在色譜方法開發(fā)過程中，高柱效、高分離度是一貫追求的目標，而色譜柱和流動相的選擇特別地被關注。流動相是影響高效液相色譜（HPLC）性能的重要因素，其性質包括有機溶劑的種類、配比和pH值等，對保留時間、峰形和分離度都有影響，這些直接對實驗結果產(chǎn)生不可忽視的作用，因此正確的選擇流動相是至關重要的。本文探討了反相高效液相色譜（RP-HPLC）中如何正確快速地選擇流動相，并且優(yōu)化最佳分離條件。
1、 分析樣品的組成及性質
在色譜方法建立之初，對樣品的化學組成和理化性質要有一定的了解，才能確定與選擇出最佳的初始分離模式。
1.1 樣品的相對分子質量
考慮到多肽的相對分子質量大和組成復雜，并且其保留行為對有機溶劑比例的微量變化非常敏感，等度洗脫時分離結果的重現(xiàn)性差，白泉等就分別對多肽32、21設計了5、6種線性梯度洗脫方式進行流動相優(yōu)化，最終各自優(yōu)化出一種線性梯度方式，分離、純化和制備出高純度的兩種多肽。樣品的相對分子質量對初始條件的選擇是有影響的，對于相對分子質量大的樣品，如多肽、蛋白質和低聚物等生物大分子，梯度洗脫是最好的選擇。對于低相對分子質量的樣品，需要通過分析樣品性質，如溶解性、分子極性及化合物結構、特殊官能團等，選擇適宜的流動相及分離模式。
1.2 樣品的溶解度
了解樣品在有機溶劑中的溶解度，根據(jù)“相似相容”原理，初步判斷樣品是極性還是非極性化合物。若樣品溶解于己烷、庚烷等非極性溶劑時，即為非極性樣品，可以考慮使用正相色譜；若樣品溶解于二氯甲烷、甲醇、乙腈等極性溶劑時，即為極性樣品，考慮的分離模式就是反相色譜。如果樣品溶于水，就首先檢查水溶液的pH值。
1.3 樣品的酸堿性
當樣品中有酸或堿性物質時，在實際的RP-HPLC工作中，常加入酸[5]、堿或緩沖液作為離子抑制劑來抑制被測物解離。較常用的是緩沖鹽，其不僅可以控制流動相的pH值，還起到提高保留時間的重現(xiàn)性和改善峰形的作用。在用ODS-C18色譜柱分析間苯三酚時，發(fā)現(xiàn)當流動相為水-有機相系統(tǒng)時，間苯三酚的峰有嚴重拖尾現(xiàn)象，峰形較差。分析原因可能是間苯三酚呈弱酸性，在該系統(tǒng)下呈解離狀態(tài)，最終優(yōu)化的流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖溶液（6∶94）。此時主峰與雜質峰完全分離，并且其峰形良好。
1.4 樣品的穩(wěn)定性
用一種簡單的RP-HPLC-UV法代替了《美國藥典》中阿奇霉素的檢測方法，研究中考察了流動相不同pH值時樣品的分離情況。當流動相pH值為6時，阿奇霉素峰拖尾嚴重，這是由于阿奇霉素在酸性溶液中不穩(wěn)定；當流動相用10% NaOH溶液將pH值調至8時，則獲得了良好的峰形，并與其他雜質分離情況良好。因此，選擇流動相時，應首先考慮樣品在該流動相體系中是否穩(wěn)定存在。
1.5 對映異構體
當樣品中有對映異構體時，就要考慮在流動相中加入手性衍生化試劑或使用手性色譜柱。
2、 改變選擇性和分離度
執(zhí)行初始分離條件時，會出現(xiàn)各種各樣的問題，如保留時間過短或過長、分離度達不到要求、拖尾嚴重等，通過調節(jié)有機溶劑和添加劑的性質，可控制選擇性和分離度，達到最佳分離效果。
2.1 有機溶劑對分離的影響
有機溶劑的種類和配比決定流動相的極性，即洗脫能力。這對出峰時間、峰形、分離度等有著不可忽視的作用。
2.1.1 有機溶劑比例對分離的影響
初始分離條件中，一般有機溶劑的比例定為80%，然后逐步減少有機相比例，直到保留因子（k）落在所期望值的范圍內，即1≤k≤10，再考慮分離度、拖尾因子和出峰時間等，優(yōu)化出合適的流動相比例。Snyder等在分離4種硝基取代苯混合物時，流動相是乙腈和水，以80%的乙腈作為初始分離條件，其保留時間很短（k＝0.3），并且?guī)追N物質的分離度幾乎為零；接著改用50%乙腈，樣品的保留范圍比較合理（0.9≤k≤4.2），但是分離度仍不符合要求，進一步減少至40%乙腈，保留因子范圍是4.0≤k≤10，分離度為1.4，仍不符合要求。如果再繼續(xù)減少乙腈比例，保留因子就有可能大于10，因此就需要采用其他方法來改變選擇性和分離度。
2.1.2 有機溶劑種類對分離的影響
如上述Snyder等[11]的分離試驗，調整有機溶劑比例仍無法達到要求時，就要考慮換有機溶劑的種類。較常用的是乙腈和甲醇。賈濤[12]以甲醇-水（65∶35）為流動相檢測左炔諾孕酮時，不管何種比例，檢測出的雜質都比較多，且分離度不符合要求，就考慮用乙腈代替甲醇，結果左炔諾孕酮出峰時間合適，并與其他雜質分離情況良好。
當單獨使用乙腈和甲醇都不能滿足要求時，就可以考慮將兩者混合使用。Kurade等用C18色譜柱，分離雷米普利和替米沙坦時，當單獨用緩沖鹽-乙腈和緩沖鹽-甲醇為流動相時，分離度、拖尾因子和保留時間均不符合要求，考慮用甲醇和乙腈的混合物，最終優(yōu)化的流動相系統(tǒng)為磷酸二氫鉀緩沖液（用磷酸調pH值至3.4）-甲醇-乙腈（15∶15∶70），結果顯示雷米普利、替米沙坦的保留時間分別為3.68、4.98 min，二者分離情況良好。
若不能用等度洗脫分離樣品時，梯度洗脫是一種非常好的方法。丁素玲等[14]在檢測鹽酸帕洛諾司瓊的有關物質時發(fā)現(xiàn)，有一中間體的保留時間是主峰出峰時間的9～10倍，為了縮短分析時間，采用了梯度洗脫，縮短了二者的出峰時間差距，并且分離度也符合要求，減少了時間和試劑的浪費。利用RP-HPLC同時測定阿托伐他汀和7種相關雜質的量，由于8種物質的保留范圍寬，考慮梯度洗脫，Petkovska等采用全因子變量設計，通過對有機溶劑比例、有機混合溶劑中四氫呋喃的比例和梯度時間的考察，最終確定了有機溶劑的變化比例是35%～75%，有機混合溶劑中四氫呋喃的比例是10%，梯度洗脫時間是10～20 min。在上述條件下，阿托伐他汀和7種相關雜質分離情況良好。
2.2 緩沖鹽對分離的影響
緩沖鹽的種類、pH值和濃度直接影響緩沖鹽的離子強度，而流動相的離子強度對可解離化合物的色譜峰形具有顯著影響，原因在于色譜柱的過載效應隨著流動相離子強度的增加而減弱。
2.2.1 緩沖鹽種類對分離的影響
《中國藥典》中測定頭孢呋辛鈉中頭孢呋辛時，流動相為乙酸鹽緩沖溶液（用5 mmol/L乙酸鈉和0.1 mol/L乙酸調pH值至3.4）-乙腈（10∶1），與《英國藥典》和《美國藥典》不同的是用了C18色譜柱，結果峰形呈三角形，拖尾因子、峰寬和分離度均不符合要求。當改用甲酸鹽時，同時流動相進一步優(yōu)化成甲酸鹽緩沖液（用80 mmol/L甲酸鈉和0.14 mol/L甲酸調pH值至3.4）-乙腈（9∶1），即使用C18色譜柱也能得到較好的峰形，原因在于甲酸的pKa值為3.7，乙酸pKa值是4.7，甲酸的pKa值與流動相的pH值接近。選用pKa值與流動相pH值越接近的緩沖鹽，其離子強度越強，即緩沖容量越大，易得到較好的峰形。
2.2.2 緩沖鹽的pH值對分離的影響
如上所述，流動相的pH值除了與緩沖鹽本身的pKa值有關外，也應該考慮分離樣品的pKa值，使樣品在該pH值條件下，能以分子狀態(tài)存在。馬志新等依據(jù)離子抑制色譜，用反相鍵合硅膠柱，含18%的甲醇-pH 3.5的50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液為流動相，成功分離了含有丁二酸、戊二酸、己二酸的混合二元羧酸。丁二酸、戊二酸、己二酸的各步pKa值均在4～6，用磷酸鹽緩沖溶液，調節(jié)pH值至3.5，3種酸都以游離狀態(tài)存在，減弱了與固定相的保留，獲得了良好的分離效果。阿托品有叔胺結構，呈堿性，在ODS色譜柱上保留時間很短，張國柱等[22]用磷酸將三乙胺溶液的pH值調至7.5，使阿托品由解離狀態(tài)轉為游離態(tài)，從而增加了其在色譜柱上的保留。流動相的pH值高于或低于被分析物的pka值兩個pH值單位時，有助于獲得尖銳的峰形，化合物99%以一種形式存在[23]。
2.2.3 緩沖鹽的濃度對分離的影響
緩沖鹽濃度越大，其離子強度越強，對峰形的改善越明顯?！睹绹幍洹窚y定青霉素G鉀中青霉素G時，流動相為甲醇-pH 4.3的10 mmol/l磷酸二氫鉀緩沖鹽，當進樣量大時，其峰形拖尾嚴重。綜上所述，pH值為4.3時，緩沖鹽的緩沖容量幾乎為零，導致緩沖液過載，當用磷酸調pH值至3.5時，峰形有所改善，但仍有拖尾。于是考慮增加緩沖鹽濃度，增加至50 mmol/L時，峰形進一步改善。
2.3 特殊的添加劑對分離的影響
當被測化合物帶有強離子官能團時，如磺酸基、羧基、胺基和銨基等，在反相色譜柱上幾乎無保留，給藥物的分離分析帶來巨大困難。參考中性化合物，一般在流動相中加入離子對試劑，與被分析組分的離子生成不帶電荷的中性離子對，從而增加與固定相的作用，改善了分離效果。
2.3.1 堿性離子對試劑
堿性離子對試劑較常用的是高氯酸鹽和烷基磺酸鹽。陳紅等用C18色譜柱，測定噻托溴銨的兩種中間體，即二(2-噻吩基)乙醇酸東莨菪酯和2,2-二噻吩基乙醇酸甲酯，實驗過程中發(fā)現(xiàn)：由于兩種化合物結構含有極性基團和N、S原子，會部分質子化而帶正電荷，與硅膠柱上殘留的硅醇基相互作用，當不加離子對試劑時，峰形拖尾嚴重。因此，在流動相中加入離子對試劑戊烷磺酸鈉，形成中性離子，改善峰形和分離效果。王鹛嵩等以C18色譜柱，實驗初期選用乙腈-磷酸鹽緩沖液和甲醇-磷酸鹽緩沖液作為流動相，定量分析血液中二甲雙胍的濃度，無論怎么改變有機相比例和緩沖鹽性質，二甲雙胍的保留時間很短，與血漿中雜質分不開。在酸性條件下，加入十二烷基磺酸鈉，得到了滿意的分離效果。
另一種分析堿性化合物時，抑制固定相殘留硅醇基作用的添加劑是胺，最常用的是三乙胺。El-Enany等用反相液相色譜法測定了格列苯脲片劑的量時，最初始無論是選用的甲醇-水、甲醇-緩沖鹽或乙腈-水為流動相，拖尾因子高達2.0。實驗證實，流動相中加入三乙胺后，改善了峰拖尾，獲得了滿意的分離效果。
2.3.2 酸性離子對試劑
《中國藥典》中采用高效液相色譜測定氟喹諾酮類藥物時，一般用反相柱和磷酸鹽緩沖液-甲醇或乙腈作流動相，幾乎可適用于所有的氟喹諾酮類藥物。考慮到喹諾酮類藥物具有兩性基團，在水溶液中通常以離子形式存在，與柱填料表面殘存的硅醇基有強烈吸附作用，導致色譜峰易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。根據(jù)離子對色譜理論，在流動相中加入反離子對試劑進行分析。孫漢文等將四丁基溴化銨作為離子對試劑加到乙腈-水流動相中，分別以磷酸和三氟乙酸調節(jié)流動相pH值至2.87，成功分離了依諾沙星、氟羅沙星、培氟沙星、洛美沙星、環(huán)丙沙星和恩氟沙星等7種氟喹諾酮類藥物。
3、 結語
對于大多數(shù)的研究者來說，流動相的選擇和優(yōu)化是整個色譜方法開發(fā)過程中的難點，也是最耗時耗力的一部分。本文僅簡單介紹了流動相溶液中的有機溶劑、緩沖鹽和一些特殊的添加劑對分離的影響，即在反相高效液相色譜方法建立前，應先分析藥物的基本結構，掌握其物理化學性質，特別是藥物的極性或解離性和酸堿性，確定初始分離條件，再根據(jù)出現(xiàn)的具體問題，結合日常實踐經(jīng)驗的積累、相關文獻和影響分離的因素，改變選擇性和分離度，正確快速地優(yōu)化出最佳的流動相組成，為實驗者選擇和優(yōu)化流動相提供簡單參考。
然而對于相對分子質量較大、成分和組成復雜的樣品，以及那些中藥成分和生物大分子樣品，這些是遠遠不夠的，這就需要研究者們在實踐中不斷總結，不斷積累，分享出更多有價值的經(jīng)驗，并且充分利用計算機軟件系統(tǒng)，構建一套完整系統(tǒng)的流動相選擇優(yōu)化的理論。
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