雜質(zhì)研究與控制作為藥品質(zhì)量可控性的重要衡量指標之一，在藥物研究中占有舉足輕重的地位。雜質(zhì)研究的基礎(chǔ)是工藝設(shè)計，其根本在于藥物中雜質(zhì)譜的分析，雜質(zhì)控制在于通過專屬，靈敏和準確的方法對雜質(zhì)進行限度或限量的檢測與控制，而雜質(zhì)控制中的關(guān)鍵是方法的合理選擇與驗證。目前，雜質(zhì)控制如有關(guān)物質(zhì)多采用HPLC的方法，那么在開發(fā)雜質(zhì)控制的HPLC方法中色譜條件的選擇即為首要任務(wù)，如何能高效的開發(fā)出專屬性強，靈敏度和準確度高的色譜方法呢，本文從“k、α、n”談?wù)勲s質(zhì)控制中色譜條件的選擇，希望可以給廣大同行以參考。
色譜條件選擇首要目標是明確色譜條件中的參數(shù)及可接受標準，包括色譜柱、流動相及洗脫方式、檢測波長、柱溫、流速和進樣體積，那么色譜條件的選擇也就是以上參數(shù)的開發(fā)與擬定的過程。那么，在以上參數(shù)均為可變量時，哪些是相對影響程度低的可先固定不變呢，依經(jīng)驗分析可先固定進樣體積、流速和柱溫為常用參數(shù)，比如進樣體積10μl或20μl，流速1.0ml/min（如常規(guī)的4.6mm內(nèi)徑和5μm或3.5μm的粒徑色譜柱），柱溫30℃或5℃。檢測波長可根據(jù)200-400nm的全波長掃描結(jié)果擬定或者根據(jù)可參考的標準進行擬定。那么，首先需要變化的就是色譜柱和流動相及洗脫方式。在討論過參數(shù)之后，可接受標準更是關(guān)鍵，以有關(guān)物質(zhì)的方法為例，如，主成分S、其特定雜質(zhì)S-1、S-2，需開發(fā)S的有關(guān)物質(zhì)HPLC方法，那么在選擇色譜條件的時候，首要的是專屬性，而專屬性中的重要衡量指標就是分離度，即擬定的方法的系統(tǒng)適用性要求中，雜質(zhì)S-1、S-2與主峰之間的分離度需滿足要求，兩個雜質(zhì)之間的分離度需滿足要求。這里面劃重點的內(nèi)容就是分離度，分離度的計算公式如下，從公式可以看出其影響因素分別為k、α、n。
首先，談?wù)?alpha;對色譜條件選擇的影響，α（選擇性）的主要影響因素體現(xiàn)為色譜柱，根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特點選擇不同的色譜柱型號，如目標物S為含多個-OH及-COOH結(jié)構(gòu)的化合物，勢必C18柱無法實現(xiàn)有關(guān)物質(zhì)的方法開發(fā)，因為其主成分的tR時間極可能為2min左右的溶劑出峰位置出峰，也就是隨著t0就被洗脫了，那么就可以考慮改用C8或者-NH2柱進行分析。在根據(jù)待分析物的結(jié)構(gòu)特征擬定了色譜柱的型號之后，不同的廠家的選用的硅膠處理技術(shù)不同，還會給選擇性帶來很顯著的差異，如在開發(fā)化合物S的異構(gòu)體方法過程中，選用色譜柱1時，無論流動相的比例如何調(diào)整，特定雜質(zhì)S-1始終與異構(gòu)體雜質(zhì)重合，但是當(dāng)選用色譜柱2后，特定雜質(zhì)不再干擾異構(gòu)體雜質(zhì)的測定，如圖1所示（BM-A），可見，色譜柱是α的關(guān)鍵風(fēng)險因素，在優(yōu)化分離度過程中，特別是組分的k值很大，且有重疊時，改變α是關(guān)鍵。
其次，談?wù)刱對色譜條件選擇的影響，k（保留值）的影響因素相對較多，比如色譜柱，流動相，柱溫，流速等均會對保留值帶來影響，那么如何協(xié)調(diào)幾個因素，在較短的時間內(nèi)找到合適的色譜條件呢，通常先選定色譜柱，柱溫和流速可以預(yù)先設(shè)定值進行固定，然后擬定流動相，如有機相選擇單相的甲醇或乙腈，或者多相結(jié)合，水相選擇水，酸性水如磷酸水、三氟乙酸水或者醋酸水等，或者緩沖鹽，或者堿性水如三乙胺水等。流動相的種類確定之后就是洗脫方式的選擇對待分析的有關(guān)物質(zhì)進行分析了。如有關(guān)物質(zhì)的方法開發(fā)時，有關(guān)物質(zhì)包括中間體、副產(chǎn)物和降解產(chǎn)物等，各化合物的極性差別較大，多采用梯度洗脫的方法同時分析幾個雜質(zhì)，此時變化梯度的速率就是影響k值的一個表現(xiàn)，如圖2所示。另外，在梯度變化對k值的影響較小時，可以通過改變pH值調(diào)節(jié)各化合物的k值而實現(xiàn)分離，如圖3所示。此外，有時候僅僅是變化柱溫和流速也可以使k值發(fā)生變化，達到有效的分離目的，如圖4和圖5所示。
最后，談?wù)刵對色譜條件選擇的影響，柱效在色譜條件中同樣發(fā)揮著重要的作用，在方法開發(fā)的過程中時而出現(xiàn)擬定的色譜條件無法達到系統(tǒng)適用性中的分離度的要求了，可能我們會懷疑自己的流動相比例是不是設(shè)置錯了，那個參數(shù)不對了，自己配制的流動相是不是出現(xiàn)了偏差，此時，出現(xiàn)偏差的可能就是色譜柱了，某些化合物的分離對柱子的柱效要求比較高，當(dāng)柱效降低之后就會發(fā)生分離度不能滿足要求的情況發(fā)生。那么在方法開發(fā)過程中柱效是不是也同樣重要，答案是肯定的，在兩個極性極為接近的化合物的分離中，因為k值接近，無論變化哪些參數(shù)，均無能為力的時候，可以考慮選擇柱效更高的色譜柱，那么如何提高色譜柱的柱效呢，可以通過更小內(nèi)徑和粒徑的色譜填料實現(xiàn)，但是同樣需要兼顧選用的液相的耐受的最高壓力，避免方法無法實施。如圖6所示，即為選用更高柱效的色譜柱后，實現(xiàn)了某個未知雜質(zhì)間的有效分離。在k值接近的時候，選擇改變n也是行之有效的方法。
綜上所述，雜質(zhì)控制方法中色譜條件的開發(fā)第一步是解決待分析物中的分離度問題，分離度的三個影響因素k、α、n在色譜條件的選擇中發(fā)揮著不同的作用，在方法開發(fā)的進程中能夠巧妙的運動幾個因素的發(fā)揮作用的閾值點，往往可以起到事半功倍的效果，能夠在最短的時間完成最佳的色譜條件的選擇與擬定，既節(jié)省了時間成本又節(jié)省了經(jīng)濟成本。
參考文獻：
實用高效液相色譜法的建立。
京公網(wǎng)安備11010802046783號
