1、HLA I類單抗原特異性抗體檢測試劑盒的主要組成成分
表1 主要組成成分
2、HLA I類單抗原特異性抗體檢測試劑盒的產(chǎn)品預(yù)期用途
本產(chǎn)品用于體外定性檢測血清樣本中的HLA I類特異性IgG抗體。
本產(chǎn)品使用包被有純化的I類HLA抗原的微珠和預(yù)先優(yōu)化的試劑來檢測人血清中的I類HLA抗體，可確認(rèn)抗體特異性，以幫助移植供體受體匹配。
3、HLA I類單抗原特異性抗體檢測試劑盒的檢驗(yàn)原理
待測血清與微珠一同孵育。待測血清中存在的HLA抗體與微珠上的抗原相結(jié)合，然后使用藻紅蛋白標(biāo)記羊抗人IgG二抗進(jìn)行標(biāo)記。多功能流式點(diǎn)陣儀或多功能流式分析儀可以同時(shí)檢測每個(gè)微珠上的藻紅蛋白發(fā)射的熒光信號(hào)以及微珠染色編號(hào)，并可近乎實(shí)時(shí)獲取數(shù)據(jù)。待測血清的反應(yīng)模式與該批次抗原特異工作表進(jìn)行比較，以確定HLA抗體的特異性。
4、HLA I類單抗原特異性抗體檢測試劑盒的主要原材料
1）主要原材料的選擇
本產(chǎn)品主要原材料包括微珠，HLA I 類抗原。其中HLA I類抗原為重組表達(dá)抗原。
微珠為外購，HLA I類抗原為自制。開發(fā)人制定了各主要原材料質(zhì)量要求并經(jīng)檢驗(yàn)合格。
2）企業(yè)參考品和質(zhì)控品設(shè)置情況
開發(fā)人設(shè)計(jì)了完整的企業(yè)參考品，包括HLA I類抗體陽性參考品，陰性參考品，HLA II類抗體陽性參考品。參考品采用臨床樣本和單克隆抗體制備而成，涵蓋了本產(chǎn)品聲稱的所有79種HLA I類抗體血清型，其設(shè)置及來源見下表：
所有參考品中相關(guān)抗體的特異性采用已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行確認(rèn)。各項(xiàng)企業(yè)參考品綜合用于產(chǎn)品企業(yè)參考品符合性等性能評(píng)估，抗原原材料特異性驗(yàn)證以及內(nèi)部質(zhì)量控制。
5、HLA I類單抗原特異性抗體檢測試劑盒的生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究
開發(fā)人通過企業(yè)參考品檢驗(yàn)等功能性試驗(yàn)確定最佳的生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系，包括：抗原包被濃度，抗原包被孵育時(shí)間，洗滌緩沖液用量，微珠緩沖液用量，二抗用量，反應(yīng)孵育條件及離心條件；同時(shí)通過檢測臨床樣本確定最佳的樣本用量以及微珠溶液用量。
6、HLA I類單抗原特異性抗體檢測試劑盒的分析性能評(píng)估
本產(chǎn)品分析性能包括企業(yè)參考品符合性、準(zhǔn)確度、精密度、最低檢測限、特異性（交叉反應(yīng)、干擾試驗(yàn)）、包容性。開發(fā)人開展了多批產(chǎn)品（010、011、012、013批）在適用機(jī)型上的性能評(píng)估。
1）企業(yè)參考品符合性
采用企業(yè)參考品，包括HLA I類抗體陽性參考品，陰性參考品，HLA II類抗體陽性參考品對(duì)本產(chǎn)品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果均符合要求。
2）準(zhǔn)確度
采用本產(chǎn)品與已上市同類產(chǎn)品（流式熒光免疫法）進(jìn)行比較研究試驗(yàn)，共檢測72份樣本，樣本涵蓋本產(chǎn)品聲稱的所有HLA I類抗體的血清型。在三批產(chǎn)品兩個(gè)機(jī)型的陽性符合率為90.73% -91.76%，陰性符合率為95.96% - 97.95%， 總符合率為94.91% -96.59%，表明兩種方法具有較好的一致性。
3）精密度
采用經(jīng)過其他方法驗(yàn)證或來自經(jīng)認(rèn)可的專業(yè)組織的14個(gè)參考樣本，樣本涵蓋本產(chǎn)品聲稱的所有HLA I類抗體的血清型。在三個(gè)研究中心（One Lambda, Inc.、加州大學(xué)洛杉磯分校和 Terasaki 創(chuàng)新中心）的適用儀器上進(jìn)行了測試。符合率為93.74% - 98.01%，結(jié)果表明試劑性能穩(wěn)定。
4）最低檢測限
選擇了來自不同獻(xiàn)血者的樣本，這些樣本幾乎涵蓋了該試劑可檢測到的所有特異性抗體。在連續(xù)稀釋后，對(duì)樣本進(jìn)行測試，并將稀釋后的樣本與未稀釋(原)樣本的結(jié)果進(jìn)行比較，以評(píng)估總體一致性?？紤]到原樣本之間存在抗體水平/親和力的差異，最低檢測限定義為當(dāng)一致性率>90%時(shí)的最大稀釋因子。結(jié)果表明，當(dāng)每個(gè)樣本以 1：2 和1：4的比例稀釋時(shí)，符合本產(chǎn)品可接受標(biāo)準(zhǔn)。
5）特異性
在交叉反應(yīng)研究中，對(duì)含有HLA II類抗體，甲型流感抗體，水痘抗體，乙肝抗體，丙肝抗體，抗核抗體，抗雙鏈DNA抗體，IL-6（促炎癥）抗體，促甲狀腺素抗體，乙酰膽堿受體抗體的樣本進(jìn)行交叉反應(yīng)評(píng)價(jià)，結(jié)果表明本產(chǎn)品與上述樣本均不產(chǎn)生交叉反應(yīng)。
在干擾試驗(yàn)研究中，將以下可能產(chǎn)生干擾的內(nèi)源及外源性物質(zhì)加入每個(gè)待測樣本中并與該樣本的未處理形式進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：樣本中可能存在的內(nèi)源性干擾物質(zhì)白蛋白（15mg/mL），D-葡萄糖(9.9mg/mL)，膽紅素(0.2mg/mL)，膽固醇(5.031mg/mL)，肌酸酐(0.05mg/mL)，血紅蛋白(2mg/mL)，在所示濃度時(shí)對(duì)本試劑不產(chǎn)生干擾；外源性飲食/藥物維生素C(0.0299mg/mL)，咖啡因
(0.0598mg/mL)，尼古丁(0.001 mg/mL)，撲熱息痛(0.2mg/mL)，布洛芬(0.5mg/mL)，利妥昔單抗(10mg/mL)，水楊酸(0.000694mg/mL)，在所示濃度時(shí)對(duì)本試劑不產(chǎn)生干擾。
6）包容性
采用92個(gè)已知特異性的樣本進(jìn)行研究，這些樣本涵蓋了常見的HLA I類抗體分子型。結(jié)果表明，本產(chǎn)品具有檢測出常見的不同HLAI類抗體型別的能力。
7、HLA I類單抗原特異性抗體檢測試劑盒的陽性判斷值研究
對(duì)于給定的樣本，產(chǎn)品會(huì)為血清中存在的HLA抗體確定MFI值，通過計(jì)算對(duì)MFI值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化確定每個(gè)抗HLA反應(yīng)的強(qiáng)度，并為手動(dòng)分配反應(yīng)評(píng)分提供依據(jù)。同樣，采集的MFI值可以由軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并分配反應(yīng)評(píng)分。反應(yīng)評(píng)分基于國際權(quán)威組織ASHI（美國組織相容性與免疫遺傳學(xué)學(xué)會(huì)）的評(píng)分系統(tǒng)，該評(píng)分系統(tǒng)通過補(bǔ)體依賴性淋巴細(xì)胞毒性交叉配型試驗(yàn)（CDC）建立，使用細(xì)胞死亡百分比的分級(jí)量表來表示反應(yīng)強(qiáng)度，評(píng)分1、2、4、6和8分別表示陰性、疑似陰性、弱陽性、陽性和強(qiáng)陽性?；诖?，本產(chǎn)品推薦使用的陽性判斷值為：評(píng)分為6和8時(shí)為陽性。
在驗(yàn)證研究中，采用了從經(jīng)認(rèn)證的HLA實(shí)驗(yàn)室收集的54個(gè)臨床樣本對(duì)本產(chǎn)品進(jìn)行了評(píng)估。這些樣本由多個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用不同檢測方式所得的測試結(jié)果匯編而來，因此可作為參考樣本，其結(jié)果為共識(shí)結(jié)果。將本產(chǎn)品所檢測結(jié)果與共識(shí)結(jié)果進(jìn)行比較分析，匹配百分比為97%。
8、HLA I類單抗原特異性抗體檢測試劑盒的穩(wěn)定性研究
開發(fā)人對(duì)本產(chǎn)品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的實(shí)時(shí)穩(wěn)定性、試劑開包裝穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性等進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，確定了在各種條件下試劑的有效保存時(shí)間。所用試劑批次包括：008、009、010批。
實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究：采用三批次試劑儲(chǔ)存于-65°C或以下冷凍的條件，分別在0、6、13、17、24、35、42個(gè)月對(duì)HLA I類抗體陽性參考品，陰性參考品，HLA II類抗體陽性參考品進(jìn)行檢測，確定試劑在-65°C或以下冷凍的條件下，可穩(wěn)定保存36個(gè)月。
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