類填料其他規(guī)格的柱子的最佳流速了。附常用規(guī)格柱子的最佳流速表換算表（以5 μm，4.6 mm i.d.規(guī)格全多孔色譜柱最佳流速為1 ml/min為換算的數(shù)據(jù)基礎）：
備注：這個數(shù)據(jù)僅供參考，和實際上常用的流速會有一定的差異。其實影響最佳流速的因素除了色譜柱內(nèi)徑和填料顆粒度，還有溶質(zhì)擴散系數(shù)Dm,而Dm和流動相的性質(zhì)、溫度和分析物的性質(zhì)等因素有關，比如一般蛋白多肽類產(chǎn)品擴散系數(shù)Dm較小，其設定的流速往往比一般小分子的稍小。具體可以參考下面這個公式：
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