反相高效液相色譜是當今液相色譜的最主要的分離模式，幾乎可用于所有能溶于極性或弱極性溶劑中的有機物的分離，尤其是在藥物分析方面，它是由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，正好與由極性固定相和弱極性流動相所組成的液相色譜體系（正相色譜）相反。典型的固定相是十八烷基鍵合硅膠，典型的流動相是甲醇和乙腈。下面就來講講方法開發(fā)的那些事。
色譜分離理論
1、溶劑的選擇
液相色譜顧名思義要使用液體作為載體，這些液體就是我們常用的溶劑，常見的溶劑有以下幾種，極性由弱到強。在液相色譜分析中有一個最基本的要求就是化合物必須能溶于所使用的溶劑，所以在開發(fā)方法之前，我們要根據(jù)現(xiàn)有化合物的一些官能團，來查看或者推測它的溶解性，來找到能夠溶解目標化合物的溶劑。
2、分離模式
了解了化合物的溶解性，還可以確定分析它使用何種分類模式，下面是一些常見化合物的所對應(yīng)的不同的分離模式。
從整個圖表上看，反相色譜占了很大的一個比重，世界上70%到80%的化合物都可以利用液相色譜進行分離，而在這70%到80%的化合物當中又有70%到80%的化合物是可以用反相色譜進行分離，所以，反相色譜一直是色譜分離模式中討論的焦點。除了化合物的溶解性，我們可以根據(jù)化合物的分子量去選擇合適的分離模式，可也根據(jù)下表選擇具體的分離模式。
3、方法開發(fā)的目標和評價
在方法開發(fā)或者建立方法之前，會確定一個目標，對于液相色譜的方法來說，第一步，分離；第二步，分析時間；第三步，方法的耐用性。
對于分析方法的評價可以從分離、峰型、效率、重現(xiàn)性、耐用性和經(jīng)濟性6個方面進行評價。
4、方法開發(fā)中的組成要素
色譜條件中涉及的基本參數(shù)：固定相（種類、規(guī)格）、流動相（種類、比例、模式）和儀器參數(shù)（分離模塊、檢測模塊）。
5、分離度的三個影響因素
選擇性對分離影響最大，但難以預(yù)測；保留達到一定程度后幾乎不再對分離度有貢獻；柱效對于分離度有持續(xù)的增長作用，但效果受限制。
6、方法開發(fā)的步驟
甲醇/乙腈的選擇
反向色譜最常用的甲醇或乙腈，甲醇的截至波長為205nm，乙腈的截至波長為190nm，乙腈水系統(tǒng)由于其粘度非常低，塔板數(shù)較高而柱壓較低，是流動相的最佳選擇。通常40%的乙腈具有與50%的甲醇相似的溶劑強度。
基于溶劑不同的選擇性，甲醇為類質(zhì)子溶劑，可形成氫鍵，對于分離酸堿或電負性強的化合物有提高選擇性，乙腈為極性分子，其碳氮三鍵含有未成鍵電子，能與含有空軌道的化合物結(jié)合，則與甲醇有著不同的化合物選擇性。有時單用ACN或MEOH可能會達不到理想的分離效果，在流動相同時使用ACN和MEOH可改變選擇性以獲得較好的分離效果。簡言之，在改變分離選擇性的時候，甲醇細調(diào)，乙腈粗調(diào)。主要是為了調(diào)整流動相的粘度和強度，使得分離效果和選擇性有所改善。
離子對的選擇
1、適用范圍
使用液相色譜法分析電離能力比較強的樣品時，樣品在反相色譜柱上的保留時間很短或者根本不保留，這時要加入相應(yīng)的離子對試劑，將分析物上的離子進行結(jié)合，形成在柱子上有保留的分子。
2、作用原理
加入離子對試劑后，它可以與待分析的物質(zhì)（多為在溶液狀態(tài)時顯以與離子對試劑相反的電荷）結(jié)合成離子對而呈中性，疏水性增加而在色譜柱上有保留行為。離子對類似于膠黏劑，一頭以離子吸引住待測物（也是離子），另一頭以碳鏈與固定性作用，從而把待測物保持在固定相上。
3、試劑選擇
離子對分為正離子對和負離子對，分析酸性樣品（確切的說應(yīng)該是作用基團）用正離子對試劑，分析堿性樣品用負離子對試劑。正離子對試劑可以吸附帶負電荷的樣品組分，負離子對試劑反之。戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉.....十二烷基磺酸鈉屬于負離子對試劑；四丁基溴化銨、四丁基硫酸氫銨、四丁基氫氧化銨等屬于正離子對試劑。離子對要考慮樣品體系的復(fù)雜性和干擾物的特性，先用碳鏈短的，濃度盡量低，降低對色譜柱填料的影響，同時流動相的pH值盡可能低以確保離子化程度。
4、離子對試劑的濃度
通過改變被固定相吸附的離子對試劑的多少，有可能將保留過程由反相改變?yōu)殡x子交換色譜。這種改變是通過改變流動相中的試劑的濃度實現(xiàn)的。同常濃度范圍從幾毫摩到幾十毫摩不等。
注意事項：三乙胺、醋酸銨也起到部分離子對試劑的作用，使用離子對的色譜柱建議專柱專用。
等度與梯度的選擇
1、梯度洗脫用于方法建立，對于組分未知的樣品進行HPLC方法建立時，即使最終分離擬用等度洗脫仍需先采用梯度洗脫進行方法開發(fā)。
2、初始梯度洗脫分離可以近似估計出樣品的保留值范圍，為后續(xù)試驗選擇等度或梯度提供必要的依據(jù)。
3、若等度洗脫是最好選擇，初始梯度試驗可為進一步試驗提供最佳%B的估算值。
4、初始梯度洗脫實驗可以使整體樣品分離更好、更快。
5、初始梯度洗脫遺漏早與晚流出的低濃度組分的可能性較小。
6、初始梯度通常為線性梯度（全梯度），如5—100%B，根據(jù)雜質(zhì)情況，1.5梯度/min或5梯度/min，進行試驗。
7、梯度洗脫時由于改性劑在水相的吸收與有機相中的吸收不同，導(dǎo)致基線漂移，可通過混合流動相的方式進行改善。
8、通常含量常采用等度方法，有關(guān)檢測建議采用梯度的方法，在進行含量方法確定時，需評估潛在雜質(zhì)對主峰的影響及方法的運行時間。
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