1、HLA II 類單抗原特異性抗體檢測試劑盒的主要組成成分
表1 主要組成成分
2、HLA II 類單抗原特異性抗體檢測試劑盒的產(chǎn)品預(yù)期用途
本產(chǎn)品用于體外定性檢測人血清樣本中的 HLA II 類特異性IgG 抗體。
本產(chǎn)品使用包被有純化的 II類HLA抗原的微珠和預(yù)先優(yōu)化的試劑來檢測人血清中的 II 類 HLA 抗體，可確認(rèn)抗體特異性，以幫助移植供體受體匹配。
3、HLA II 類單抗原特異性抗體檢測試劑盒的檢驗原理
待測血清與微珠一同孵育。待測血清中存在的 HLA 抗體與微珠上的抗原相結(jié)合，然后使用藻紅蛋白標(biāo)記羊抗人 IgG 二抗進(jìn)行標(biāo)記。多功能流式點陣儀或多功能流式分析儀可以同時檢測每個微珠上的藻紅蛋白發(fā)射的熒光信號以及微珠染色編號，并可近乎實時獲取數(shù)據(jù)。待測血清的反應(yīng)模式與該批次抗原特異工作表進(jìn)行比較，以確定 HLA 抗體的特異性。
4、HLA II 類單抗原特異性抗體檢測試劑盒的主要原材料
1）主要原材料的選擇
本產(chǎn)品主要原材料包括微珠，HLA II 類抗原。其中 HLA II類抗原為重組表達(dá)抗原。
微珠為外購，HLA II 類抗原為自制。開發(fā)人制定了各主要原材料質(zhì)量要求并經(jīng)檢驗合格。
2）企業(yè)參考品和質(zhì)控品的設(shè)置情況
開發(fā)人設(shè)計了完整的企業(yè)參考品，包括 HLA II 類抗體陽性參考品，陰性參考品，HLA I 類抗體陽性參考品。參考品采用臨床樣本和單克隆抗體制備而成，涵蓋了本產(chǎn)品聲稱的所有 39 種 HLAII 類抗體血清型，其設(shè)置及來源見下表：
所有參考品中相關(guān)抗體的特異性采用已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行確認(rèn)。各項企業(yè)參考品綜合用于產(chǎn)品企業(yè)參考品符合性等性能評估，抗原原材料特異性驗證以及內(nèi)部質(zhì)量控制。
5、HLA II 類單抗原特異性抗體檢測試劑盒的生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究
開發(fā)人通過企業(yè)參考品檢驗等功能性試驗確定最佳的生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系，包括：抗原包被濃度，抗原包被孵育時間，洗滌緩沖液用量，微珠緩沖液用量，二抗用量，反應(yīng)孵育條件及離心條件；同時通過檢測臨床樣本確定最佳的樣本用量以及微珠溶液用量。
6、HLA II 類單抗原特異性抗體檢測試劑盒的分析性能評估
本產(chǎn)品分析性能包括企業(yè)參考品符合性、準(zhǔn)確度、精密度、最低檢測限、特異性（交叉反應(yīng)、干擾試驗）、包容性。開發(fā)人開展了多批產(chǎn)品（010、011、012、013、014 批）在適用機型上的性能評估。
1）企業(yè)參考品符合性
采用企業(yè)參考品，包括 HLA II 類抗體陽性參考品，陰性參考品，HLA I 類抗體陽性參考品對本產(chǎn)品進(jìn)行檢驗，結(jié)果均符合要求。
2）準(zhǔn)確度
采用本產(chǎn)品與已上市同類產(chǎn)品（流式熒光免疫法）進(jìn)行比較研究試驗，樣本涵蓋本產(chǎn)品聲稱的所有 HLA II 類抗體的血清型。在三批產(chǎn)品兩個機型的陽性符合率為 94.2% - 99.42%，陰性符合率為 97.26% - 98.92%，總符合率為 97.13% - 98.09%，表明兩種方法具有較好的一致性。
3）精密度
采用經(jīng)過其他方法驗證或來自經(jīng)認(rèn)可的專業(yè)組織的 14個參考樣本，樣本涵蓋本產(chǎn)品聲稱的所有 HLA II 類抗體的血清型。在三個研究中心（One Lambda, Inc.、加州大學(xué)洛杉磯分校和Terasaki 創(chuàng)新中心）的適用儀器上進(jìn)行了測試。符合率為 93.46%- 97.74%，結(jié)果表明試劑性能穩(wěn)定。
4）最低檢測限
選擇了來自不同獻(xiàn)血者的樣本，這些樣本幾乎涵蓋了該試劑可檢測到的所有特異性抗體。在連續(xù)稀釋后，對樣本進(jìn)行測試，并將稀釋后的樣本與未稀釋(原)樣本的結(jié)果進(jìn)行比較，以評估總體一致性?？紤]到原樣本之間存在抗體水平/親和力的差異，最低檢測限定義為當(dāng)一致性率>90%時的最大稀釋因子。結(jié)果表明，當(dāng)每個樣本以 1：2 的比例稀釋時，符合本產(chǎn)品可接受標(biāo)準(zhǔn)。
5）特異性
在交叉反應(yīng)研究中，對含有 HLA I 類抗體，甲型流感抗體，甲型流感 H1N1（豬流感）抗體，水痘抗體，乙肝抗體，丙肝抗體，結(jié)核分支桿菌抗體，衣原體抗體，肺炎支原體抗體，巨細(xì)胞病毒抗體，EB 病毒抗體，抗核抗體，抗雙鏈 DNA 抗體，IL-6（促炎癥）抗體，類風(fēng)濕因子，促甲狀腺素抗體，乙酰膽堿受體抗體，CXCL10抗體(γ干擾素誘導(dǎo)蛋白 10)的樣本進(jìn)行交叉反應(yīng)評價，結(jié)果表明本產(chǎn)品與上述樣本均不產(chǎn)生交叉反應(yīng)。
在干擾試驗研究中，將以下可能產(chǎn)生干擾的內(nèi)源及外源性物質(zhì)加入每個待測樣本中并與該樣本的未處理形式進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：樣本中可能存在的內(nèi)源性干擾物質(zhì)白蛋白（15mg/mL），D葡萄糖(9.9mg/mL)，膽紅素(0.2mg/mL)，膽固醇(5.031mg/mL)，肌酸酐(0.05mg/mL)，血紅蛋白(2mg/mL)，在所示濃度時對本試劑不產(chǎn)生干擾；外源性飲食/藥物維生素 C(0.0299mg/mL)，咖啡因
(0.0598mg/mL)，尼古丁(0.001 mg/mL)，撲熱息痛(0.2mg/mL)，布洛芬 (0.5mg/mL) ， 利 妥 昔 單 抗 (10mg/mL) ， 水 楊 酸(0.000694mg/mL)，在所示濃度時對本試劑不產(chǎn)生干擾。
6）包容性
采用 78 個已知特異性的樣本進(jìn)行研究，這些樣本涵蓋了常見的 HLA II 類抗體分子型。結(jié)果表明，本產(chǎn)品具有檢測出常見的不同 HLA II 類抗體型別的能力。
7、HLA II 類單抗原特異性抗體檢測試劑盒的陽性判斷值或參考區(qū)間研究
對于給定的樣本，產(chǎn)品會為血清中存在的 HLA 抗體確定 MFI值，通過計算對 MFI 值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化確定每個抗 HLA 反應(yīng)的強度，并為手動分配反應(yīng)評分提供依據(jù)。同樣，采集的 MFI 值可以由軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并分配反應(yīng)評分。反應(yīng)評分基于國際權(quán)威組織 ASHI（美國組織相容性與免疫遺傳學(xué)學(xué)會）的評分系統(tǒng)，該評分系統(tǒng)通過補體依賴性淋巴細(xì)胞毒性交叉配型試驗（CDC）建立，使用細(xì)胞死亡百分比的分級量表來表示反應(yīng)強度，評分 1、2、4、6 和 8分別表示陰性、疑似陰性、弱陽性、陽性和強陽性。
在驗證研究中，采用了從經(jīng)認(rèn)證的 HLA 實驗室收集的 434 個臨床樣本對本產(chǎn)品進(jìn)行了評估。這些樣本由 50 多個實驗室使用不同檢測方式所得的測試結(jié)果匯編而來，因此可作為參考樣本，其結(jié)果為共識結(jié)果。將本產(chǎn)品所檢測結(jié)果與共識結(jié)果進(jìn)行比較分析，匹配百分比為 100%。
8、HLA II 類單抗原特異性抗體檢測試劑盒的穩(wěn)定性研究
開發(fā)人對本產(chǎn)品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的實時穩(wěn)定性、試劑開包裝穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性等進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，確定了在各種條件下試劑的有效保存時間。所用試劑批次包括：009、010、011、014 批。
實時穩(wěn)定性研究：采用三批次試劑儲存于-65°C 或以下冷凍的條件，分別在 0、4、10、16、23、39、46 個月對 HLA II 類抗體陽性參考品，陰性參考品，HLA I 類抗體陽性參考品進(jìn)行檢測，確定試劑在-65°C 或以下冷凍的條件下，可穩(wěn)定保存 36 個月。
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