摘 要 / Abstract
近年來，疫苗領域迎來了快速發(fā)展期，同時也面臨著最嚴格的監(jiān)管。與一般藥品不同，疫苗主要用于預防，面向健康人群，嬰幼兒是重要的接種人群，其質量直接關系著公眾的生命安全。疫苗的研發(fā)及質量評價工作極具挑戰(zhàn)性，為此，對其相應的分析技術也提出了更高的要求。質譜技術是目前最為重要的分析技術之一，其既可提供分子質量和結構等方面的信息，也可采用內標法或外標法對目標化合物進行定量分析，廣泛應用于生物制品的早期發(fā)現(xiàn)、研發(fā)及生產(chǎn)等環(huán)節(jié)。本文結合多篇已發(fā)表的文獻或技術文章，詳細概述了液相色譜- 質譜聯(lián)用技術在疫苗分析中的應用，包括重組蛋白疫苗、病毒疫苗、多糖蛋白結合疫苗、核酸疫苗及輔料和佐劑的質量控制，以期為新型疫苗的研發(fā)和質量控制提供有效的分析方法。
In recent years, the vaccine industry has experienced the most rapid development in the history, and is faced with the most stringent regulatory oversight. Unlike ordinary drugs, vaccines are mainly used for prevention and are targeted at healthy individuals, most of whom are infants. Therefore, the quality of vaccines has a direct bearing on public safety and wellbeing. The development and quality evaluation of vaccines pose significant challenges, requiring corresponding analytical techniques. Mass spectrometry is one of the most important analytical techniques at present, which can not only provide information on molecular mass and structure, but also enables quantitative analysis of target compounds using internal or external standard methods. It has been widely used in early discovery, development, and production of biological drugs. To provide effective analytical methods for the development and quality control of new vaccines, this paper comprehensively reviews a few published literature or technical papers to summarize the application of liquid chromatography-mass spectrometry in vaccine development, mainly involving the quality control of recombinant protein vaccines, viral vaccines, protein-polysaccharide conjugate vaccines, nucleic acid vaccines, excipients, and adjuvants.
關 鍵 詞 / Key words
液相色譜- 質譜聯(lián)用技術；重組蛋白疫苗；病毒疫苗；多糖蛋白結合疫苗；核酸疫苗
liquid chromatography-mass spectrometry; recombinant protein vaccine; viral vaccine; protein-polysaccharide conjugate vaccine; nucleic acid vaccine
疫苗是人類抵御疾病的重要武器，是成本最低、效果最好的疾病防御手段。近年來，疫苗領域迎來了快速發(fā)展期[1-2]，同時也面臨著最嚴格的監(jiān)管。2019 年12 月1 日，《疫苗管理法》正式實施，首次將疫苗管理上升到法律層面。對疫苗的生產(chǎn)和質量進行監(jiān)控是疫苗監(jiān)管中尤為重要的一部分。疫苗研發(fā)涉及的技術路線多樣，包括滅活病毒疫苗、重組蛋白疫苗、mRNA 疫苗等，其質量評價工作極富挑戰(zhàn)性，例如多種微量的免疫原組分、復雜的佐劑等對其相應的分析技術提出了較高的要求。質譜（mass spectrometry，MS）分析是20世紀發(fā)展起來的重要分析技術之一，其具有分析對象范圍廣、樣品用量少、分析速度快、靈敏度和分辨率高等特點，目前已廣泛應用于生命科學領域和藥物的早期發(fā)現(xiàn)、研發(fā)及生產(chǎn)等環(huán)節(jié)。質譜分析既可提供分子質量和結構等方面的信息，也可采用內標法或外標法對目標化合物進行定量分析，為疫苗相關研究工作提供了新的研究思路與技術方法。
本文結合多篇已發(fā)表的權威文獻或技術文章，對疫苗分析過程中所使用的液相色譜- 質譜聯(lián)用技術進行了詳細的概述，主要包括重組蛋白疫苗、病毒疫苗、多糖蛋白結合疫苗、核酸疫苗及輔料和佐劑等，以期為新型疫苗的研發(fā)和質量控制提供有效的分析方法。
1、質譜分析技術概述
質譜分析技術的基本原理：樣品由進樣系統(tǒng)導入離子源，在離子源中電離生成帶電荷的正離子（或負離子），然后在真空狀態(tài)和加速電場的作用下形成離子束進入質量分析器，通過質量分析器分離和過濾，不同質荷比的離子經(jīng)檢測系統(tǒng)轉換為可測量的信號， 從而得到質譜圖。在日常分析中， 單組分及有一定揮發(fā)性的固體或高沸點的液體樣品通?？梢圆捎弥苯舆M樣的方式進入質譜儀中進行分析。但大多數(shù)測定樣品為復雜的多組分，在進入質譜儀前需預先進行分離，由此衍生出分離與質譜聯(lián)用的技術，包括液相色譜- 質譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）技術、氣相色譜-質譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry ， GC-MS）技術、毛細管電泳- 質譜聯(lián)用（capillary electrophoresis-mass spectrometry，CE-MS）技術等。
電離是質譜分析中必不可少的步驟之一，樣品的電離效率很大程度上決定了最終的檢測信號強度。離子源具有多種類型，實際應用中可結合樣品的性質和目標分析物的理化特性進行選擇。常見的離子源包括：電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI）、電子電離源（electron ionization, EI）、化學電離源（chemical ionization，CI）、電感耦合等離子體（inductively coupled plasma,ICP）、基質輔助激光解析電離源（matrix-assisted laser desorptionion ization,MALDI）等，其中應用最為廣泛的是ESI。對于質量分析器，不同廠家的質譜儀存在一定的差異，常見的質量分析器包括飛行時間（time of flight，TOF）分析器、四極桿（quadrupole，Q）分析器、離子阱（ion trap，IT）分析器、靜電場軌道阱（orbitrap）分析器和傅立葉變換離子回旋共振（fourier transform ion cyclotron resonance，F(xiàn)T-ICR）分析器。除此之外，還包含多種串聯(lián)質譜分析器：三重四極桿（QQQ）、四極桿飛行時間（Q-TOF）、四極桿離子阱（QIT）、離子阱飛行時間（IT-TOF）等。對于檢測器，常見的檢測器包括電子倍增檢測器、法拉第杯檢測器、光電倍增檢測器、陣列檢測器等。近年來，質譜分析技術發(fā)展迅猛，不斷涌現(xiàn)出新穎的電離技術、質量分析技術，例如增加離子淌度的4D 質譜技術以及交聯(lián)質譜、氫氘交換質譜、基質輔助激光解析或電離質譜成像等多維聯(lián)用技術，進一步拓展了質譜技術的性能和應用領域。
2、LC-MS 技術在疫苗分析中的應用
2.1 重組蛋白疫苗
重組蛋白疫苗主要借助體外制備的病原體特異蛋白，刺激人體產(chǎn)生抗體，起到預防疾病的目的。其主要生產(chǎn)工藝原理：先明確病原體具有免疫原性的特異蛋白，再通過基因工程技術，將病原體特異蛋白基因整合到合適的表達系統(tǒng)（例如酵母菌、大腸桿菌等微生物），最后通過體外大量培養(yǎng)表達病原體特異蛋白，再經(jīng)純化，制備成疫苗。其優(yōu)點主要是易于貯存和運輸、使用方便、制備簡單、容易大量生產(chǎn)、成本低、免疫時間長等。為了確保進入臨床研究疫苗的安全性、有效性和穩(wěn)定性，必須采用適當?shù)姆椒▽χ亟M蛋白疫苗樣品進行嚴格的表征和質量控制。
目前，LC-MS 技術是重組蛋白疫苗在發(fā)現(xiàn)、開發(fā)、生產(chǎn)及上市審批檢測中結構表征、質量標準制定、質量控制評價改進中的重要支撐技術，可用于分析與評價重組蛋白疫苗產(chǎn)品的質量，保障產(chǎn)品的安全性?！吨袊幍洹罚?020 年版）三部規(guī)定了人用重組單克隆抗體制品的制造要求，指出抗體特性分析至少包括結構完整性、氨基酸序列、二級結構等[3]。實際生產(chǎn)研發(fā)過程中，重組蛋白疫苗的生產(chǎn)工藝和質量控制可參考重組蛋白藥物的相關指導原則。目前，LC-MS 技術已被應用于包括重組蛋白疫苗的分子量分析、亞基分子量分析、肽圖分析（包含序列覆蓋度分析、翻譯后修飾分析、二硫鍵分析）、目標蛋白定量分析等多個方面。此外，LC-MS 技術還被廣泛應用于重組蛋白疫苗的工藝相關雜質的分析，例如宿主細胞蛋白殘留分析。
2.1.1 分子量分析
作為蛋白樣品的主要特征參數(shù)之一，蛋白分子量分析已成為蛋白類生物制品表征的重要環(huán)節(jié)之一，是確定一種新型蛋白、進行后續(xù)研究活動的重要前提。對于重組蛋白疫苗的分子量分析，常采用以有機溶劑為流動相的反相液相色譜（reversed-phase liquid chromatography，RPLC）與高分辨質譜聯(lián)用進行蛋白的變性質譜（denatured MS） 分析， 在該模式下蛋白的電荷數(shù)據(jù)較多， 更容易分析。除變性質譜之外，非變性質譜（native MS）分析也經(jīng)常用于重組蛋白疫苗的分子量分析，該模式下主要采用尺寸排阻色譜法（size-exclusion chromatography，SEC） 或疏水相互作用色譜法（hydrophobic interaction chromatography，HIC） 等進行分離，使用可揮發(fā)性鹽作為流動相。與變性質譜相比，在非變性質譜分析中，蛋白通常所帶電荷較少，需要較高的進樣量才能夠獲得較高的響應。此外，非變性質譜分析通常不需要對樣品進行前處理，最大程度上保持蛋白的天然結構，與變性質譜技術互為補充，能夠比較全面地表征蛋白的結構信息，例如蛋白分子構象、蛋白多聚體等分析。對于結構較為復雜的蛋白樣品，有時為了降低蛋白本身的復雜性，會使用木瓜蛋白酶等蛋白水解酶，將蛋白切割成分子量為25~50kDa的亞基片段， 從而更易于質譜的結構分析。此外， 對于部分糖基化位點較多的糖蛋白， 還會采用肽-N-糖苷酶 F 去掉N-糖，進一步降低蛋白的復雜性。
2.1.2 肽圖分析
肽圖分析是重組蛋白表征的重要檢查項目之一，其通過酶解（一般使用胰蛋白酶）將蛋白酶解成肽段，然后以可重現(xiàn)的方式進行肽段的分離和鑒定。肽圖分析是一種非常有用的技術，能夠提供待測蛋白的全面信息，已成為生物制品分析領域中重要的工具之一。肽圖分析不僅能檢測和監(jiān)控單個氨基酸改變、氧化、去酰胺化以及其他降解形式，還可用于N 端環(huán)化、C 端賴氨酸處理、N-糖基化，以及內含子表達等非預期的變異分析。在實際的研發(fā)與生產(chǎn)過程中，重組蛋白疫苗將會參考重組蛋白藥物的肽圖分析技術，利用反相液相色譜或質譜進行酶解肽段混合物的分離檢測。目前，該技術已經(jīng)成為鑒定重組蛋白疫苗的首選方法和產(chǎn)品出廠的必行檢測。
2.1.2.1 序列覆蓋度分析
蛋白序列覆蓋度的檢測是對蛋白類生物制品一級氨基酸序列的確證， 目前主要分析方法包括Edman 降解法和質譜法。Edman 降解法最多可以測定N 端的50~70 個氨基酸，因此長度較短的多肽藥物可以通過Edman 降解法進行測序，但是對于蛋白類生物制品來說，Edman 降解法一般不適用于進行蛋白全序列檢測。LC-MS 技術是進行蛋白氨基酸序列覆蓋度分析的重要手段，是蛋白類生物制品表征的重要方法。在重組蛋白疫苗申報時，需采用質譜法進行蛋白序列覆蓋度的檢測。新冠病毒（SARS-CoV-2） 有4 種主要的結構蛋白：刺突蛋白（spike protein，S 蛋白），核衣殼蛋白（nucleocapsid，N 蛋白），膜蛋白（membrane protein，M 蛋白），包膜蛋白（envelope protein，E 蛋白）。其中，S 蛋白是病毒最重要的表面膜蛋白，也是引起免疫應答的重要抗原，是疫苗設計的關鍵靶點。作為一種非常重要的技術路線，新冠病毒重組蛋白疫苗就是以基因工程方法，大量生產(chǎn)新冠病毒最有可能作為抗原的S 蛋白， 刺激人體產(chǎn)生抗體，達到預防疾病的效果，因此，其結構表征和質量控制對藥物安全性十分重要。Liu等[4] 采用ZenoTOF 7600 結合Biologics Explorer 軟件對新冠病毒的S 蛋白進行表征分析，得到了95% 以上的序列覆蓋度并找到了N501Y 突變。相比于碰撞誘導解離（collision-induced dissociation，CID）碎裂模式，電子活化解離（electron activation dissociation，EAD） 譜圖中可以提供更為豐富的碎片離子信息，從而保證獲得較好的序列覆蓋度，如圖1 所示。
2.1.2.2 翻譯后修飾分析
LC-MS 技術不僅可以獲得蛋白的氨基酸序列初級結構信息，還可用于翻譯后修飾（post-translational modification，PTM）的分析。糖基化是重組蛋白疫苗最主要的翻譯后修飾之一，常見的糖基化修飾主要包括糖鏈與天冬酰胺殘基連接的N-糖基化以及糖鏈與絲氨酸或蘇氨酸殘基連接的O-糖基化。糖基化對重組蛋白疫苗等生物制品的穩(wěn)定性、構象、免疫活性等有著重要影響。很多重組蛋白疫苗都是高糖基化蛋白，糖基化分析對于產(chǎn)品的表征分析具有重要意義。對于蛋白的糖基化分析可以從多水平進行，包括完整糖蛋白水平、糖基水平和糖肽水平。完整糖蛋白水平的分析雖然具有樣品消耗量少、前處理簡單（不需化學或酶解處理）等優(yōu)點，但是其對質譜儀器和解析軟件提出了較高的要求。糖基水平的分析為重組蛋白疫苗樣品的糖基化分析提供了詳細的信息，除了可以識別蛋白上存在的特定糖型外，還可以獲得其準確的結構信息，但無法獲得糖基化位點的信息。相比而言，對酶切后的樣品進行糖肽水平的分析，能夠獲得糖基和糖基化位點間的對應關系的信息，對于重組蛋白疫苗的糖基化分析具有重要作用。對于糖肽的分析，CID 技術往往會使糖肽中糖基部分優(yōu)先碎裂，產(chǎn)生較多的氧鎓離子；相反，其氨基酸部分較難碎裂，從而導致該糖肽的二級碎片覆蓋度低，不能有效獲取糖肽的完整骨架信息，無法準確確認肽段序列和糖基化位點的信息。特別是對于糖基化非常復雜的糖蛋白疫苗， 利用該技術獲得準確和全面的信息具有一定的挑戰(zhàn)性。EAD 作為一種新型離子碎裂技術可以有效解決該問題，其能夠有效斷裂糖肽的氨基酸部分和保持糖基的完整性，準確地定位糖基化位點并獲得豐富的二級質譜（MS/MS） 信息。Mahan等[5] 利用ZenoTOF 7600 系統(tǒng)對通用流感疫苗（universal fluvaccine） 的糖肽進行了鑒定，并確認了糖基化位點，分析了糖基相對含量，如圖2 所示。利用ZenoTOF 7600 特有的Zeno離子阱信號增強功能與EAD 技術相結合， 可以獲得高質量的MS/MS 質譜圖，能夠準確鑒定出低豐度的糖型[5]。
除糖基化外，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的對蛋白類生物制品質量產(chǎn)生影響的潛在翻譯后修飾還有谷氨酸環(huán)化、甲硫氨酸氧化、天冬酰胺（Asn）去酰胺化、C 端賴氨酸丟失等。其中，天冬酰胺去酰胺化形成的天冬氨酸（Asp，D） 和異天冬氨酸（isoAsp，isoD）因其結構不同，會影響蛋白最終形成的高級結構，進而影響蛋白功能，因此在重組蛋白疫苗表征過程中需對D 和isoD 進行嚴格區(qū)分。然而，D 和isoD 的區(qū)分一直是蛋白表征的難點，在CID 的碎裂模式下，D 和isoD 具有相同的二級碎片，無法實現(xiàn)有效區(qū)分。而在EAD 的碎裂模式下，isoD可以形成獨特的診斷離子z-57和c+57，從而可以有效區(qū)分D 和isoD。Liu 等[4] 采用ZenoTOF7600 成功區(qū)分出了新冠病毒中S 蛋白的D 與isoD， 通過診斷z8-57 離子的發(fā)現(xiàn)可以準確確定該肽段上2 個isoD 異構體的存在，如圖3B 和圖3D 所示；而該診斷離子的缺失可以確定該肽段上為天冬氨酸，如圖3C 所示[4]。
2.1.2.3 二硫鍵分析
二硫鍵對于穩(wěn)定蛋白藥物的空間結構，保持其活性具有重要的作用。分子內二硫鍵的連接是重組蛋白疫苗的關鍵質量屬性之一，二硫鍵的錯配可能會導致蛋白的錯誤折疊使蛋白更傾向于聚集并可能產(chǎn)生一些不確定的免疫反應，是重組蛋白疫苗的質量和安全評價中不可或缺的部分。在二硫鍵的質譜分析中，CID 與EAD是常用的二級碎裂方法。在CID中，二硫鍵阻止半胱氨酸（Cys）殘基周圍的肽鏈碎裂，二級譜圖質量較差，從而限制了二硫鍵信息的準確判定。而EAD 可以通過調整電子能量來改變斷裂機制，不會受到二硫鍵的影響，能夠獲得更為全面的二級信息，特別適合于蛋白樣品的二硫鍵分析。如圖4 所示，EAD 的譜圖碎片離子相較CID 更加豐富，可對二硫鍵進行更加準確的判定。
2.1.3 宿主細胞蛋白殘留分析
除重組蛋白疫苗自身外，工藝相關雜質之一的宿主細胞蛋白（host cell protein, HCP）也是檢測蛋白疫苗質量和安全評價的重要項目之一。酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunesorbent assay，ELISA） 是目前HCP 檢測的主要方法，但其無法檢測一些弱免疫原性或非免疫原性的HCP，且無法對單個HCP 進行鑒定。但LC-MS 技術可以實現(xiàn)痕量HCP的鑒定和定量，是ELISA 技術較好的補充。其常用的策略是首先通過在線二維高pH 或低pH 反相色譜分離多肽，解決HCP 雜質分析時樣品復雜以及動態(tài)范圍較寬的問題，提高HCP 檢測靈敏度；然后再基于質譜技術同時表征疫苗蛋白與HCP 雜質。質譜中常用的數(shù)據(jù)采集模式為數(shù)據(jù)依賴性采集，該種模式下，只有滿足一定判定條件的肽段才能夠發(fā)生二級碎裂，獲得響應的二級碎片信息，而對于一些不滿足判定條件的肽段，則不容易被檢測到，HCP 分析偶爾會出現(xiàn)遺漏，容易出現(xiàn)假陰性。數(shù)據(jù)非依賴性采集（如SWATH®）是一種全景式的掃描方式，能夠全面獲得每一條肽段的二級碎片信息，保證HCP 的準確鑒定和定量。Chen等[7] 利用ZenoTOF 7600 系統(tǒng)采用SWATH® 方式，加上其自帶的Zeno 離子阱富集功能，對HCP 進行全面可靠的鑒定及超靈敏的定量，可達到亞ppm 水平，有效避免假陰性情況的出現(xiàn)，如圖5 所示，借助該方法可以有效應用于不同純化階段的樣品中HCP 雜質的殘留檢測，包括成品藥物、病毒過濾后樣品、陽離子交換后樣品和蛋白親和色譜后樣品。
2.1.4 目標蛋白定量分析
疫苗中抗原蛋白的含量與疫苗的有效性直接相關，在提升疫苗質量、加強疫苗質量評價力度的呼聲中，測定疫苗成品中抗原蛋白含量的需求日益迫切。對于新冠病毒疫苗來說，傳統(tǒng)方法檢測新冠病毒S 蛋白含量需要依靠免疫學分析方法，例如ELISA 技術。利用ELISA 技術檢測S 蛋白需要大量時間通過動物免疫過程制備特異性抗體，且對抗體質量要求較高，不僅需要極高的特異性，而且抗體一般需要較高的親和力。ELISA 技術在檢測過程中易受檢測樣本中其他成分干擾影響測定結果，造成定量不準確。ELISA 技術操作過程復雜，需要進行3~5 步驟孵育和酶聯(lián)反應板洗滌操作，人為因素對實驗影響較大，而且去反應過程易受環(huán)境因素影響，故其穩(wěn)定性和重復性較差。近年來，LC-MS 技術在蛋白的檢測分析方面具有高選擇性和高靈敏度等優(yōu)點，非常適用于復雜生物基質中靶向蛋白的定性和定量研究。Lane 等[8] 建立了一種靶向多肽定量測定法，用于檢測新冠病毒的兩種病毒蛋白：S 蛋白（SPIKE_SARS2）和N蛋白（NCAP_SARS2）。研究人員首先通過基因重組技術合成了這兩種病毒蛋白，通過特異性肽段的查找，質譜參數(shù)的優(yōu)化，確定了最佳的多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）條件；然后將合成的重組蛋白樣品添加到健康患者的鼻咽拭子樣本中，確定了該方法的檢出限。該方法穩(wěn)定性好，重復性好，檢出限可達fmol 級別。
2.2 病毒疫苗
病毒疫苗包括減毒活疫苗和滅活疫苗， 通常由核酸及外面包裹的衣殼蛋白組成， 體積較大。對于病毒疫苗，在其結構表征和質量控制方面， 也參考了重組蛋白疫苗的相關方法， 其中LC-MS 技術發(fā)揮了積極推動作用。Zhang 等[9] 采用LCQ-TOF-MS 法分析了流感疫苗裂解液中的血細胞凝集素（hemagglutinin，HA）與核蛋白（nuclear protein，NP） 的完整分子量，如圖6 所示。研究人員通過一級質譜法鑒定出分子量分別為25 156.3、34 779.6、36315.6 和55 440.3 的4 種蛋白，后根據(jù)流感病毒蛋白的理論分子量，推斷其分別為HA2 去糖基化蛋白、HA1 去糖基化蛋白、肽-N-糖苷酶 F 和核蛋白。此外，還分析了流感疫苗裂解液中的血細胞凝聚素與核蛋白的序列覆蓋度，檢測結果均約為80%。
2.3 多糖蛋白結合疫苗
多糖蛋白結合疫苗是一類以細菌多糖與蛋白通過化學反應偶聯(lián)形成的疫苗，可以克服傳統(tǒng)多糖疫苗對嬰幼兒免疫效果較差的缺點。多糖蛋白結合疫苗的研發(fā)及成功上市是預防細菌性傳染病的突破，目前已批準上市的多糖蛋白結合疫苗主要有b 型流感嗜血桿菌結合疫苗、13 價肺炎球菌多糖結合疫苗和A 群C 群腦膜炎球菌多糖結合疫苗。多糖蛋白結合疫苗生產(chǎn)工藝及過程控制相比于其他細菌性疫苗更為復雜，需要對其工藝過程有充分的認識，把握其工藝過程的關鍵操作步驟、關鍵操作參數(shù)、關鍵控制項目及控制指標，才能在多糖蛋白結合疫苗生產(chǎn)過程中，避免減少次要偏差的發(fā)生，杜絕重大偏差的發(fā)生，確保多糖蛋白結合疫苗質量安全有效。質譜技術是多糖蛋白結合疫苗強有力的表征技術，Wang 等[10] 利用ZenoTOF 7600對多糖蛋白結合疫苗生產(chǎn)過程中使用的載體蛋白CRM197 進行了分子量和序列覆蓋度的有效分析，其結果準確度高，序列覆蓋度可達95% 以上。
2.4 核酸疫苗
mRNA 疫苗是將含有編碼抗原蛋白的mRNA 導入人體，直接進行翻譯， 形成相應的抗原蛋白， 從而誘導機體產(chǎn)生特異性免疫應答，達到預防疾病的目的[11]。相比于傳統(tǒng)疫苗，mRNA疫苗在安全性、有效性、開發(fā)速度和規(guī)?；a(chǎn)能力等方面具有顯著優(yōu)勢。然而，mRNA 性質不穩(wěn)定，極易被無處不在的核酸酶降解，使得mRNA 疫苗在生產(chǎn)、工藝、長期儲存等過程存在挑戰(zhàn)。同時，mRNA 分子量較大（300~5000kDa）， 若要順利進入細胞質中發(fā)揮作用，必須依靠遞送系統(tǒng)，而遞送系統(tǒng)很大程度決定了mRNA 疫苗的安全性、儲藏條件和儲藏時限。因此，需要在mRNA 疫苗生產(chǎn)的各個階段進行質量評估及控制。
2.4.1 mRNA 加帽效率分析
mRNA 作為疫苗，通常以線性化的DNA 作為模板，通過體外轉錄（in vitro transcription，IVT）獲得。真核生物mRNA 的5'端有一個由三磷酸橋接的7-甲基鳥苷（m7G）帽，這種結構被稱為Cap 0。Cap 0 在翻譯起始因子的招募過程中起著非常重要的作用，而且在細胞質中還可以防止mRNA 被降解。在高等真核生物中，第一個近端核苷酸的核糖2 號碳羥基甲基化形成Cap 1結構（m7GpppmN），其中約有50%mRNA 的近端第二個核苷酸的核糖2 號碳羥基甲基化可形成Cap2 結構（m7GpppmNmN），因此加帽效率成為mRNA 疫苗生產(chǎn)過程中重要的質量參數(shù)之一。作為疫苗使用的mRNA 長度通常為幾千個核苷酸（nt），而5'端的帽子結構的分子量為297Da，接近一個核苷酸的分子量，幾千個核苷酸長度下無法區(qū)分單個核苷酸的差異，需要酶切為短片段才可以通過質譜技術進行分離和檢測。Beverly 等[12] 提出了核糖核酸酶H（ RNase H）介導的探針切割法， 該方法使用一段2'-O-methyl 修飾的生物素標記RNA 探針，可與底物mRNA5'UTR 區(qū)域發(fā)生互補配對， 而RNase H 會切割與探針3'末端切割位點配對的mRNA 序列。之后，利用鏈霉親和素磁珠分離得到5'切割產(chǎn)物，再通過LC-MS技術定量分析帽子結構，計算出加帽效率。Song 等[13] 利用特定的核糖核酸酶（RNase） 將mRNA 加帽端切割為15~30nt的片段，再利用質譜技術對酶切后的片段進行檢測，有效地分離出未加帽與加帽的mRNA 片段，如圖7 所示，然后根據(jù)加帽片段峰面積占未加帽與加帽片段峰面積之和的比例計算出mRNA 的加帽效率。
2.4.2 mRNA 尾巴分布分析
多聚腺苷酸（Poly A）尾巴有助于維持mRNA 的穩(wěn)定性、運輸和轉譯效率，影響著mRNA 的半衰期。根據(jù)mRNA 種類的差異，通常Poly A 尾巴的長度在幾十至幾百個核苷酸之間。mRNA 的3'端Poly A 尾巴結構可通過轉錄模板的設計添加，也可在轉錄后通過酶法進行加尾，Poly A 尾巴的添加效率和分布是mRNA 疫苗的質量控制參數(shù)之一。質譜是一種無標記的直接測量技術，在適宜的長度前提下能夠通過單核苷酸的質量差異進行區(qū)分，而mRNA長度通常為幾千個核苷酸，長度超過質譜的檢測能力， 如需對Poly A 尾巴進行長度分布和含量的分析，則需要對mRNA 的Poly A 進行酶切處理。Beverly等[14] 介紹了一種分析Mrna Poly A 尾巴長度的方法， 該方法基于核糖核酸酶T1（RNaseT1）將Poly A 從mRNA 序列上進行切割，通過dT 磁珠特異性捕獲Poly A，然后借助LC-MS 技術的高分辨率，定量分析mRNA的Poly A 尾巴長度分布。Gao等[15] 利用特定的RNase T1 將mRNA 的Poly A 尾巴進行切割，利用質譜對Poly A 尾巴進行分子量測定，確認了兩組Poly A 尾巴的長度分布，如圖8 所示，并進行了相對含量測定。
2.4.3 mRNA 遞送系統(tǒng)LNP 相關分析
mRNA 疫苗開發(fā)過程中主要面臨三大問題：①核酸分子在體內的不穩(wěn)定性；②核酸分子潛在的不良反應；③核酸藥物遞送系統(tǒng)開發(fā)難度大。脂質納米顆粒（lipid nanoparticle，LNP）是目前核酸藥物研究應用最多的遞送系統(tǒng)之一[16]，其能夠安全有效地遞送核酸。LNP 與其他轉基因傳遞載體相比具有很多獨特之處，不僅擁有高效的封裝率，而且對于待測mRNA 的大小沒有限制。除此之外，其還可以在不誘導免疫原性的情況下刺激先天免疫系統(tǒng)，將mRNA 結合到LNP 中以保護mRNA 免受酶的攻擊，并增強細胞的攝取和表達。LNP 通常由4 種結構脂組成：①陽離子脂質，藥物轉染中起主要作用；②中性脂質，如膽固醇，起到穩(wěn)定納米顆粒結構的作用；③ 兩性脂質，輔助性脂質，能夠加快LNP在細胞中的結構轉化，加速藥物釋放；④聚乙二醇脂質，能夠提高納米顆粒整體的穩(wěn)定性，延長納米顆粒藥物在血液中的代謝時間。
2.4.3.1 脂質組分及其雜質的鑒定和相對定量分析
可電離脂質在配方中的占比通常為總脂質的20%~40%。目前，許多研究人員致力于微調可電離脂質的性質以進一步提高效率，尤其在難以到達的人體組織中遞送效率的提高?？呻婋x脂質的整體結構可分為3 個部分：頭部、連接片段和尾部?？呻婋x脂質的頭部基團通常帶有正電荷。頭部基團的大小和電荷密度主要參與包裹核酸， 穩(wěn)定LNP， 與細胞膜相互作用及促進內體逃逸等過程。連接片段可以將頭部與尾部連接起來， 連接片段會影響LNP 的穩(wěn)定性、生物降解性、細胞毒性和轉染效率等。疏水性尾部會影響藥物的解離常數(shù)（pKa），親脂性、流動性和融合性，從而影響LNP 的形成和效力。常見的可電離脂質有DLin-MC3-DMA（MC3）、 SM-102和ALC-0315，關于其成分的鑒定及潛在雜質和降解產(chǎn)物的分析，是mRNA 疫苗分析的關鍵質量屬性之一。LC-MS 技術可簡單、快速地分析LNP 中的脂質成分，如圖9 所示，并對其中的雜質和降解產(chǎn)物進行快速確認以及相對定量[17]。
2.4.3.2 脂質的氧化及位點確認
有研究表明，可電離脂質的氧化可能導致mRNA 的共價修飾并使mRNA 效價下降。CID技術不能提供氧化位點信息，而EAD 技術是鑒別脂質氧化位點的關鍵技術。利用EAD 產(chǎn)生的獨特片段離子，可精確區(qū)分2 種同分異構體中一個發(fā)生氧化修飾和另一個雙鍵被還原相關雜質的確切位置，這些信息可以用來確定LNP 配方的療效和安全性。Crowe等[18] 使用EAD 鑒別MC3 的2種氧化雜質異構體，EAD 產(chǎn)生的二級譜圖可用于識別和區(qū)分2 個含氧異構體。如圖10 所示，質荷比為 558.5、574.5 和587.5 處的特征離子表明，雜質1 烷基鏈的C6 處含氧；質荷比為61.05的片段離子表明雜質2 中氧的修飾位點在叔胺（形成N- 氧化物）上。此外，該方法還可以為新型合成脂類的合理設計提供幫助。
3、LC-MS 技術在疫苗輔料和佐劑分析中的應用
藥用輔料（pharmaceutical excipients）是指生產(chǎn)藥品和調配處方時使用的賦形劑和附加劑，是除活性成分或前體以外，在安全性方面已進行合理的評估，一般包含在藥物制劑中的物質。在作為非活性物質時，藥用輔料除了賦形、充當載體、提高穩(wěn)定性外，還具有增溶、助溶、調節(jié)釋放等重要功能，是可能會影響到制劑的質量、安全性和有效性的重要成分[19]。疫苗的輔料檢測方法及檢驗標準相對研究較少，與傳統(tǒng)的小分子藥物不同，疫苗的輔料一般為高分子材料，有一定分子量分布，而非單一的成分。例如，通過加入輔料聚山梨酯80 來穩(wěn)定蛋白或引入LNP 等手段提高mRNA 生物相容性和穩(wěn)定性[20]。佐劑（adjuvant）又稱為免疫調節(jié)劑或免疫增強劑，是疫苗的重要輔料，根據(jù)化學性質大致可以分為：無機鹽類佐劑（如常用的氫氧化鋁和磷酸鋁）、乳劑型佐劑（如MF59 和AS03 佐劑）、水溶性佐劑（如皂苷QS-21）、微?？乖蔬f系統(tǒng)佐劑（如AS01 和Matrix-M 佐劑）、細胞因子類佐劑（ 如IL-2 和IL-12） 等[21]。這些輔料的結構中多無紫外吸收基團以及在制劑中含量較低，因此對其分析與評價也面臨著巨大挑戰(zhàn)。
LC-MS 技術適用于分析含量低、不易分離或缺乏紫外吸收的物質， 成為輔料或佐劑定性定量分析的重要研究手段。目前，已有一些針對生物制藥領域比較熱門的輔料和佐劑分析的LC-MS 技術，為生物制品中輔料或佐劑分析方法的開發(fā)提供了參考。聚山梨酯，又名吐溫，是一類非離子型表面活性劑類輔料，可以最大限度地減少生物制品的聚集、變性和表面吸附，例如常用的聚山梨酯20 和聚山梨酯80。Peronin 等[22] 建立了一種基于LC-MS 技術定量分析在含蛋白和鋁佐劑的復雜疫苗基質中的輔料聚山梨酯20 和聚山梨酯80 的方法，將聚山梨酯堿性水解釋放月桂酸和油酸，采用LC-MS 技術在負離子模式下測定了21 份疫苗樣品中的月桂酸和油酸。AF03是一種基于角鯊烯的乳液，由角鯊烯、脫水山梨醇油酸酯和鯨蠟硬脂醇聚醚-12 組成，已被用作疫苗佐劑，例如用于已上市的流感疫苗Humenza™ 中。采用高效液相色譜- 電噴霧電離- 質譜（HPLC-ESI-MS）技術可對復雜乳液基質中的2 種表面活性劑脫水山梨醇油酸酯和鯨蠟硬脂醇聚醚-12 進行定量測定，該技術除了應用于AF03 佐劑制備過程中的質量分析與控制外，還可以進一步評估含AF03 佐劑配方的質量及穩(wěn)定性，為疫苗質量控制中原料鑒定、配方工藝開發(fā)和乳液表征提供了有效技術[23]。
4、結 語
質譜技術作為一項重要的分析技術，被廣泛應用于生物制品的結構表征分析。本文詳細綜述了LC-MS 技術在疫苗研究中的作用，主要涉及重組蛋白疫苗、病毒疫苗、多糖蛋白結合疫苗、核酸疫苗的分析。對于重組蛋白疫苗，LC-MS 技術可以從多個維度對其進行全面表征，包括精確分子量分析、肽圖分析（序列覆蓋度、翻譯后修飾等）、二硫鍵分析，還可以實現(xiàn)目標蛋白的準確定量分析。對于病毒疫苗和多糖蛋白結合疫苗，LC-MS 技術可以進行完整分子量和肽圖的分析。對于核酸疫苗，LC-MS 技術可應用于其生產(chǎn)的多個環(huán)節(jié)并對其質量進行評估，包括mRNA加帽效率分析、尾巴分布分析等。此外，還可以對其藥物遞送系統(tǒng)LNP 進行主要脂質組分及其雜質的鑒定和相對定量分析，借助于EAD 技術還可對其氧化位點進行有效分析。LC-MS 技術的使用促進了疫苗開發(fā)領域的不斷發(fā)展，同時也為疫苗監(jiān)管機構提供了強有力的分析工具，有效保證了疫苗產(chǎn)品的安全可靠。隨著疫苗產(chǎn)品的不斷涌現(xiàn)，以及監(jiān)管機構對疫苗產(chǎn)品的監(jiān)管力度加強，LC-MS 技術將會在疫苗領域發(fā)揮更大的作用。
引用本文
李陽,宋洋,王文濤,生寧,羅繼,郭立海,張金蘭*,陳泓序*.液相色譜-質譜聯(lián)用技術在疫苗分析中的應用[J].中國食品藥品監(jiān)管,2023(7):30-43.
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