常規(guī)C18色譜柱的pH耐受范圍為2-8，強(qiáng)酸性化合物的pKa一般小于2，強(qiáng)堿性化合物的pKa一般大于9，很難在常規(guī)C18上實(shí)現(xiàn)保留。拋開(kāi)石墨碳色譜柱（pH耐受范圍0~14）、HILIC色譜柱、離子交換色譜柱不談，若要在常規(guī)C18上實(shí)現(xiàn)有效保留，對(duì)于強(qiáng)酸性化合物，可通過(guò)離子對(duì)色譜法實(shí)現(xiàn)保留；對(duì)于強(qiáng)堿性化合物，可通過(guò)離子對(duì)色譜法或離液劑實(shí)現(xiàn)保留。本文的目的旨在通過(guò)對(duì)兩者的保留機(jī)理進(jìn)行淺析、并結(jié)合一些案例來(lái)闡明二者保留機(jī)理的異同。
圖1為RP-HPLC中離子對(duì)試劑的作用機(jī)理。首先，在流動(dòng)相中添加一定量的兩親烷烴離子對(duì)試劑。若分析物為強(qiáng)堿性化合物（pKa一般大于9），通常會(huì)在流動(dòng)相中添加烷基磺酸鹽離子對(duì)試劑，如己烷磺酸鈉、庚烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等；若分析物為強(qiáng)酸性化合物（pKa一般小于2），通常流動(dòng)相中會(huì)添加四烷基銨鹽或烷烴銨鹽離子對(duì)試劑，如四丁基溴化銨、四丁基碘化銨、四丁基氫氧化銨、己胺、辛胺等。而后，C18長(zhǎng)鏈被流動(dòng)相浸潤(rùn)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的柱平衡，流動(dòng)相中離子對(duì)試劑的疏水（親脂）端，即烷基部分，與C18長(zhǎng)鏈強(qiáng)力吸引；離子（親水）端，即磺酸陰離子或氮正離子則暴露于固定相與流動(dòng)相的相界面上。當(dāng)被分析離子化合物進(jìn)入色譜柱時(shí)，強(qiáng)堿性化合物/強(qiáng)酸性化合物與相界面上的磺酸陰離子/氮正離子產(chǎn)生靜電作用，從而產(chǎn)生保留。
考慮到烷烴磺酸pKa約為1，強(qiáng)堿性化合物pKa約為9，為保證烷烴磺酸與強(qiáng)堿化合物均完全離子化，流動(dòng)相的pKa應(yīng)偏離二者的pKa至少2個(gè)單位，故在用離子對(duì)色譜法分析強(qiáng)堿性化合物時(shí)，流動(dòng)相的pH應(yīng)在3~7的范圍?？紤]到四烷基銨鹽或烷烴銨鹽pKa約為10，強(qiáng)酸性化合物pKa約為2，同理可得，當(dāng)在用離子對(duì)色譜法分析強(qiáng)酸性化合物時(shí)，流動(dòng)相的pH應(yīng)在4~8的范圍。如若要同時(shí)兼顧流動(dòng)相的緩沖能力，可選的緩沖鹽有磷酸鹽（pKa3.2&7.2）、甲酸鹽（pKa3.8）、乙酸鹽（pKa4.7）。如若要在同一個(gè)分析方法中同時(shí)實(shí)現(xiàn)強(qiáng)酸與強(qiáng)堿化合物的保留時(shí)，可在流動(dòng)相中同時(shí)添加烷基磺酸鹽離子對(duì)試劑以及四烷基銨鹽或烷烴銨鹽離子對(duì)試劑，同時(shí)維持流動(dòng)相的pH在4~7即可。
需指出，離子對(duì)試劑中親脂的疏水端與C18長(zhǎng)鏈的“吸附”往往是不可逆的，也就是說(shuō)離子對(duì)試劑對(duì)色譜柱的改性難以避免的。“專柱專用”是避免離子對(duì)色譜法難以重現(xiàn)的有效辦法。
圖1 離子對(duì)試劑增加質(zhì)子化堿性化合物保留因子的機(jī)理
圖2 離液陰離子增加質(zhì)子化堿性化合物保留因子可能的機(jī)理
在開(kāi)始闡述離液試劑的可能作用機(jī)理之前，需指明我們平常說(shuō)的離液試劑一般為親脂性的無(wú)機(jī)陰離子，其僅對(duì)堿性化合物的保留有增益。根據(jù)范特霍夫（Franz Hofmeister）理論[1]，離液型離子（英文名為Breaker/Chaotrope）有氯離子、硝酸根離子、三氟乙酸跟離子、四氟硼酸根離子、高氯酸根離子、六氟磷酸根離子等。上述離子離液序列依次為：氯離子＜硝酸根離子＜三氟乙酸跟離子＜四氟硼酸根離子＜高氯酸根離子＜六氟磷酸根離子。隨著范特霍夫離液序列的增加，等當(dāng)量的離液陰離子擾亂流動(dòng)相中水-水、水-甲醇或水-四平呋喃之間氫鍵的能力增加，破壞堿性質(zhì)子化分析物的溶劑化分子層的能力增強(qiáng)。
圖2為RP-HPLC中離液試劑的可能作用機(jī)理。使用離液劑進(jìn)行堿性質(zhì)子化合物分析時(shí)，首先在流動(dòng)相中添加一定濃度的離液鹽試劑，常用的有三氟乙酸跟離子、四氟硼酸根離子、高氯酸根離子以及六氟磷酸根離子。隨著色譜柱的平衡，疏水C18表面會(huì)富集形成親脂的有機(jī)相層（如甲醇、乙腈、四氫呋喃）。隨后親脂的離液陰離子會(huì)在有幾層相界面富集，形成具有陽(yáng)離子交換性質(zhì)的“偽固定相”層。當(dāng)被分析的堿性質(zhì)子化合物進(jìn)入色譜柱時(shí)，離液陰離子會(huì)破壞分析物的溶劑化分子層，通過(guò)靜電作用，形成“堿質(zhì)子化合物-離液陰離子”中性化合物。從而產(chǎn)生或增強(qiáng)保留。
下面，將結(jié)合幾個(gè)案例來(lái)進(jìn)行說(shuō)明。
嘗試用不同摩爾濃度的六氟磷酸根進(jìn)行鹽酸多佐胺的分析時(shí)[2]，發(fā)現(xiàn)隨著六氟磷酸根濃度的增加行鹽酸多佐胺的保留時(shí)間顯著增加，且鹽酸多佐胺的對(duì)稱性及理論板數(shù)也同步增加，如圖3所示。
圖3 不同濃度六氟磷酸根對(duì)鹽酸多佐胺保留、對(duì)稱性及理論板數(shù)的影響
嘗試用含50mM六氟磷酸根的酸性流動(dòng)相，對(duì)6種堿性毒性生物胺進(jìn)行反相分離[3]，六種質(zhì)子化毒性生物胺均得到了有效保留，且實(shí)現(xiàn)了良好的RP-HPLC分離，如圖4所示。
圖4 含50mM六氟磷酸根的酸性流動(dòng)相體系下，6種毒性生物胺的保留及分離情況
以上，筆者根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及個(gè)人見(jiàn)解，分析了離子對(duì)試劑與離液劑試劑在作為添加劑時(shí)對(duì)化合物保留的機(jī)制。根據(jù)相關(guān)案例，可以得出相較與離子對(duì)試劑，離液劑的添加不會(huì)造成色譜柱的改性。隨著離液劑濃度的增加，目標(biāo)堿性質(zhì)子化合物的保留隨之增加，但需指出當(dāng)離液劑達(dá)到一個(gè)臨界濃度時(shí)，對(duì)于保留因子k不會(huì)再有增益。此外，離液劑可以讓極弱疏水性堿性質(zhì)子化合物在常規(guī)C18上產(chǎn)生保留，如案例2所示（Histamine: LogD(pH5.5) = -4.20，2-Phenylethylamine: LogD(pH5.5) = -1.52, Tyramine: LogD(pH5.5)=-2.5, Octopamine: LogD(pH5.5) = -3.45, Tryptamine: ACD/LogD(pH5.5) = -1.42，Serotonin: LogD(pH5.5) = -2.49)。個(gè)人看法，若有紕漏之處，望同行指正。
參考文獻(xiàn)
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