藥用輔料是指生產(chǎn)藥品和調(diào)配處方時(shí)使用的賦形劑和附加劑，是藥物制劑的基礎(chǔ)材料和重要組成部分。
曾出過(guò)問(wèn)題的藥品事件多數(shù)與藥用輔料有關(guān)系，比如齊二藥事件、鉻超標(biāo)膠囊事件等，看起來(lái)是藥品的問(wèn)題，追根溯源是輔料的問(wèn)題。藥用輔料不僅賦予藥物一定劑型，而且與提高藥物的療效、降低不良反應(yīng)有很大的關(guān)系。因此，確保藥用輔料批次間的一致性、制劑中賦形作用的有效性和質(zhì)量可靠性尤為重要。藥典中也設(shè)置了相應(yīng)的功能性指標(biāo)對(duì)其進(jìn)行控制，其中包括分子量分布、聚合度等指標(biāo)。
中國(guó)藥典第四部2020年版通則中針對(duì)分子排阻色譜法提出了一定要求：
分子排阻色譜法：
分子排阻色譜法是根據(jù)待測(cè)組分的分子大小進(jìn)行分離的一種液相色譜技術(shù)。分子排阻色譜法的分離原理為凝膠色譜柱的分子篩機(jī)制。色譜柱多以親水硅膠、凝膠或經(jīng)過(guò)修飾的凝膠如葡聚糖凝膠（Sephadex)和瓊脂糖凝膠（Sepharose)等為填充劑，這些填充劑表面分布著不同孔徑尺寸的孔，藥物分子進(jìn)入色譜柱后，它們中的不同組分按其分子大小進(jìn)入相應(yīng)的孔內(nèi)，大于所有孔徑的分子不能進(jìn)入填充劑顆粒內(nèi)部，在色譜過(guò)程中不被保留，最早被流動(dòng)相洗脫至柱外，表現(xiàn)為保留時(shí)間較短；小于所有孔徑的分子能自由進(jìn)入填充劑表面的所有孔徑，在色譜柱中滯留時(shí)間較長(zhǎng)，表現(xiàn)為保留時(shí)間較長(zhǎng)；其余分子則按分子大小依次被洗脫。
對(duì)儀器的一般要求：
分子排阻色譜法所需的進(jìn)樣器和檢測(cè)器同高效液相色譜法(通則0512)，液相色譜泵一般分常壓、中壓和高壓泵。在藥物分析中，尤其是分子量或分子量分布測(cè)定中，通常采用高效分子排阻色譜法(HPSEC)。
系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：
分子排阻色譜法的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中色譜柱的理論板數(shù)(n)、分離度、重復(fù)性、拖尾因子的測(cè)定方法，在一般情況下，同高效液相色譜法（通則0512）項(xiàng)下方法。
測(cè)定法：
(1) 分子量測(cè)定法
一般適用于蛋白質(zhì)和多肽的分子量測(cè)定。按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法，選用與供試品分子大小相適宜的色譜柱和適宜分子量范圍的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。除另有規(guī)定外，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與供試品均需使用二硫蘇糖醇（DTT)和十二烷基硫酸鈉（SDS)處理，以打開(kāi)分子內(nèi)和分子間的二硫鍵，并使分子的構(gòu)型與構(gòu)象趨于一致，經(jīng)處理的蛋白質(zhì)和多肽分子通常以線性形式分離，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分子量（Mw )的對(duì)數(shù)值對(duì)相應(yīng)的保留時(shí)間tR ) 制得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程lgMw = a + btR，供試品以保留時(shí)間由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算其分子量或亞基的分子量。
(2) 生物大分子聚合物分子量與分子量分布的測(cè)定法
生物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸和膠原蛋白等具有分子大小不均一的特點(diǎn)，故生物大分子聚合物分子量與分子量分布是控制該類產(chǎn)品的關(guān)鍵指標(biāo)。在測(cè)定生物分子聚合物分子量與分子量分布時(shí)，選用與供試品分子結(jié)構(gòu)與性質(zhì)相同或相似的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)十分重要。
ACQUITY Arc GPC系統(tǒng)
案例分享
測(cè)試條件
儀器：waters 1525
檢測(cè)器：waters 2414
色譜柱：Waters Ultrahydrogel 300 x 7.8 mm（500 - 250 - 120 Ao）三根串聯(lián)
流動(dòng)相：0.1mol/L NaNO?水溶液
流速：1mL/min（分析時(shí)間45min）
溫度：40℃
標(biāo)準(zhǔn)品：聚乙二醇
分子量范圍：100-400000
蛋白質(zhì)水解液
糖類聚合物透明質(zhì)酸鈉
示差折光檢測(cè)器(RID)
工作原理：利用組分與流動(dòng)相的折光率的不同,其響應(yīng)信號(hào)(R)與組分的濃度(Ci成正比:R=ZCi(ni-n0) ,式中Z為儀器常數(shù), ni為i組分的折光率, n0為流動(dòng)相的折光率。
優(yōu)點(diǎn)：通用型檢測(cè)器,只要組分的折光率與流動(dòng)相的折光率有足夠的差別就能檢測(cè)。
缺點(diǎn)：靈敏度低、受環(huán)境溫度、流量及流動(dòng)相組成等波動(dòng)的影響大,一般不能用于梯度洗脫。
適用范圍：RID為通用型檢測(cè)器,適用于無(wú)紫外吸收化合物的分析,如糖類分析。
多角度光散射檢測(cè)器 (MALS)
一種靜態(tài)光散射檢測(cè)器，可以測(cè)量樣品的絕對(duì)分子量 (Mw) 和可能的旋轉(zhuǎn)半徑 (Rg)。
使用 MALS 的最常見(jiàn)方法是連接到 HPLC 尺寸排阻色譜 (SEC) 或凝膠滲透色譜 (GPC) 系統(tǒng)，如 OMNISEC。作為該系統(tǒng)的一部分，還必須連接一個(gè)濃度探測(cè)器（折射率或紫外線）。
SEC-MALS 檢測(cè)器可測(cè)量樣品在多個(gè)角度的散射光強(qiáng)，并繪制 Debye 曲線。Debye 曲線對(duì)樣品散射的角度依賴性進(jìn)行建模，用于確定色譜圖中每個(gè)數(shù)據(jù)切片的 Mw 和 Rg。重要的是，需要仔細(xì)考慮為此分析選擇的擬合順序和模型，因?yàn)樗鼤?huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生重大影響。半徑小于 10-15nm 的各向同性散射體會(huì)在各個(gè)方向均勻散射光，這意味著只能測(cè)量 Mw。半徑大于 10-15nm 的各向異性散射樣品，會(huì)在正向散射更多的光，從而可以同時(shí)測(cè)量 Mw 和 Rg。使用 Rg 可以繪制構(gòu)象圖（Rg 對(duì) Mw 的圖），可以測(cè)量樣品之間的任何結(jié)構(gòu)差異。
傳統(tǒng)的光散射法只能確定平均分子量，旋轉(zhuǎn)半徑及第二維里系數(shù)，而 GPC/SEC 又 受泵流速的限制，再加上尋找與待測(cè)物結(jié)構(gòu)相似的標(biāo)準(zhǔn)品不易，對(duì)低濃度高分子量的部分，如 microgel, trimer, dimer 等信號(hào)不敏感，導(dǎo)致誤差增大，色譜柱容易老化。而多角度激光光散射儀(MALLS)與 GPC/SEC 結(jié)合，正可以互相補(bǔ)充，不但可以直接測(cè)得絕對(duì)分子量，還可以對(duì)樣品的組成，從低濃度高分子量到高濃度低分子量，都能解析的很清楚，更可以得到許多有用的信息，如分子的形狀，分枝狀況，聚集態(tài)及動(dòng)力學(xué)參數(shù)，反應(yīng)速率等，其功能與應(yīng)用普及性正與日俱增。
案例分享
醫(yī)用透明質(zhì)酸鈉
多角度光散射檢測(cè)器測(cè)試絕對(duì)分子量的譜圖
京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
