注射用微球無菌檢查既要關(guān)注“球外無菌”又要關(guān)注“球內(nèi)無菌”，而檢測的難點(diǎn)是“球內(nèi)無菌”，即微球內(nèi)部的無菌性檢查。該研究在調(diào)研注射用微球生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)上，選擇代表性品種，模擬潛在微生物污染物存在條件下的微球溶解過程，建立了2種內(nèi)部無菌檢查方法：一是采用二甲基亞砜(DMSO) 溶解微球；二是采用pH 10.0緩沖液溶解微球。2種方法制備的無菌檢查供試液均以細(xì)菌耐受性芽孢作為試驗(yàn)菌，采用直接接種法進(jìn)行無菌檢查，并探討供試液制備、試驗(yàn)用菌株、方法適用性等關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)的科學(xué)性和合理性。該研究是注射用微球無菌檢查方法開發(fā)和驗(yàn)證策略的有益探索，可為此類藥物制劑的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)提高提供研究思路和數(shù)據(jù)支撐。
隨著制藥工業(yè)的發(fā)展，為適應(yīng)疾病的治療或預(yù)防需要而采用的藥物劑型層出不窮[1—2]。藥物與適宜載體(生物可降解材料) 經(jīng)過一定的分散包埋技術(shù)制得的微米或納米級固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)藥物，包括微囊、微球、微晶、脂質(zhì)體和納米粒等，稱為微粒制劑，其中注射用微球是應(yīng)用最廣泛的微粒制劑之一。從國家藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站上可查詢到30余個(gè)注射用微球的進(jìn)口、國產(chǎn)品種的批準(zhǔn)文號，代表性品種有注射用醋酸亮丙瑞林微球、注射用利培酮微球、注射用醋酸奧曲肽微球、注射用全氟丁烷微球等。這些品種的質(zhì)量控制和分析方法備受關(guān)注，其中無菌檢查法的科學(xué)性和合理性是其關(guān)注的重要內(nèi)容。
關(guān)于微粒制劑的質(zhì)量控制，美國藥典(USP42)<71>、歐洲藥典(EP 11.0)<2.6.1>、日本藥典(JP18)<4.06> 等均未單獨(dú)收載通用性技術(shù)要求的章節(jié)，僅在制劑通則中對處方設(shè)計(jì)和制備工藝進(jìn)行了介紹性說明，未涉及微生物檢查方法的特殊規(guī)定；美國注射劑協(xié)會(PDA) 技術(shù)報(bào)告、人用藥品技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)理事會(ICH) 指導(dǎo)原則中也未涉及相關(guān)規(guī)范性要求；《中華人民共和國藥典》2010 年版(ChP2010) 附錄首次收載《微球、微囊和脂質(zhì)體制劑指導(dǎo)原則》，ChP 2015 修訂為《微粒制劑指導(dǎo)原則》(通則9014)，一直沿用至ChP 2020。通則9014 中對于藥物載體類型、常用輔料載體和質(zhì)量控制的檢查項(xiàng)目等進(jìn)行了規(guī)定，但未對微生物質(zhì)量控制提出明確的技術(shù)要求[3]。
目前，注射用微球品種標(biāo)準(zhǔn)中無菌項(xiàng)下規(guī)定主要分為3類。
①指向通則，未規(guī)定具體操作方法，如：取本品，加所附的助懸劑制成混懸液，依照無菌檢查法進(jìn)行檢查，應(yīng)符合規(guī)定。
②指向通則，規(guī)定了具體操作方法，如：取本品，每支按說明書，用所附的注射器和針頭，加入所附的溶劑使分散均勻，采用直接接種法，取每支全量接種至培養(yǎng)基50 ml中，以金黃色葡萄球菌為陽性對照，依照無菌檢查法進(jìn)行檢查，應(yīng)符合規(guī)定。
③規(guī)定分別進(jìn)行微球內(nèi)部和外部的無菌性檢查，如：取本品，分別溶解于相應(yīng)培養(yǎng)基2 ml 中，過濾，以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌，進(jìn)行外部無菌檢查；取本品，分別溶解于無菌二甲基亞砜(DMSO)2 ml 中，過濾，且每膜過濾體積不超過10 ml，以金黃色葡萄球菌為陽性對照菌，進(jìn)行內(nèi)部無菌檢查。
注射用微球無菌檢查的難點(diǎn)聚焦在“球內(nèi)無菌”，即微球內(nèi)部的無菌性檢查[4]。一般而言，產(chǎn)品采用終端滅菌工藝，且粒度分布小于微生物污染物，生產(chǎn)工藝過程中微生物不易存在或不易存在于制劑內(nèi)部的，進(jìn)行微球外部無菌性檢查；產(chǎn)品采用無菌生產(chǎn)工藝，但粒度分布大于或類似于微生物污染物，在生產(chǎn)過程可能存在潛在污染風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，應(yīng)分別進(jìn)行微球內(nèi)部和外部的無菌性檢查。
經(jīng)調(diào)研，大部分注射用微球采用無菌生產(chǎn)工藝，以聚乳酸- 羥基乙酸共聚物(PLGA) 作為輔料[5—6]，與原料混合后，在密閉系統(tǒng)中包裹形成制劑，生產(chǎn)過程涉及二氯甲烷、乙酸等有機(jī)溶劑[7]，這種條件不利于微生物的生長和存活，但存在耐受性芽孢的污染風(fēng)險(xiǎn)。代表性品種( 如注射用醋酸奧曲肽微球等) 在進(jìn)行微球內(nèi)部無菌檢查時(shí)，采用DMSO 作為溶劑制備供試液，但高濃度DMSO 具有抑菌作用，是否影響無菌檢查方法的適用性和有效性尚待評估。此外，在某些品種( 如注射用利培酮微球) 的方法建立過程中，曾對其生產(chǎn)工藝各環(huán)節(jié)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估，認(rèn)為涉及的無菌操作均在微球硬化之后，潛在的污染物僅可能存在于外表面，故在標(biāo)準(zhǔn)變更時(shí)取消了內(nèi)部無菌檢查。上述評估的規(guī)范性如何在藥品標(biāo)準(zhǔn)中進(jìn)行通用性技術(shù)規(guī)定，尚未進(jìn)行深入探討。
本研究選擇注射用醋酸亮丙瑞林微球、注射用利培酮微球、注射用醋酸奧曲肽微球等國內(nèi)外代表性品種，聚焦微球內(nèi)部的無菌性檢查，考察供試液制備、試驗(yàn)用菌株、檢查方法等關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)的科學(xué)性和合理性，以期為注射用微球無菌檢查方法的建立和藥品標(biāo)準(zhǔn)的制定和修訂提供研究思路和數(shù)據(jù)支撐。
1、儀器與試藥
Phenom Nano 型掃描電鏡( 荷蘭Phenom 公司) ；Supro150 型濺射儀[ 復(fù)納科學(xué)儀器(上海) 有限公司] ；MIR254型恒溫培養(yǎng)箱(日本Panasonic 公司) ；FOM4/9 型高壓蒸汽滅菌器(意大利Fedegari 公司) ；Steritest Equinox 型集菌儀和Milliflex 型薄膜過濾系統(tǒng)均購自德國Merck-Millipore公司。
注射用醋酸亮丙瑞林微球(上海麗珠制藥有限公司)、注射用利培酮微球(瑞士Janssen-Cilag 公司)、注射用奧曲肽微球(瑞士Novartis Pharma Schweiz 公司) 和注射用全氟丁烷微球(美國GE HealthCare AS 公司)，上述產(chǎn)品均在有效期內(nèi)。
硫乙醇酸鹽流體(FTM) 培養(yǎng)基(批號VM859391903)、胰酪大豆胨液體(TSB) 培養(yǎng)基(批號VM884759920) 和胰酪大豆胨瓊脂(TSA) 培養(yǎng)基(批號VM873358915) 均購于德國Merck Millipore 公司；沙氏葡萄糖液體(SDB) 培養(yǎng)基(英國Oxoid 公司，批號2202463)；沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)培養(yǎng)基(批號1086835) 和pH 7.0 無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液(批號1086984) 均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；0.1％無菌蛋白胨水溶液(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號20200812)；DMSO(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20131225)；其他試劑均為分析純，水為滅菌純化水。
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)[CMCC(B)63202]、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941]、白念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC( F)98003] 等無菌檢查用標(biāo)準(zhǔn)菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。
2、方法與結(jié)果
2.1試驗(yàn)菌液的制備
參照ChP 2020 無菌檢查法(通則1101)，制備大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉和生孢梭菌的試驗(yàn)菌液；參照ChP 2020 抗生素微生物檢定法(通則1201)，制備枯草芽孢桿菌芽孢和短小芽孢桿菌芽孢的試驗(yàn)菌液。分別用pH 7.0 無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液制成每1 ml 含菌數(shù)為108 cfu 和不大于100 cfu的菌懸液。
2.2供試液的制備
DMSO 供試液：取注射用微球粉末(裝量約為每瓶30 mg)，每瓶加入DMSO 溶液2 ml，混勻。另取樣品，分別加入10％ DMSO、25％ DMSO、50％ DMSO、75％ DMSO 溶液，均無法溶解形成均一的供試液。根據(jù)ChP 2020 通則1101 關(guān)于供試液接種比例不大于培養(yǎng)基體積10％的規(guī)定，后續(xù)試驗(yàn)中分別采用100％ DMSO( 高濃度)、10％DMSO 溶液(低濃度)，考察溶劑對試驗(yàn)菌生長的影響。
水溶性供試液：精密稱取氯化銨2.7 g，置500 ml量瓶中， 用水450 ml 溶解， 量取三乙胺6.0 ml加入瓶中，混勻，用水定容，用三乙胺調(diào)至pH10.0±0.1，制成pH 10.0 緩沖液，滅菌[8]。取注射用微球粉末(裝量約為每瓶30 mg)，轉(zhuǎn)移至含上述滅菌緩沖液25 ml 的玻璃瓶中，密封，置45 ℃、120 r/min 的恒溫?fù)u床，至微球完全溶解。
2.3方法適用性試驗(yàn)
參照ChP 2020 無菌檢查法(通則1101) 配制相應(yīng)培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)基的適用性和靈敏度檢查，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。方法適用性試驗(yàn)的設(shè)置共分為3組，其中空白對照組用于判定試驗(yàn)方法體系是否正常，溶劑組用于判定溶劑對試驗(yàn)方法是否有干擾，試驗(yàn)組用于判定試驗(yàn)方法是否符合規(guī)定。
試驗(yàn)組：取注射用微球，加入相應(yīng)溶劑(DMSO或pH 10.0 緩沖液)，在上述溶液中分別加入含菌量不大于100 cfu 的試驗(yàn)菌液，混勻；將含有大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌的混合溶液轉(zhuǎn)移至FTM 培養(yǎng)基50 ml 中，于33 ℃培養(yǎng)不少于5 d，將含有枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌芽孢和短小芽孢桿菌芽孢的混合溶液轉(zhuǎn)移至TSB 培養(yǎng)基50 ml 中，于23 ℃培養(yǎng)不少于5 d，觀察試驗(yàn)菌是否生長。
溶劑對照組：取相應(yīng)溶劑(DMSO 或pH 10.0緩沖液)，加入含菌量不大于100 cfu 的試驗(yàn)菌液，混勻，其他同試驗(yàn)組操作。
空白對照組：取滅菌純化水，加入含菌量不大于100 cfu 的試驗(yàn)菌液，混勻，其他同試驗(yàn)組操作。
2.4注射用微球的形態(tài)考察
分別取少量注射用微球，用小藥勺取出少許粉體或粉塊，均勻撒至石英玻璃臺上，使用一次性刻刀，反復(fù)、隨機(jī)刻切10 次；將上述粉體或粉塊均勻撒至樣品臺導(dǎo)電膠上，使用洗耳球輕吹樣品表面，清理未黏附牢固的樣品，采用濺射儀(設(shè)置濺射功率20 W，鍍金時(shí)間30 s) 處理，然后裝載入掃描電鏡(SEM) 儀，根據(jù)不同的成像比例，設(shè)置加速電壓為5 或10 kV。
分別以注射用醋酸亮丙瑞林微球、注射用利培酮微球和注射用醋酸奧曲肽微球?yàn)榭疾鞂ο螅銼EM 照片如圖1 所示。
A—注射用醋酸亮丙瑞林微球(×2000，加速電壓5 kV，比例尺30 μm) ；B—注射用利培酮微球(×2000 倍，加速電壓5 kV，
比例尺30 μm) ；C—注射用醋酸奧曲肽微球(×2 000 倍，加速電壓10 kV，比例尺30 μm) ；D—注射用醋酸亮丙瑞林微球( 剖面
圖，×5000 倍，加速電壓10 kV，比例尺10 μm) ；E—注射用利培酮微球(剖面圖，×6800 倍，加速電壓5 kV，比例尺10 μm) ；
F—注射用醋酸奧曲肽微球(剖面圖，×2000 倍，加速電壓10 kV，比例尺30 μm)。
圖1 注射用微球代表性品種的SEM 照片
結(jié)果顯示，3 種微球均為實(shí)心球體，球面直徑為30 ～ 100 μm ；其中注射用醋酸亮丙瑞林微球?yàn)榉涓C狀實(shí)心球體，球體內(nèi)孔徑為1 ～ 3 μm，球面和球內(nèi)的直徑均在微米級，與常見細(xì)菌的大小處于同數(shù)量級。雖然PLGA 是緩釋或控釋制劑的常用輔料[6]，具有生物可降解性，但在無菌檢查供試液的常規(guī)制備時(shí)間內(nèi)無法完全溶解。
2.5DMSO 溶解微球后的無菌檢查方法適用性試驗(yàn)
2.5.1 DMSO 對試驗(yàn)菌生長抑制作用考察
分別取“2.2”項(xiàng)下100％ DMSO(高濃度)、10％ DMSO 溶液(低濃度) 適量，依照ChP 2020通則1101，分別加入不大于100 cfu 的各試驗(yàn)菌懸液，混勻。將含有大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌的混合溶液轉(zhuǎn)移至FTM培養(yǎng)基50 ml 中，于33 ℃培養(yǎng)不少于5 d，將含有枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌芽孢和短小芽孢桿菌芽孢的混合溶液轉(zhuǎn)移至TSB培養(yǎng)基50 ml 中，于23 ℃培養(yǎng)不少于5 d。結(jié)果如表1所示，100％ DMSO 具有抑菌作用，藥典規(guī)定的試驗(yàn)菌(營養(yǎng)體) 均無法生長；枯草芽孢桿菌芽孢和短小芽孢桿菌芽孢可以生長。10％ DMSO 溶液無抑菌作用，ChP 2020 規(guī)定的試驗(yàn)菌(營養(yǎng)體)和耐受性芽孢均可以生長，但微球無法溶解。
注：1) 每個(gè)單元格有5 個(gè)正負(fù)號，依次顯示試驗(yàn)菌接種后d1至d5的
生長情況：“–”表示無菌生長，“+”表示有菌生長。
表1 DMSO 對試驗(yàn)菌生長的抑制作用1)
2.5.2 方法適用性試驗(yàn)
分別選擇注射用醋酸亮丙瑞林微球和注射用利培酮微球2個(gè)代表性品種，進(jìn)行微球內(nèi)部無菌檢查的方法適用性試驗(yàn)。取上述樣品，每瓶用DMSO溶液2 ml 溶解微球，以此作為供試液。供試液冷凍干燥后鏡檢，結(jié)果顯示SEM 視野下未見完整的微球形態(tài)，提示輔料已被DMSO 溶液溶解。依照ChP 2020 通則1101，在注射用微球與DMSO 溶液混合后，分別加入不大于100 cfu 的各試驗(yàn)菌懸液，混勻。將含有大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌的混合溶液轉(zhuǎn)移至FTM 培養(yǎng)基50 ml 中，于33 ℃培養(yǎng)不少于5 d，將含有枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌芽孢和短小芽孢桿菌芽孢的混合溶液轉(zhuǎn)移至TSB 培養(yǎng)基50 ml，于23 ℃培養(yǎng)不少于5 d，作為試驗(yàn)組；同時(shí)，以滅菌純化水作為空白對照組、100％ DMSO 作為試劑對照組，同法操作。結(jié)果如表2所示。
表2 DMSO 溶解注射用微球無菌檢查方法的適用性試驗(yàn)結(jié)果1)
100％ DMSO 可溶解上述2個(gè)品種的注射用微球，但“2.5.1”項(xiàng)下結(jié)果顯示100％ DMSO 對于藥典規(guī)定的試驗(yàn)菌(營養(yǎng)體) 的生長均具有抑制作用，因此可選擇枯草芽孢桿菌芽孢和短小芽孢桿菌芽孢作為試驗(yàn)菌，進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。10％ DMSO溶液雖然未見對于藥典規(guī)定的試驗(yàn)菌(營養(yǎng)體) 的生長抑制作用，但其無法溶解微球制成供試液。結(jié)果提示，以上2個(gè)注射用微球代表性品種的內(nèi)部無菌性檢查可采用100％DMSO作為溶劑制備供試液，結(jié)合生產(chǎn)工藝過程中潛在污染的風(fēng)險(xiǎn)評估，以耐受性芽孢作為試驗(yàn)菌，進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。
2.6水溶性緩沖液溶解微球后的無菌檢查方法適用性試驗(yàn)
根據(jù)注射劑的應(yīng)用情況，無菌檢查一般制備水溶性供試液，通過薄膜過濾法進(jìn)行無菌性檢查。DMSO 為有機(jī)溶劑，且對營養(yǎng)體狀態(tài)的試驗(yàn)菌的生長具有抑制作用，為尋求水溶性的“破球”方法，通過模擬注射用微球的體外釋放度，制備水溶性供試液。由于PLGA 輔料的酯鍵斷裂后產(chǎn)酸，調(diào)節(jié)緩沖體系pH 值至堿性，可加速輔料降解[8—9]。
2.6.1 pH 10.0 緩沖液對試驗(yàn)菌生長抑制作用的考察
取“2.2”項(xiàng)下pH 10.0 緩沖液適量，依照ChP2020 通則1101，分別加入不大于100 cfu 的各試驗(yàn)菌，混勻。將含有大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌的混合溶液轉(zhuǎn)移至FTM培養(yǎng)基50 ml 中，于33 ℃培養(yǎng)不少于5 d ；將含有枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌芽孢和短小芽孢桿菌芽孢的混合溶液轉(zhuǎn)移至TSB培養(yǎng)基50 ml 中，于23 ℃培養(yǎng)不少于5 d。同時(shí)，為確證pH 10.0 緩沖液中試驗(yàn)菌株的穩(wěn)定性，另取適量pH 10.0 緩沖液，加入試驗(yàn)菌后，置45 ℃、120 r/min 的恒溫?fù)u床中孵育4 ～ 6 h，然后分別轉(zhuǎn)移至不同培養(yǎng)基，觀察菌株生長情況。將上述采用新鮮配制pH 10.0 緩沖液的試驗(yàn)組作為溶劑試驗(yàn)組1，采用經(jīng)孵育4 ～ 6 h 的pH 10.0 緩沖液的試驗(yàn)組作為溶劑試驗(yàn)組2。
表3 pH 10.0 緩沖溶液對試驗(yàn)菌生長的抑制作用1)
結(jié)果如表3所示，依照ChP 2020 通則1101 的試驗(yàn)步驟，pH 10.0 緩沖液對藥典規(guī)定的試驗(yàn)菌(營養(yǎng)體)、枯草芽孢桿菌芽孢和短小芽孢桿菌芽孢的生長均無影響；但當(dāng)溫度升高、振蕩增加、緩沖液經(jīng)孵育處理時(shí)，試驗(yàn)菌株的生長狀態(tài)不穩(wěn)定，僅耐受性芽孢可以生長。
2.6.2 方法適用性試驗(yàn)
分別選擇注射用醋酸亮丙瑞林微球和注射用奧曲肽微球2 個(gè)代表性品種，進(jìn)行無菌檢查方法適用性試驗(yàn)。取上述樣品，每瓶轉(zhuǎn)移至含pH 10.0 緩沖液25 ml 的玻璃瓶中，于45 ℃、120 r/min 密封無菌狀態(tài)下孵育4 ～ 6 h，獲得供試液(同時(shí)以pH 4.0、pH 7.0 緩沖液作為對照，相同條件下微球均無法溶解，加速釋放行為與相關(guān)研究結(jié)果一致[9])。供試液冷凍干燥后鏡檢，SEM 視野下未見完整的微球形態(tài)，提示輔料能夠在此條件下加速降解。
依照ChP 2020 通則1101，在注射用微球與pH10.0 緩沖液混合后，分別加入不大于100 cfu 的各試驗(yàn)菌懸液，混勻，在上述條件下孵育至微球完全溶解。將含有大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和生孢梭菌的混合溶液轉(zhuǎn)移至FTM 培養(yǎng)基225 ml 中，于33 ℃培養(yǎng)不少于5 d ；將含有枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌芽孢和短小芽孢桿菌芽孢的混合溶液轉(zhuǎn)移至TSB 培養(yǎng)基225 ml 中，于23 ℃培養(yǎng)不少于5 d，作為試驗(yàn)組；同時(shí)，以滅菌純化水作為空白對照組、以pH 10.0緩沖液作為試劑對照組，同法操作。
表4 pH 10.0 緩沖液溶解注射用微球代表性品種后無菌檢查方法的適用性試驗(yàn)結(jié)果1)
結(jié)果如表4 所示，上述2個(gè)品種的注射用微球在45 ℃、pH 10.0 堿性環(huán)境下振蕩孵育，輔料可加速降解以制備供試液進(jìn)行無菌檢查，由于此條件下藥典規(guī)定的試驗(yàn)菌(營養(yǎng)體) 生長狀態(tài)不穩(wěn)定，且由于生孢梭菌為嚴(yán)格厭氧菌，在有氧環(huán)境下無法生長(見表4 空白對照組)，因此可選擇枯草芽孢桿菌芽孢和短小芽孢桿菌芽孢作為試驗(yàn)菌，進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。
3、討論
本研究在調(diào)研注射用微球生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品注冊申報(bào)資料的基礎(chǔ)上，選擇注射用醋酸亮丙瑞林微球等代表性品種，建立了2 種無菌檢查方法：一是采用DMSO 溶解微球；二是采用pH 10.0 水溶性緩沖液加速輔料降解后溶解微球。制備的無菌檢查供試液依照ChP 2020 通則1101，以枯草芽孢桿菌芽孢或短小芽孢桿菌芽孢作為試驗(yàn)菌，采用直接接種法進(jìn)行無菌檢查。
基于注射用微球的特點(diǎn)，該制劑無菌檢查主要關(guān)注以下技術(shù)環(huán)節(jié)。
①在充分了解產(chǎn)品生產(chǎn)工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、過程控制中微生物污染關(guān)鍵環(huán)節(jié)的基礎(chǔ)上，經(jīng)方法驗(yàn)證及相關(guān)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)后，建立無菌檢查方法；例如，目前絕大部分注射用微球產(chǎn)品采用無菌生產(chǎn)工藝，微球內(nèi)部不易有微生物營養(yǎng)體存活，可采用枯草芽孢桿菌芽孢或短小芽孢桿菌芽孢作為試驗(yàn)菌，或根據(jù)產(chǎn)品生產(chǎn)工藝中潛在污染物的風(fēng)險(xiǎn)評估，采用其他耐受性芽孢作為試驗(yàn)菌進(jìn)行方法驗(yàn)證。
②對于有必要進(jìn)行內(nèi)部無菌檢查的品種，應(yīng)選擇適宜的溶劑制備供試液，模擬潛在微生物污染物存在條件下的微球溶解過程，并對溶劑是否影響試驗(yàn)菌生長進(jìn)行考察；例如，采用DMSO溶解，或采用堿性(pH 10.0) 緩沖體系使輔料加速降解制備供試液，均是對特殊無菌制劑建立無菌檢查方法的有益嘗試。
③由于PLGA 單體比例不同，形成制劑時(shí)聚合物的降解時(shí)間、藥物黏度、藥物釋放行為等均不相同[10—11]，故不同品種在建立無菌檢查方法時(shí)，需要分別對具體試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證或確認(rèn)。此外，微球骨架降解行為的目測判斷并不充分，如某些品種，在一定的加速釋放介質(zhì)中發(fā)生“溶蝕”現(xiàn)象，雖然輔料載體未完全溶解(或降解)，但微球由“光滑球面”逐漸變?yōu)?ldquo;蜂窩狀多孔縫隙球面”，因此，必要時(shí)可借助SEM 進(jìn)行形態(tài)觀察、含量測定等方法，佐證無菌檢查方法的開發(fā)或驗(yàn)證策略[12—13]。
注射用微球的生產(chǎn)工藝個(gè)性化，且相對常見注射劑，仍屬于小眾的特殊劑型。本研究選擇注射用醋酸亮丙瑞林微球、注射用利培酮微球、注射用醋酸奧曲肽微球等代表性品種進(jìn)行研究，基本覆蓋了目前研發(fā)和上市的品種。除本研究研究的品種外，還存在特殊生產(chǎn)工藝下的劑型，如注射用全氟丁烷微球，該制劑為空心微球，根據(jù)該產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所述，可采用魯爾接頭通過單向加壓方式破壞微球結(jié)構(gòu)后制備供試液，進(jìn)行外部和內(nèi)部的整體無菌性檢查。
根據(jù)ChP 2020 通則1101 有關(guān)規(guī)定，品種性狀允許，應(yīng)優(yōu)先選擇薄膜過濾法進(jìn)行無菌檢查。由于DMSO 對混合纖維素、聚偏氟乙烯等材質(zhì)的無菌檢查用濾膜具有腐蝕性，pH 10.0 緩沖液對濾膜完整性是否存在影響仍需評估，故本研究在建立無菌檢查方法時(shí)，采用直接接種法。其他品種在進(jìn)行無菌檢查時(shí)，是否能夠采用薄膜過濾法，仍需進(jìn)行濾膜完整性影響因素考察。
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本文作者馮震、肖珊珊、陳輝、李靜敏、唐黎明、楊美成，上海市食品藥品檢驗(yàn)研究院、上海麗珠制藥有限公司，來源于中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，僅供交流學(xué)習(xí)。
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