近期，澳大利亞悉尼科技大學(xué)高級講師Jiao Jiao Li在科愛創(chuàng)辦的期刊Bioactive Materials上發(fā)表綜述文章：用于修復(fù)骨軟骨缺損的多相支架-臨床前研究進展。文章詳細總結(jié)了自2015年以來發(fā)表的用于在動物模型中治療骨軟骨缺損的多相支架的研究報告，包括對支架的生物材料、設(shè)計、添加的生長因子以及細胞等的詳細討論，并分析了基于生物材料的組織工程研究用于骨軟骨缺陷再生治療的機遇與挑戰(zhàn)。
一、研究內(nèi)容簡介
骨軟骨缺損是涉及關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的關(guān)節(jié)損傷，可由急性創(chuàng)傷或遺傳等因素引起，最常發(fā)生于膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)。關(guān)節(jié)的微環(huán)境通常不包含血管，因此導(dǎo)致營養(yǎng)供應(yīng)不足。由于關(guān)節(jié)軟骨的自我再生能力有限，修復(fù)受損的骨軟骨組織具有較大的挑戰(zhàn)性。如果受損的軟骨組織未能得到有效的治療，病情將進一步惡化。骨軟骨缺損可引起病灶部位的疼痛和腫脹，進而造成運動上的障礙甚至殘疾，亦有可能發(fā)展至關(guān)節(jié)退化及關(guān)節(jié)炎。目前臨床保守治療和手術(shù)效果欠佳，因此開發(fā)多相支架的新興組織工程治療迫在眉睫。為了達到修復(fù)及再生關(guān)節(jié)軟骨、軟骨-骨間面和軟骨下骨的目的，該文章針對2015年至2021年間研制多相支架的的相關(guān)研究進行詳細綜述。
1.新興的用于骨軟骨修復(fù)的組織工程解決方案
骨軟骨組織具有復(fù)雜的生物結(jié)構(gòu)，其包含透明關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨兩個主要部分。由于目前細胞治療無法完全實現(xiàn)骨軟骨再生，組織工程通過制造仿生的生物材料支架以及添加細胞或生長因子，來促進細胞增殖分化與關(guān)節(jié)組織再生。
最常見骨軟骨支架的材料是天然與合成的生物相容性聚合物。其成本較低，容易模仿軟骨與骨細胞外基質(zhì)（ECM）的結(jié)構(gòu)與特性，有利于干細胞的浸潤與分化。在支架內(nèi)部的結(jié)構(gòu)設(shè)計方面，采用孔隙結(jié)構(gòu)增加細胞以及營養(yǎng)物質(zhì)與廢物的滲透轉(zhuǎn)移，來調(diào)整軟骨和骨成分的孔隙尺寸以滿足它們對血管穿透的不同要求。
骨軟骨支架的主要設(shè)計包括單層、雙層、多層與梯度支架。相比雙層及多層支架，由于單層支架的同質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)具有較大的局限性，因此本文章針對雙層、多層及梯度支架的多相骨軟骨支架進行討論。
Fig. 1. Main design strategies for osteochondral scaffolds and common biomaterial selections.
2. 多相支架的生物材料
構(gòu)建多相骨軟骨支架的生物材料一般用于制作骨再生的含礦物層和軟骨再生的聚合物層。在本綜述的研究中，用于合成多相支架中的骨層的礦物質(zhì)包括磷酸鈣礦物(如羥基磷灰石或納米羥基磷灰石、磷酸三鈣（（TCP）)、生物活性玻璃，以及其他特定物質(zhì)例如文石和硅灰石。用于合成多相支架中的軟骨層的天然材料包括膠原蛋白、海藻酸鹽、殼聚糖、絲素蛋白，明膠、以及各種合成聚合物，如聚乳酸-乙醇酸（PLGA）、聚乳酸（PLA）、聚己內(nèi)酯（PCL）和聚乙二醇（PEG）。此外，少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)含有PLGA微球的支架具有傳送生長因子的功能。
2.1骨軟骨支架中的礦物材料
磷酸鈣礦物的骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)特性有助于形成新骨。其中合成羥基磷灰石的化學(xué)成分與骨骼中的羥基磷灰石礦物成分一致，使得其在骨組織工程中應(yīng)用廣泛。羥基磷灰石可增加鈣離子的局部濃度，從而激活成骨細胞的增殖以及促進間充質(zhì)干細胞（MSCs）的生長與分化，促使新骨形成。據(jù)報道，在3D生物打印的骨軟骨支架中，羥基磷灰石還可改善某些聚合物基質(zhì)的機械性能，使復(fù)合材料更好地匹配天然骨強度。但是，羥基磷灰石在動物模型中的不足之處是其降解率非常緩慢。
磷酸三鈣廣泛運用于構(gòu)建多相骨軟骨支架的骨層。研究顯示 β-TCP可增加軟骨下骨的骨量、增強骨再生、優(yōu)化新生血管在支架內(nèi)的形成、擁有良好的生物相容性和降解率，并且無排斥反應(yīng)。
生物活性玻璃具有無定形的二維結(jié)構(gòu)，可以形成生物活性表面層，增強骨細胞的粘附性和促進新骨形成，以及有利于周圍軟組織的修復(fù)。此外，添加生物活性玻璃可能有助于調(diào)節(jié)支架的生物降解率。
其他特定陶瓷配方的骨軟骨支架成分包括文石和硅灰石，前者是一種來自蚶子殼的碳酸鈣材料，后者是一種硅酸鈣礦物。兩者都具有生物活性，有助于促進軟骨下骨的修復(fù)。
雖然鈦合金不是礦物質(zhì)，但有兩項研究使用其作為骨層的硬性替代物，通過3D打印制成多孔支架。結(jié)果顯示，金屬支架與周圍原生組織可成功整合，以及提供軟骨修復(fù)所需要的機械支持。
2.2 骨軟骨支架中的聚合物材料
聚合物材料是構(gòu)建骨軟骨支架的主要材料，可作為構(gòu)建軟骨與骨層的基質(zhì)。聚合物材料可通過模仿原生軟骨的細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能來制作支架的軟骨層，以及向其中添加礦物質(zhì)、細胞和生長因子等。天然聚合物因來自生物系統(tǒng)，有較高的細胞兼容性，故常被選作軟骨層的材料，也有助于軟骨下骨再生。
膠原蛋白是一種存在于關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨組織中的細胞外基質(zhì)。含有膠原蛋白的多相支架可加強關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)以及改善再生組織的外觀，在修復(fù)兔子和羊的骨軟骨缺損模型中有顯著效果。有研究發(fā)現(xiàn)，在多孔鉭支架上加入膠原蛋白膜作為軟骨層，可促進細胞粘附，形成透明軟骨。
海藻酸鹽是一種從褐藻中提取出來的具有多功能性質(zhì)的生物材料。它具有生物相容性，可以被加工成一系列形態(tài)，因此常被制作成水凝膠使用。但是，海藻酸鹽的機械穩(wěn)定性欠佳以及植入后的生物降解性較低，需要通過添加其他聚合物來制成復(fù)合材料從而改善這些問題。海藻酸鹽作為骨軟骨支架的軟骨層組織，能夠體現(xiàn)出與體內(nèi)組織的生物相容性和展示出支架孔隙中的血管化現(xiàn)象。有研究表明，植入海藻酸鹽后，植入體周圍并無炎癥細胞的出現(xiàn)。另一研究中使用了由海藻酸鹽和透明質(zhì)酸合成的支架，結(jié)果顯示出軟骨修復(fù)以及支架與宿主軟骨有融合的跡象。
殼聚糖提取自甲殼類動物的甲殼素，具有生物相容性、生物可降解性和低毒性等優(yōu)點，其結(jié)構(gòu)與軟骨細胞外基質(zhì)中的糖胺聚糖 (GAG) 相似。殼聚糖基支架的機械性能可以接近原生關(guān)節(jié)軟骨的強度和模量范圍。由軟骨層中的殼聚糖和骨層中的殼聚糖/β-TCP 復(fù)合材料組成的雙層支架在 12 周后幾乎完全修復(fù)了大鼠模型的骨軟骨缺損，并顯示出透明軟骨的形成以及新組織與周圍軟骨的融合。
絲素蛋白是從蠶絲中提取的一種蛋白質(zhì)，與大多數(shù)其他天然聚合物相比，絲素蛋白具有更好的機械性能，因此被廣泛用于軟骨和骨骼再生的支架中。含有絲素蛋白的多層支架在動物模型中已被證明能促進細胞粘附和增殖，以及組織浸潤和體內(nèi)骨軟骨修復(fù)的作用。此外，含有絲素蛋白支架的壓縮模量可達到 0.4 兆帕，接近人體關(guān)節(jié)軟骨的壓縮模量范圍。
合成聚合物是由合成單體鏈聚合而成的。與天然聚合物不同，它們不利于細胞粘附，通常不具備生物活性。由于合成聚合物在制造過程中能夠輕松調(diào)整單體排列，因此在復(fù)制原生組織生物力學(xué)方面具有更好、更可定制的機械特性，更有利于復(fù)制骨軟骨組織的承重功能。與天然聚合物相比，合成聚合物還具有更可控和穩(wěn)定的特性。有關(guān)骨軟骨支架的研究已將合成聚合物用于軟骨層和骨層，并頻繁添加生長因子或細胞，以克服其惰性并改善再生效果。在骨層方面，合成聚合物可以用陶瓷顆粒增強，以改善軟骨下骨的再生以及通過增強支架的機械強度與各層之間的整合間接促進軟骨再生。
聚乳酸（PLGA）是乳酸和乙醇酸的共聚物。因其擁有良好的生物相容性和高度可定制的性能（包括機械特性和生物降解性），所以它是最常用于構(gòu)建骨軟骨支架的合成聚合物。PLGA 支架可在軟骨層和骨層中構(gòu)建不同幾何形狀的孔隙結(jié)構(gòu)，形成雙層骨軟骨支架，已在兔子模型中顯示出良好的修復(fù)效果。
聚己內(nèi)酯（PCL） 是一種常用于組織工程的聚酯，因為它價格實惠，并且擁有易于修改的特征。PCL 可用于制造多孔雙層支架，從而模仿骨軟骨組織的原生結(jié)構(gòu)。PCL支架在小鼠模型中顯示出滿意的修復(fù)效果，以及炎癥調(diào)節(jié)的能力。
3. 多相支架設(shè)計
骨軟骨支架的設(shè)計涉及整合支持軟骨和骨再生的多種結(jié)構(gòu)以及生物材料（圖2）。
Fig. 2. Different design strategies for gradient osteochondral scaffolds.
3.1 多層骨軟骨支架
多層支架是目前最流行的骨軟骨支架設(shè)計。大多數(shù)研究采用了軟骨和骨的雙層結(jié)構(gòu)，也有一些研究采用了三層甚至四層結(jié)構(gòu)，其中還包括鈣化軟骨的中間層（圖3）。
Fig. 3. Examples of multilayer scaffold designs for osteochondral tissue repair.
由于天然和合成聚合物以及陶瓷材料需要不同的加工技術(shù)，因此有多種方法可用于制造多層支架結(jié)構(gòu)，其中許多方法是針對支架中使用的特定材料組合而量身定制的。制造雙層骨軟骨支架的一種常用策略是通過相對獨立的工藝技術(shù)制造軟骨層和骨層，然后通過各種技術(shù)（如膠合或創(chuàng)建界面結(jié)合層）將它們整合在一起。這種策略可以相對容易地創(chuàng)建雙相支架，為軟骨和骨層分別提供更廣泛的材料選擇和形態(tài)，從而有助于更好地滿足不同組織的再生要求。不過，這兩個支架層相對獨立，不通過中間界面連接。根據(jù)界面粘合的強度，支架在植入體內(nèi)后可能會出現(xiàn)層間分層的問題。這個問題同樣會影響一些其它的支架設(shè)計，比如用單獨制造的陶瓷支架或3D打印支架作為骨層，加上含有一些生物成分如生長因子或促進軟骨生成的細胞的軟骨層。這些方法著重于軟骨下骨的再生，認(rèn)為骨修復(fù)成功后，軟骨也會隨之再生。其他策略包括溶劑澆鑄和特定浸出、連續(xù)冷凍干燥、3D打印或生物打印等可制造更一體的連接層，但工序可能較復(fù)雜。更大膽的設(shè)計包括含有三層或四層的骨軟骨支架，這些支架都涉及多步驟的、為所用材料類型量身定制的制造過程。
在骨軟骨支架設(shè)計中添加更多層次正成為一種日益流行的策略。因此，它能夠盡量高程度地還原骨軟骨原生組織的復(fù)雜生理結(jié)構(gòu)。軟骨層與軟骨下骨層之間的第三層或第四層可以幫助形成鈣化標(biāo)記，模擬鈣化軟骨和未鈣化軟骨之間的原生界面。這可能在為新形成的骨軟骨組織提供穩(wěn)定性以及防止軟骨下骨過度生長到軟骨區(qū)域（可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)退化及病變）的方面起著至關(guān)重要的作用。一項研究報導(dǎo)了一種復(fù)雜的四層支架設(shè)計，設(shè)計中包含由天然聚合物組合而成的水凝膠，其中摻雜了羥基磷灰石顆粒以及各種生長因子，以形成軟骨、鈣化軟骨和骨層，而骨層使用了電紡膜作為第四層。這種支架設(shè)計被認(rèn)為能高度模仿骨軟骨結(jié)構(gòu)以及增強血管生成，為整體骨軟骨修復(fù)提供更好的條件。
3.2 梯度骨軟骨支架
梯度支架可采用多種方法制作，如3D打印、連續(xù)水凝膠沉積、添加微球或生物成分，以創(chuàng)建由相同材料組成的連續(xù)結(jié)構(gòu)，但各階段之間存在過渡差異，從而實現(xiàn)骨軟骨再生。由于梯度支架具有連續(xù)的結(jié)構(gòu)，細胞間的交流可在各層之間進行，且有可能更好地與原生組織進行體內(nèi)整合。不過，梯度支架的制作過程相對較復(fù)雜，并需要確保制造過程中的一致性。另外，基于水凝膠的梯度支架的機械性能可能不足以支撐術(shù)后的立即承重。
有研究針對軟骨和骨層的孔隙結(jié)構(gòu)進行了不同的組合，得出的結(jié)論是與其他組合相比，軟骨層與骨層的孔隙率分別為 92%與77%可在兔子模型內(nèi)達到最好的骨軟骨再生效果。這種孔隙率組合可產(chǎn)生新生軟骨最佳的細胞形態(tài)、基質(zhì)染色、表面規(guī)則性、厚度等。有趣的是，相比于改變孔徑，添加富含血小板的血漿（PRP）等生物添加劑似乎對骨軟骨再生的結(jié)果有更大的影響。
在小型和大型動物模型中，含有生長因子梯度的水凝膠支架顯示出同時促進軟骨和骨再生的良好能力。據(jù)觀察，轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）家族中常用的生長因子對骨軟骨再生有著不同且某些重疊的影響。
4. 多相支架中添加生物成分
骨軟骨支架中通常會加入生長因子或細胞等生物添加劑，以助于形成多相結(jié)構(gòu)，并促進骨軟骨各層內(nèi)不同組織的再生（圖 4）。與純支架相比，絕大多數(shù)在支架內(nèi)加入生物添加劑的研究顯示了更好的骨軟骨修復(fù)效果。
Fig. 4. Examples of scaffold designs incorporating growth factors and/or cells in different layers for osteochondral tissue repair.
4.1 生長因子
在骨軟骨支架中摻入生長因子，可促進細胞增殖、分化以及細胞外基質(zhì)合成，從而改善組織修復(fù)效果。將生長因子融入支架設(shè)計的的研究主要集中在 TGF （尤其是TGF-β）和 BMP 家族，它們可分別誘導(dǎo)軟骨和骨生成。其他生物大分子，如胰島素樣生長因子（IGF）-1、成纖維細胞生長因子（FGF）-2、白細胞介素（IL）-4 和巖白菜素等也已得到應(yīng)用。
4.2 細胞
大部分研究將細胞納入骨軟骨支架，以促進組織修復(fù)。在對骨軟骨支架進行體內(nèi)測試的研究中，各種組織來源的間充質(zhì)干細胞是迄今為止最常被選用的細胞類型，這些細胞大多來自骨髓，少數(shù)來自脂肪組織和臍帶。
間充質(zhì)干細胞可分化成軟骨與骨細胞，且與軟骨細胞和成骨細胞等原代細胞相比，間充質(zhì)干細胞更易獲得且更易在體外生長，因此是制作骨軟骨支架的首選。在組織修復(fù)的早期階段，間充質(zhì)干細胞被認(rèn)為能提高骨和軟骨再生的效率。盡管加入細胞可更好地促進組織再生，但將細胞納入骨軟骨支架需要更高的制備要求，以及對制造后工藝和處理的要求。此外，通常需要大量細胞才能產(chǎn)生顯著的治療反應(yīng)，而這些都會帶來更高的成本，從實際角度來看可能并非最佳選擇。
5. 最近的骨軟骨支架臨床研究成果
近期發(fā)表的臨床研究中已報道了四種市售支架，其中包括意大利 Finceramica 公司的 MaioRegen®、美國 Smith & Nephew 公司的 Trufit®、以色列 CartiHeal 公司的 Agili-CTM 和瑞士 BioTissue 公司的 Chondrotissue® 。
MaioRegen®由膠原蛋白和羥基磷灰石組成，經(jīng)冷凍干燥后排列成的三層支架，從2011年開始常用于治療股骨髁、脛骨平臺、髕骨和距骨的骨軟骨缺損。Trufit®是具有雙相結(jié)構(gòu)的合成聚合物支架，骨層由聚羥基乙酸（PGA）纖維和硫酸鈣組成，軟骨層由聚乳酸（PLGA）組成。雖然它是第一種應(yīng)用于臨床實踐的骨軟骨支架，但由于其失敗率較高，且作為純支架植入物的臨床效果普遍較差，現(xiàn)已退出市場。Agili-CTM是一種雙層支架，由珊瑚提取的文石作為骨層和透明質(zhì)酸作為軟骨層組成。它已于 2021 年 3 月獲得美國食品和藥物管理局（FDA）的使用批準(zhǔn)，是最新進入臨床應(yīng)用的骨軟骨支架。Chondrotissue®是由PGA-透明質(zhì)酸組成的單相支架，但因研究過程中隨訪時間太短，無法預(yù)測長期修復(fù)效果。除了一項使用 Trufit® 的研究在植入前將支架浸泡在 PRP 或骨髓濃縮物中外，所有支架均為無細胞植入而設(shè)計，并以此應(yīng)用于臨床研究中。
根據(jù)最近對相關(guān)臨床研究的系統(tǒng)回顧和薈萃分析結(jié)果，在平均 28.4 個月、39.8 個月和 18.0 個月的隨訪中，接受 MaioRegen®、Trufit® 和 Agili-CTM 治療的患者的總體失敗率分別為 4.8%、9.9% 和 8.2%。對MaioRegen®和Agili-CTM的結(jié)果評分進行定量綜合后發(fā)現(xiàn)，與基線相比，在1年、2年和≥3年的隨訪中，International Knee Documentation Committee（IKDC）主觀評分與用Tegner評分評估的活動水平都有統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著改善。除已退出市場的 Trufit® 外，臨床使用的多相支架在中短期隨訪中對骨軟骨缺損有一定的治療效果，不良反應(yīng)發(fā)生率相對較低。
6. 結(jié)論與未來展望
目前，市售多相支架的臨床結(jié)果表明，其完全修復(fù)骨軟骨組織的能力有限。臨床前運用骨軟骨動物模型的研究表明，加入生物成分的多相支架可使骨軟骨再生的效果普遍得到改善，具體表現(xiàn)為 GAG 和 II 型膠原含量增加、再生軟骨的完整性提高，以及達到滿意的缺損修復(fù)效果所需的時間縮短。將不同類型的細胞和生長因子結(jié)合起來，加上其他刺激方法，可發(fā)揮協(xié)同作用，增強骨軟骨修復(fù)能力。同時，不同類型的多相設(shè)計，包括多層支架和梯度支架，已被證明能更好地模擬骨軟骨的分層結(jié)構(gòu)并使修復(fù)組織適當(dāng)分區(qū)，從而提高臨床前修復(fù)效果。
盡管取得了令人鼓舞的進展，但目前仍缺少一種 "理想 "支架，既能完美滿足骨軟骨修復(fù)的復(fù)雜和多方面要求，又能在臨床應(yīng)用有實際價值。未來研究可從3D生物打印技術(shù)、間充質(zhì)干細胞及其衍生物（如細胞外囊泡）等方面探索更多的替代方案。對于實驗?zāi)Ｐ偷倪x擇，目前使用誘導(dǎo)多能干細胞（iPSC）生產(chǎn)骨軟骨組織器官的替代方法已有報道。與骨軟骨組織體外建模相關(guān)的其他技術(shù)發(fā)展包括器官芯片系統(tǒng)，其目的是在微流控設(shè)備上再現(xiàn)體內(nèi)細胞微環(huán)境。使用多相支架的組織工程學(xué)是臨床上有效修復(fù)骨軟骨損傷的一種前景廣闊的策略，它將受益于生物制造、微/納米器件和干細胞工程等創(chuàng)新方法的跨學(xué)科整合。
二、原文信息
Chen, Pye, J. S., Li, J., Little, C. B., & Li, J. J.
Multiphasic scaffolds for the repair of osteochondral defects: Outcomes of preclinical studies.
Bioactive Materials, 27 (2023) 505–545.
京公網(wǎng)安備11010802046783號
