評(píng)估合成路線，側(cè)重于起始物質(zhì)、中間體、試劑、催化劑、溶劑、副反應(yīng)產(chǎn)物和降解產(chǎn)物等。對(duì)此，EMEA 建議“應(yīng)基于扎實(shí)的科學(xué)評(píng)價(jià)，全面考慮參與合成的化學(xué)反應(yīng)、原輔料中可能帶入新原料藥的雜質(zhì)和可能的降解產(chǎn)物，確定最有可能在新原料藥的合成、純化和貯存期間出現(xiàn)的實(shí)際和潛在雜質(zhì)。”
可能出現(xiàn)在API 中的潛在基因毒性雜質(zhì)一般可分為以下幾類：
①未反應(yīng)的具有警示結(jié)構(gòu)的物料或中間體(如含氮雜環(huán)API 中未反應(yīng)的硝基芳香化合物，由于不完全氫化作用或位置異構(gòu)體無法環(huán)化)。
②與包含警示結(jié)構(gòu)的物料、中間體或API 本身密切相關(guān)的物質(zhì)(如在工藝中用鹽酸處理后的含羥烷基的API 的氯烷基類似物)。
③通過溶劑和試劑兩者之間的相互合成作用，或與原輔料或中間體的合成作用形成(如由于在磺酰氯的反應(yīng)中，使用了異丙醇脫氧腺苷酸羥基中間體而形成了異丙醇甲苯磺酸鹽)。此外，在API 開發(fā)階段，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估還需考慮來源于生產(chǎn)期間或API 長期貯存期間的降解物。
2、基因毒性雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)評(píng)估
EMEA 和FDA 指南草案都認(rèn)為使用結(jié)構(gòu)評(píng)估是一種有效的方法，可通過它進(jìn)行基因毒性潛在性的評(píng)估。常用的結(jié)構(gòu)評(píng)估商業(yè)軟件是DEREK和Mcase，這兩個(gè)系統(tǒng)費(fèi)用昂貴，小公司也可使用基于Ashby 和Tennant 警示的簡單系統(tǒng)，詳見圖1。
3、基因毒性雜質(zhì)的分類
一旦完成了結(jié)構(gòu)評(píng)估，每個(gè)雜質(zhì)應(yīng)根據(jù)其基因毒性危害進(jìn)行分類。Lutz Mueller 等確定的5 類分類方案已被廣泛用于這個(gè)目的，見表2。
此外，SAR 評(píng)估程序也是有缺陷的，采用SAR評(píng)估程序并不能全面覆蓋所有基因毒性雜質(zhì)。因此需要根據(jù)安全性測(cè)試(Ames 測(cè)試)，單獨(dú)評(píng)估這些雜質(zhì)。如果雜質(zhì)沒有基因毒性標(biāo)記，但在工藝中作為親電試劑使用，仍需通過數(shù)據(jù)庫查詢確定其是否具有基因毒性，比如美國醫(yī)學(xué)圖書館提供的TOXNET 數(shù)據(jù)庫，可通過共同的門戶網(wǎng)站來訪問一系列數(shù)據(jù)庫，如有害物質(zhì)數(shù)據(jù)庫(HazardousSubstances Databank，HSDB)、化學(xué)致癌作用研究信息系統(tǒng)(Chemical Carcinogenesis ResearchInformation System，CCRIS)和集成風(fēng)險(xiǎn)信息系統(tǒng)(Integrated Risk Information System，IRIS)等，提供了許多常見化學(xué)品的安全性數(shù)據(jù)。另一個(gè)相關(guān)的系統(tǒng)是Berkeley 數(shù)據(jù)庫。實(shí)際上，采用足夠的數(shù)據(jù)庫對(duì)化合物特定的成分進(jìn)行基因毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是經(jīng)常的做法，而不是簡單使用TTC 限度進(jìn)行控制。
4、雜質(zhì)潛在遺留的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估
一旦確定具有潛在基因毒性的雜質(zhì)，下一步就是考慮這些雜質(zhì)帶入原料藥中的可能性。由于基因毒性雜質(zhì)經(jīng)常是高活性的，能夠通過下游工藝去除，因此，可以結(jié)合雜質(zhì)的理化性質(zhì)，在下游工藝處理中采用適當(dāng)?shù)姆绞桨阉鼈內(nèi)コ?。例如，生產(chǎn)工藝中經(jīng)常遇到的酸性、堿性條件下可分解或去除雜質(zhì)，或者下游工藝中所用的其他試劑可與基因毒性雜質(zhì)反應(yīng)，使其不易反應(yīng)，從而“安全”。以下針對(duì)基因毒性雜質(zhì)的不同性質(zhì)，提供可行的工藝去除方法。
4.1 反應(yīng)活性
許多基因毒性雜質(zhì)均具有高反應(yīng)活性，例如酰鹵化合物，因其極易反應(yīng)，使得在反應(yīng)結(jié)果中監(jiān)測(cè)它們幾乎無實(shí)際意義。而且，如果有任何殘留，可以通過某些方法有效地去除，如水淬滅或?qū)λ卯a(chǎn)物的簡單水洗。
在工藝中，存在某些殘留物可能殘留在中間體中的可能性。對(duì)于這些化合物，在隨后的工藝步驟中具有高概率的反應(yīng)，例如，在合成早期考慮使用烷基鹵，另一個(gè)烷化劑應(yīng)在下游工藝中使用，則早期使用的烷基鹵殘留很可能消耗在后面階段，見圖2。該工藝中，第一階段用到的烯丙基溴殘留到第三階段，如果仍然存在，將反應(yīng)生成預(yù)期產(chǎn)物的烯丙基類似物。
基因毒性化合物的反應(yīng)活性可按表6 分類，該表只作為一個(gè)參考，具體情況應(yīng)根據(jù)實(shí)際工藝的化學(xué)反應(yīng)來評(píng)估。
4.2 溶解度-分離階段
許多高度親電(往往是基因毒性)的試劑、中間體常常用于優(yōu)化產(chǎn)量和提高產(chǎn)品質(zhì)量的合成工藝中，并常常在溶液中完成反應(yīng)步驟。這便意味著基因毒性反應(yīng)物很可能高度溶于所選擇的溶劑。因此，當(dāng)工藝中將反應(yīng)產(chǎn)物分離為固體時(shí)，基因毒性反應(yīng)物被殘留在反應(yīng)母液中而除去，這可進(jìn)一步通過用一種基因毒性試劑易溶而反應(yīng)產(chǎn)物不溶的溶劑洗滌濾餅，而徹底去除基因毒性反應(yīng)物。這種情況下，基因毒性試劑的溶解度應(yīng)在置換溶劑中評(píng)估，以便確定合適的清除因子。
4.3 揮發(fā)性
許多可能在典型的合成工藝中遇到的基因毒性物質(zhì)是揮發(fā)性的，包括低分子量烷基鹵、醛、氮/硫鹵乙基芥。常用蒸餾方法來降低或完全去除存在的反應(yīng)溶劑，因此也可有效地降低或消除殘留的基因毒性雜質(zhì)。這取決于基因毒性相對(duì)于溶劑沸點(diǎn)的揮發(fā)性。
4.4 電離度
芳香胺是含能電離基團(tuán)的潛在基因毒性物質(zhì)的最好例子。大部分API 和中間體均具有潛在的電離。這種情況下，關(guān)注基因毒性物質(zhì)和基質(zhì)間可能存在的的電離度差異，便能通過改變水相的pH 值并萃取有機(jī)相，來降低基因毒性雜質(zhì)的水平。
硝基化合物還原至胺便是此類工藝的一個(gè)很好的例子。雖然它們具有一個(gè)共同的基因毒性代謝物中間體(一個(gè)正氮離子)，但是可能發(fā)現(xiàn)討論中的硝基化合物具有基因毒性，而其胺類似物則可能沒有。在這種情況下，需要去除硝基前體物，特別是如果相關(guān)的硝基化合物在下游工藝中不活潑，使得它可能以原形完成該工藝。
對(duì)于過量硝基化合物的去除，可以通過使用酸性水層的雙相系統(tǒng)，通過液液萃取來實(shí)現(xiàn)。任何非電離的硝基化合物將殘留在有機(jī)相中，而可電離的胺將殘留在水層中。棄去有機(jī)層，胺則在堿化后在新有機(jī)溶劑層中簡單地反萃取。
在合成常見的止痛藥對(duì)乙酰氨基酚中，倒數(shù)第二階段涉及將4-硝基酚還原至相應(yīng)的胺，反應(yīng)混合物用甲苯萃取，堿化，再萃取胺。
4.5 色譜法
從通過硅酸床的簡單過濾，到制備型液相色譜法，色譜法為API 或中間體中基因毒性雜質(zhì)的去除提供了多種選擇。
制備型液相色譜法一般采用正相模式，即采用極性固定相(一般為硅酸)和非極性流動(dòng)性(有機(jī)溶劑系統(tǒng))。這與分析型液相色譜法不同，因?yàn)榇蟛糠址治錾V法都是在反相模式中進(jìn)行的。制備型液相色譜法采用正相模式是出于分離化合物的需要——使用易被除去的揮發(fā)性溶劑。也可以使用反相模式，但是除去基于水性溶劑系統(tǒng)的困難限制了適用范圍。
Bandichhor 等報(bào)告了利扎曲坦的純化，利扎曲坦是一種5 羥色胺-HT 受體激動(dòng)劑，其合成工藝中生成的基因毒性二聚合物雜質(zhì)不能通過普通的工藝去除，通過分步結(jié)晶和重結(jié)晶工序，不能達(dá)到0.01%的限度。因此，使用適當(dāng)?shù)膒H 值和離子強(qiáng)度改性來開發(fā)反相法，增加利扎曲坦和基因毒性二聚合物之間的選擇性?；蚨拘远酆衔飶?qiáng)烈地保留在柱子上，經(jīng)過優(yōu)化的負(fù)載率達(dá)到最大生產(chǎn)率，而沒有任何可察覺的基因毒性二聚合物帶入到產(chǎn)品中。作者報(bào)告了基因毒性二聚合物水平從約40 000 ppm 減少到40~80 ppm( 產(chǎn)率>95%)。
4.6 重結(jié)晶
重結(jié)晶是去除API 或中間體雜質(zhì)，包括基因毒性雜質(zhì)的最有效方法之一。采用該方法需要選擇一種適合的溶劑，使API 或中間體在高溫情況下高度溶解，而冷卻時(shí)幾乎不溶。高溫條件下通過過濾，去除不易溶于熱溶劑的雜質(zhì)，而較易溶于冷溶劑的雜質(zhì)保留在冷卻后的溶液中，通過過濾分離。
4.7 其他技術(shù)
除以上技術(shù)外，還可通過其他手段去除基因毒性雜質(zhì)，如活性炭和樹脂?；钚蕴拷Y(jié)合重結(jié)晶工藝，可非常有效地去除有色雜質(zhì)。而樹脂去除法類似于萃取和分離技術(shù)，使基因毒性雜質(zhì)吸附在樹脂上，而所需產(chǎn)品保留在溶液中，從而通過過濾除去雜質(zhì)。
應(yīng)用加標(biāo)、清除法進(jìn)一步風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估除了述理論風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估外，還需要通過加標(biāo)清除法定量工藝對(duì)基因毒性雜質(zhì)的實(shí)際去除能力。加標(biāo)(spiking)指的是以固定的數(shù)量加入需要研究的基因毒性物質(zhì)；清除(purging)指的是下游工藝去除目標(biāo)雜質(zhì)的能力。
一種新型的抗肌瘤產(chǎn)品，鹽酸帕唑帕尼的5 個(gè)潛在基因毒性雜質(zhì)的分析控制策略見圖3(基因毒性雜質(zhì)用盒括標(biāo)識(shí))。
討論中的雜質(zhì)中的每一個(gè)以高水平(某些情況下高達(dá)5%)加標(biāo)至工藝中。然后使用雜質(zhì)預(yù)定命運(yùn)圖以證明下游產(chǎn)品中水平的連續(xù)降低。例如，第1階段產(chǎn)品含670 ppm 化合物ii，第2 階段產(chǎn)品23 ppm，而第3 階段產(chǎn)品中間級(jí)API 和最終API含不到1.7 ppm(化合物ii)。這使他們集中于起始物料或中間體的上游控制，并避免需要在制劑中進(jìn)行控制。這種方法的吸引力是它允許控制限度
設(shè)定在較高水平，并保證下游的清除將降低相關(guān)物質(zhì)的水平至可接受水平。它也允許控制策略基于不太復(fù)雜和靈敏的分析方法，這些方法更與常規(guī)質(zhì)量控制環(huán)境有關(guān)。
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