近日，國(guó)家藥監(jiān)局批準(zhǔn)了《化妝品中他克莫司和吡美莫司的測(cè)定》化妝品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法，內(nèi)容如下：
化妝品中他克莫司和吡美莫司的測(cè)定
（BJH 202301）
1、 范圍
本方法規(guī)定了化妝品中他克莫司和吡美莫司的測(cè)定方法。
本方法適用于膏霜乳類(lèi)、液體（水、油）類(lèi)化妝品中他克莫司和吡美莫司的定性和定量測(cè)定。
2 方法提要
樣品經(jīng)甲醇超聲提取后，采用高效液相色譜儀分離，質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)。根據(jù)保留時(shí)間和特征離子對(duì)豐度比定性，待測(cè)組分相對(duì)應(yīng)離子峰面積定量，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。
3、 試劑與材料
除另有規(guī)定外，本方法中所用試劑均為分析純及以上規(guī)格，水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。
3.1 甲醇，色譜純。
3.2 乙酸銨，色譜純。
3.3 乙酸，色譜純。
3.4 含0.1%乙酸-5mmol/L乙酸銨的水溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.3854g乙酸銨（3.2），加入1.0mL乙酸（3.3），用水溶解并稀釋至1000mL，混勻。
3.5 含0.1%乙酸-5mmol/L乙酸銨的甲醇溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.3854g乙酸銨（3.2），加入1.0mL乙酸（3.3），用甲醇（3.1）溶解并稀釋至1000mL，混勻。
3.6 標(biāo)準(zhǔn)品：他克莫司、吡美莫司的標(biāo)準(zhǔn)品純度均≥95.0%，標(biāo)準(zhǔn)品的中文名稱(chēng)、英文名稱(chēng)、CAS號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)式見(jiàn)附錄A中的表A.1。
3.7 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：稱(chēng)取他克莫司、吡美莫司標(biāo)準(zhǔn)品各10mg（精確到0.00001g），分別置于10mL棕色容量瓶中，用甲醇（3.1）溶解并定容至刻度，混勻。制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的質(zhì)量濃度均為1000mg/L。置于-18℃冰箱中保存。
3.8 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確移取他克莫司、吡美莫司標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（3.7）0.1mL置于10mL容量瓶中，用甲醇（3.1）稀釋至刻度，搖勻。制成濃度為10mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。置于-18℃冰箱中保存。
4、 儀器與設(shè)備
4.1 高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀。
4.2 分析天平：感量0.0001g和0.00001g。
4.3 超聲波清洗器。
4.4 渦旋混合儀。
4.5 高速離心機(jī)。
5、 試樣制備與保存
樣品應(yīng)按照標(biāo)簽標(biāo)示的貯存條件進(jìn)行保存。取樣前，應(yīng)檢查封口的完整性，觀察樣品的性狀和特征，并使樣品混勻。打開(kāi)包裝后，應(yīng)盡可能快地取出所要測(cè)定部分進(jìn)行分析，取樣后，應(yīng)將樣品進(jìn)行密封保存。
6、 分析步驟
6.1 篩查用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液
取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（3.8）適量，用甲醇（3.1）進(jìn)行稀釋?zhuān)渲瞥伤四尽⑦撩滥緷舛葹?.0μg/L的篩查用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。
6.2 空白基質(zhì)提取液
稱(chēng)取空白試樣0.2g（精確到0.0001g），置于10mL具塞比色管中，自“加入8mL甲醇”起與樣品同法處理（6.5），作為空白基質(zhì)提取液。
6.3 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液
準(zhǔn)確量取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液（3.8）0.1mL置于10mL容量瓶中，用空白基質(zhì)提取液（6.2）稀釋至刻度，搖勻，制成他克莫司、吡美莫司濃度為100μg/L的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。
6.4 基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液
分別精密量取基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（6.3）適量，用空白基質(zhì)提取液（6.2）配制濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、20、50μg/L的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液?；|(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配。
6.5 樣品處理
稱(chēng)取混合均勻的試樣約0.2g（精確至0.0001g）于10mL具塞比色管中，加入8mL甲醇（3.1），于渦旋混合儀上振蕩30s至試樣與提取溶劑混合均勻。超聲提取15min，靜置至室溫，然后用甲醇（3.1）定容至刻度，搖勻，以4000 r/min離心5min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜濾過(guò)，濾液作為供試品溶液備用（供試品溶液可根據(jù)實(shí)際濃度進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)?/span>
6.6 儀器參考條件
6.6.1 色譜條件
色譜柱：C18柱（2.1mm×100mm，1.7μm），或等效色譜柱；
流動(dòng)相：A為含0.1%乙酸-5mmol/L乙酸銨的水溶液，B為含0.1%乙酸-5mmol/L乙酸銨的甲醇溶液。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。
流速：0.3mL/min；
柱溫：45℃；
進(jìn)樣量：2μL。
表1 梯度洗脫程序
|
時(shí)間（min） |
流動(dòng)相A (%) |
流動(dòng)相B (%) |
|
0 |
70 |
30 |
|
0.5 |
70 |
30 |
|
3 |
30 |
70 |
|
8 |
2 |
98 |
|
11 |
2 |
98 |
|
11.3 |
70 |
30 |
|
15 |
70 |
30 |
6.6.2 質(zhì)譜條件
離子源：電噴霧離子源（ESI源）；
監(jiān)測(cè)模式：正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM），監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)參數(shù)設(shè)定見(jiàn)表2。
表2 他克莫司、吡美莫司監(jiān)測(cè)離子對(duì)及相關(guān)參數(shù)設(shè)定
|
組分名稱(chēng) |
母離子（m/z） |
子離子（m/z） |
CE（eV） |
|
他克莫司 |
821.6 |
768.6* |
20 |
|
576.4 |
27 |
|
吡美莫司 |
827.6 |
774.6* |
23 |
|
564.4 |
27 |
“*”為推薦的定量離子。
注：當(dāng)采用不同質(zhì)譜儀器時(shí)，儀器參數(shù)可能存在差異，測(cè)定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。
6.7 定性判定
取供試品溶液（6.5）與篩查用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（6.1）在相同分析條件下測(cè)定，樣品中如呈現(xiàn)定量離子對(duì)和定性離子對(duì)的色譜峰，被測(cè)成分的特征離子峰保留時(shí)間與篩查用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（6.1）對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間一致，且選擇的監(jiān)測(cè)離子對(duì)的相對(duì)豐度比與相當(dāng)濃度的篩查用混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（6.1）的監(jiān)測(cè)離子對(duì)的相對(duì)豐度比的最大偏差不超過(guò)表 3 的規(guī)定，則可以判定樣品中存在對(duì)應(yīng)的組分。
表3 定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度比的最大允許偏差
|
相對(duì)離子豐度（k） |
k＞50% |
50%≥k＞20% |
20%≥k＞10% |
k≤10% |
|
允許最大偏差 |
±20% |
±25% |
±30% |
±50% |
6.8 定量測(cè)定
取基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（6.4）依次測(cè)定，以待測(cè)組分的系列濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)組分的峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.99。
取供試品溶液（6.5）測(cè)定，將對(duì)應(yīng)的定量離子對(duì)色譜峰面積代入基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。按“7”項(xiàng)下公式，計(jì)算樣品中待測(cè)組分的含量。
6.9 平行試驗(yàn)
按以上步驟，對(duì)同一樣品進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)測(cè)定。
6.10 空白試驗(yàn)
除不加試樣外，均按上述測(cè)定條件和步驟進(jìn)行。
7 結(jié)果計(jì)算
結(jié)果按式（1）計(jì)算：
式中：
ω―樣品中他克莫司、吡美莫司的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/kg；
ρ―供試品溶液中他克莫司、吡美莫司的質(zhì)量濃度，μg/L；
V―樣品定容體積，mL；
m―樣品取樣量，g；
D―稀釋倍數(shù)（如未稀釋則為1）。
在相同條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)試結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。
8 精密度與準(zhǔn)確度
多家實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證回收率為80%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%（n=6）。
9 檢出限和定量限
本方法中他克莫司、吡美莫司的檢出限、定量下限及取樣量為0.2g時(shí)的檢出濃度、最低定量濃度見(jiàn)表4。
表4 他克莫司、吡美莫司的檢出限、定量下限、檢出濃度和最低定量濃度
|
組分名稱(chēng) |
檢出限 |
定量下限 |
檢出濃度 |
最低定量濃度（mg/kg） |
|
（ng） |
（ng） |
（mg/kg） |
|
他克莫司 |
0.0004 |
0.001 |
0.01 |
0.025 |
|
吡美莫司 |
0.0004 |
0.001 |
0.01 |
0.025 |
10、 圖譜
圖1 他克莫司標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖
圖2 吡美莫司標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖
附錄A
他克莫司、吡美莫司的相關(guān)信息
表A.1 他克莫司、吡美莫司的中文名稱(chēng)、英文名稱(chēng)、CAS號(hào)、分子式、
相對(duì)分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)式
|
中文名稱(chēng) |
英文名稱(chēng) |
CAS號(hào) |
分子式 |
相對(duì)分子質(zhì)量 |
結(jié)構(gòu)式 |
|
他克莫司 |
Tacrolimus |
104987-11-3 |
C44H69NO12 |
804.02 |
 |
|
吡美莫司 |
Pimecrolimus |
137071-32-0 |
C43H68NO11Cl |
810.45 |
 |
起草單位：山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院
主要起草人：李啟艷、王維劍、牛水蛟、于海英
驗(yàn)證單位：中國(guó)食品藥品檢定研究院、上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院、深圳市藥品檢驗(yàn)研究院
京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
