多肽藥物一般被定義為由少于40個(gè)氨基酸殘基通過(guò)酰胺鍵組成的聚合物。由于多肽藥物具有很高的受體活性和選擇性，較低的毒副作用風(fēng)險(xiǎn)，制藥行業(yè)對(duì)多肽產(chǎn)生了濃厚的興趣。期間也出現(xiàn)了很多明星藥物，他們大多集中在代謝疾病領(lǐng)域，如GLP-1類似物索馬魯肽，胃抑制多肽(GIP)和胰高血糖素樣肽-1 (GLP-1)雙受體激動(dòng)劑替西帕肽等。此外，隨著PDC，RDC藥物的興起。目前用于制備多肽藥物的方法主要有化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法。生物發(fā)酵法主要用于長(zhǎng)肽的制備，其優(yōu)勢(shì)在于生產(chǎn)成本低，但無(wú)法在肽序中引入非天然氨基酸，也無(wú)法對(duì)肽鏈進(jìn)行各種修飾，因此它的應(yīng)用也受到了很大的限制?；瘜W(xué)合成法包括固相合成法和液相合成法，其中固相合成法相比液相合成法有其顯著的優(yōu)點(diǎn)：可以使用過(guò)量的物料進(jìn)行反應(yīng)以確保完全偶聯(lián)，通過(guò)簡(jiǎn)單的對(duì)洗滌操作就可以除去過(guò)量的氨基酸，縮合劑，副產(chǎn)物等，避免了復(fù)雜的后處理與純化操作，提高生產(chǎn)效率等，因此固相合成法應(yīng)用最為廣泛。用于化學(xué)合成法合成多肽的原料包括起始物料，試劑，溶劑。他們的質(zhì)量特別是起始物料的質(zhì)量會(huì)對(duì)API的質(zhì)量產(chǎn)生不同的影響。起始物料主要指的是保護(hù)的氨基酸衍生物，用于肽鏈修飾的脂肪酸，聚乙二醇等作為重要的結(jié)構(gòu)片段并入原料藥的結(jié)構(gòu)中的物料，直接影響API的質(zhì)量，因此應(yīng)重點(diǎn)討論對(duì)起始物料的控制。
一、起始物料選擇的合理性
ICHQ11明確指出如果使用市售的化學(xué)品作為起始原料，申請(qǐng)人通常不需要對(duì)其合理化進(jìn)行論證。市售化學(xué)品通常除了用作藥物的起 始原料外，還已經(jīng)在非藥用市場(chǎng)進(jìn)行銷售。定制合成制備的 化學(xué)物質(zhì)不屬于市售化學(xué)品。雖然保護(hù)氨基酸沒(méi)有非藥用市場(chǎng)以滿足ICHQ11對(duì)市售化學(xué)品的定義，但是他們結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，具有明確的化學(xué)特性和結(jié)構(gòu)，易被分離和純化，且能使用常見(jiàn)的分析手段進(jìn)行鑒別、檢測(cè)，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，易于儲(chǔ)存、運(yùn)輸，合成路線成熟，且目前國(guó)內(nèi)多家大型供應(yīng)商能夠持續(xù)生產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定的保護(hù)氨基酸，為商業(yè)化容易獲得的物料，因此他們能夠被認(rèn)定為起始物料。但對(duì)于保護(hù)氨基酸以外的特殊結(jié)構(gòu)單元，可能需要額外的論證才能把它們定義為起始物料。
二、起始物料中有關(guān)物質(zhì)的控制
前面提到保護(hù)氨基酸作為重要的結(jié)構(gòu)片段并入到API的結(jié)構(gòu)中，直接影響API的質(zhì)量，因此我們要嚴(yán)格控制起始物料中雜質(zhì)的含量，了解這些雜質(zhì)在既定的工藝中發(fā)生的轉(zhuǎn)化與清除，最終明確他們與API中雜質(zhì)的關(guān)系。下面以Fmoc-Ala-OH為例，對(duì)保護(hù)氨基酸中的幾種雜質(zhì)進(jìn)行說(shuō)明：
1. 不正確的異構(gòu)體
在合成Fmoc-Ala-OH過(guò)程中，如果起始原料中含有D-Ala，按照工藝傳遞會(huì)生成相應(yīng)的Fmoc-D-Ala-OH 圖1。起始物料中一旦出現(xiàn)此類雜質(zhì)，就會(huì)隨著工藝一直傳遞到API中生成對(duì)應(yīng)的單氨基酸消旋肽雜質(zhì)，由于消旋肽雜質(zhì)和API的結(jié)構(gòu)極為相似，很難通過(guò)后續(xù)制備純化除去，因此應(yīng)嚴(yán)格控制對(duì)應(yīng)的保護(hù)氨基酸中的異構(gòu)體雜質(zhì)。此外，對(duì)于有多個(gè)手性中心的保護(hù)氨基酸，如Fmoc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH圖2，除了需要研究α-C的構(gòu)型之外，側(cè)鏈的手性中心也要考慮表1。例如Fmoc-Thr(tBu)-OH，除了研究常規(guī)的保護(hù)氨基酸中的雜質(zhì)之外，需要研究的異構(gòu)體雜質(zhì)有Fmoc-D-Allo-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc- Allo-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-D-Thr(tBu)-OH。值得注意的是Fmoc-Thr(tBu)-OH與Fmoc-D-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-D-Allo-Thr(tBu)-OH與Fmoc- Allo-Thr(tBu)-OH互為對(duì)映異構(gòu)體，使用普通的HPLC方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)分離，可能需要用到手性柱。
圖1
圖2
表1
2. Fmoc保護(hù)的二肽
在合成Fmoc-Ala-OH過(guò)程中，過(guò)量的Fmoc-Osu會(huì)與生成的Fmoc-Ala-OH反應(yīng)得到Fmoc-Ala-OFm，再與剩余的Ala反應(yīng)得到Fmoc-Ala-Ala-OH圖1。此類雜質(zhì)也會(huì)隨著工藝一直傳遞到API中生成相應(yīng)的插入肽雜質(zhì)，應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制。
3. Fmoc-β-丙氨酸衍生物
機(jī)理見(jiàn)圖3，在合成Fmoc-Osu過(guò)程中可能會(huì)生成β-Ala，β-Ala與過(guò)量的Fmoc-Osu反應(yīng)生成Fmoc-β-Ala-OH?；蛘?beta;-Ala與Ala、Fmoc-Osu依次反應(yīng)得到Fmoc-β-Ala-Ala-OH。此類雜質(zhì)也會(huì)隨著工藝一直傳遞到API中生成相應(yīng)的β-Ala替換肽和插入肽雜質(zhì)應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制。
圖3
4. 游離氨基酸或部分保護(hù)雜質(zhì)
由于沒(méi)有α-氨基或側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)，游離氨基酸在活化過(guò)程中會(huì)生成復(fù)雜的多聚雜質(zhì)，應(yīng)嚴(yán)格控制。但游離氨基酸沒(méi)有保護(hù)基團(tuán)，普通色譜柱不易保留且紫外吸收很弱，不適合使用HPLC控制?？梢愿鶕?jù)中國(guó)藥典2020年版四部通則0502使用薄層色譜法進(jìn)行控制。
5. 非手性異構(gòu)體
主要指的是非手性的同分異構(gòu)體，如Ile和Leu；或氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)錯(cuò)位保護(hù)產(chǎn)生的異構(gòu)體，如Fmoc-Glu(OtBu)-OH和Fmoc-Glu-OtBu，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Asp-OtBu。
三、起始物料中的溶劑殘留
一般來(lái)說(shuō)，考慮到多肽固相合成的特殊性，每步氨基酸偶聯(lián)完成及脫保護(hù)后都會(huì)使用大量溶劑洗滌肽樹(shù)脂，肽樹(shù)脂裂解得到的粗肽還會(huì)使用HPLC制備，凍干，因此殘留在保護(hù)氨基酸中的少量溶劑傳遞到最終API中的風(fēng)險(xiǎn)很小。但這里應(yīng)特別注意乙酸，乙酸乙酯，醇類溶劑的殘留，因?yàn)檫@些溶劑可能在氨基酸活化偶聯(lián)過(guò)程與活化的氨基酸或肽鏈發(fā)生副反應(yīng)，如殘留的乙酸在氨基酸偶聯(lián)過(guò)程中會(huì)與肽鏈上裸露的氨基反應(yīng)導(dǎo)致肽鏈封端；殘留的醇類溶劑可能在氨基酸活化過(guò)程中與活化的羧基反應(yīng)造成活化的氨基酸被鈍化，使氨基酸當(dāng)量降低，最終可能導(dǎo)致氨基酸偶聯(lián)不完全，產(chǎn)生缺失肽雜質(zhì)。以鄭源生化某氨基酸為例圖4，該公司在COA中控制了乙酸乙酯，乙醇，甲醇，乙酸。其中乙酸乙酯的標(biāo)準(zhǔn)為≤0.5%，實(shí)際檢出為0.10%。根據(jù)ICHQ3C，乙酸乙酯為3類溶劑，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)為≤0.5%符合的ICHQ3C要求，但是考慮到乙酸乙酯可能造成氨基乙?；舛说娘L(fēng)險(xiǎn)，我們還應(yīng)對(duì)乙酸乙酯進(jìn)行加標(biāo)研究，確定一個(gè)更加合適的標(biāo)準(zhǔn)。
圖4
四、起始物料中的元素雜質(zhì)
根據(jù)ICHQ3D、USP<232>、USP<233>的要求，應(yīng)對(duì)所有API的元素雜質(zhì)進(jìn)行評(píng)估。從ICHQ3D中的附圖可知，藥品中的元素雜質(zhì)可能來(lái)自于API，而起始物料中的元素雜質(zhì)也有傳遞到API中的風(fēng)險(xiǎn)。因此，應(yīng)對(duì)起始物料中的元素雜質(zhì)進(jìn)行評(píng)估與控制，特別是對(duì)于那些在生產(chǎn)工藝中使用金屬催化劑的起始物料。例如Fmoc-Thr(tBu)-OH的合成過(guò)程中需要用到金屬鈀催化脫除Cbz保護(hù)基圖5，根據(jù)ICHQ3D的要求，金屬鈀屬于2B類元素雜質(zhì)，若在工藝中有意添加，無(wú)論何種給藥途徑都需要研究。
圖5
五、TSE/BSE風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估
TSE(Transmissible Spongiform Encephalopathy)是一種可引起人和動(dòng)物腦部病變的疾病，包括克雅氏癥（Creutzfeldt-Jakob Disease (CJD)），變異克雅氏癥（variant Creutzfeldt-Jakob Disease (vCJD)），人體庫(kù)魯?。↘uru in humans），瘋牛病（Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) in cattle），羊癢?。⊿crapie in small ruminants (sheep and goats)），鹿慢性消耗?。–hronic Wasting Disease (CWD) in cervids），以及貂慢性傳染性腦?。═ransmissible Mink Encephalopathy (TME) in minks）等。許多國(guó)家的現(xiàn)行法規(guī)要求必須對(duì)所有獲得許可的藥品進(jìn)行含有傳染性海綿狀腦病的潛在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，包括歐盟法規(guī)EMA/410/01 《降低人及獸藥中的TSE風(fēng)險(xiǎn)指南》和EC No 999/2001 《制定預(yù)防、控制和消除某些TSE的規(guī)則》，F(xiàn)DA 21CFR 189.5《禁用的牛材料》，我國(guó)TSE污染風(fēng)險(xiǎn)小，目前無(wú)相關(guān)法規(guī)。
用于合成保護(hù)氨基酸的游離氨基酸可能來(lái)自于動(dòng)物組織毛發(fā)水解，存在TES風(fēng)險(xiǎn)，因此必須確認(rèn)供應(yīng)商提供的保護(hù)氨基酸的來(lái)源，評(píng)估TES風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)然，更簡(jiǎn)便的方式就是直接購(gòu)買非動(dòng)物源的氨基酸，同時(shí)需要供應(yīng)商提供一份TSE/BSE聲明，聲明內(nèi)容應(yīng)包括“XXX有限公司在此證明，我們生產(chǎn)的XXX產(chǎn)品符合以下要求：無(wú)動(dòng)物源性成分；沒(méi)有來(lái)自或接觸到受影響的、或接受隔離的傳播動(dòng)物海綿狀腦病/牛海綿狀腦病的動(dòng)物材料。我們的生產(chǎn)設(shè)備中沒(méi)有使用動(dòng)物或動(dòng)物制品或動(dòng)物副產(chǎn)品或獸用疫苗或動(dòng)物病原體。”
六、對(duì)供應(yīng)商的要求
雖然目前沒(méi)有法規(guī)要求起始物料需要在GMP條件下生產(chǎn)，但為了保證供應(yīng)商能夠提供質(zhì)量合格且穩(wěn)定的起始物料，建議供應(yīng)商至少在“類GMP”的條件下生產(chǎn)，可以通過(guò)供應(yīng)商進(jìn)行審計(jì)來(lái)考察是否有良好的質(zhì)量體系，生產(chǎn)文件體系和適當(dāng)?shù)目刂苼?lái)保證生產(chǎn)工藝穩(wěn)定且可靠，是否有資質(zhì)和能力保證起始物料的質(zhì)量，長(zhǎng)期穩(wěn)定的供貨。為了降低風(fēng)險(xiǎn)，還應(yīng)與供應(yīng)商簽訂質(zhì)量協(xié)議，要求其供應(yīng)的起始物料的生產(chǎn)工藝如果發(fā)生變更，必須提前通知我方，并且在獲得我方批準(zhǔn)后才能實(shí)施變更。為了進(jìn)一步降低斷貨的風(fēng)險(xiǎn)，除了選定一家起始物料的主供應(yīng)商之外，還建議選定至少一家輔供應(yīng)商。供應(yīng)商應(yīng)提供相應(yīng)的資質(zhì)證明文件，包括營(yíng)業(yè)執(zhí)照、生產(chǎn)許可證、工藝路線、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和COA。
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