這可以從兩方面考慮，首先是在硬件條件下，因為在過去幾十年中，LC-MS或者LC-MS/MS已經(jīng)成為小分子樣品分析的標(biāo)準(zhǔn)檢測手段，作為一種混合型分析儀器，LC-MS需要滿足其兩個組成部分的要求，首先液相色譜部分是用來分析液態(tài)樣品的，流動相從溶劑瓶中流出經(jīng)過高效液相色譜泵和進樣閥，再進入色譜柱這是一個很長和精細(xì)的系統(tǒng)，所以要求進入色譜系統(tǒng)的樣品必須是液態(tài)的，更重要的是沒有顆粒，如果樣品不是液態(tài)的，比如為組織樣品和全血樣品等，則需要處理成轉(zhuǎn)換為液態(tài)，其次質(zhì)譜部分是通過將液態(tài)轉(zhuǎn)換為氣態(tài)離子，并且在高真空條件下檢測，以目前最常用的電噴霧離子化（ESI）和大氣壓化學(xué)離子化(APCI)兩種離子源為例，為了確保有良好的離子化效率，要求進入的液態(tài)樣品不能含有非揮發(fā)性酸堿或者鹽。
另一方面是從我們要分析的樣品特點出發(fā)，一個是樣品太“臟”，這里的“臟”是指樣品包含很多與目標(biāo)物無關(guān)的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)，細(xì)胞，鹽類等，這些都不能直接進到LC-MS進行分析，比如蛋白質(zhì)，在未經(jīng)預(yù)處理時會在柱頭析出導(dǎo)致色譜柱柱效迅速降低；同時“臟”還指樣品中存在導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)的物質(zhì)，在質(zhì)譜離子化的過程中基質(zhì)成分會對目標(biāo)物的離子化產(chǎn)生干擾（離子增強或者離子抑制），導(dǎo)致檢測信號增大或者減小使得檢測結(jié)果產(chǎn)生偏差。另外一個特定就是樣品的濃度過低，或者低于目前擁有檢測儀器的檢測限，導(dǎo)致不能對樣品進行檢測分析，所以需要對樣品進行預(yù)處理進行富集（預(yù)濃縮樣品），最后就是樣品的穩(wěn)定性，有些目標(biāo)物易被氧化，還原或者降解，所以預(yù)處理需要考慮這個因素，加入保護劑避免在分析過程中目標(biāo)分析物的轉(zhuǎn)化分解。
所以樣品預(yù)處理也是生物分析中過程中最關(guān)鍵的并且也是耗時最長的步驟之一，一個成功的分析方法不僅需要達到樣品預(yù)處理的目的，而且還要保證分析物的完整性或者說穩(wěn)定性。
2. 生物樣品預(yù)處理的方法有那些？各有什么特點？
常用的方法主要有以下五種，①稀釋法②蛋白質(zhì)沉淀法(PPT)③液-液萃取法（LLE）④固相萃取法(SPE)⑤免疫親和萃取法。
① 稀釋法
稀釋是最簡單的樣品預(yù)處理技術(shù)，也常被稱為“稀釋和進樣”，這也是一種兼容性很強的方法，幾乎所有分析物均有100%的回收率，缺點是沒有選擇性，使用該方法時，樣品只需要用LC-MS兼容的溶劑稀釋，但是樣品中所有組分都會進入LC-MS系統(tǒng)。稀釋法只適用于基質(zhì)效應(yīng)不大且不存在靈敏度問題的情形下，如不含有或者僅含有很少大分子的簡單液體基質(zhì)（尿液，淚液，腦脊液等），不適用于含有蛋白質(zhì)或者脂質(zhì)的復(fù)雜生物分析。
優(yōu)點：樣品處理的操作少，回收率100%，耗時和成本低。
缺點：樣品稀釋后信號顯著下降，不適應(yīng)于原本濃度較低的樣品，基質(zhì)效應(yīng)比較明顯。
② 蛋白質(zhì)沉淀法
由于生物樣本中血漿和血清是最為常見的類型，其含有豐富的可溶性蛋白，需要更復(fù)雜的預(yù)處理，而通過加入有機溶劑，酸堿鹽等溶劑可以有效的沉淀去除生物樣品中大部分的蛋白質(zhì)的過程被稱為蛋白沉淀法，因此蛋白沉淀是目前生物分析中應(yīng)用最多的預(yù)處理方法。
優(yōu)點：幾乎適用于任何極性的小分子化合物，快速（適用于自動化和半自動化操作），回收率100%。
缺點：PPT處理后的樣品含有全部的內(nèi)源性小分子（無選擇性），質(zhì)譜離子化可能受到干擾產(chǎn)生明顯基質(zhì)效應(yīng)。
③ 液-液萃取法
液-液萃取（LLE）是生物分析中另一種常見的樣品預(yù)處理技術(shù)，LLE的原理是基于目標(biāo)分析物在互不相溶的溶劑之間的脂水分配系數(shù)（LogP）不同，將化合物從水相萃取到與水不相溶的有機相中（對于離子型的化合物可以通過調(diào)節(jié)PH或離子強度至合適范圍使之形成分子態(tài)），常用的有機溶劑有甲基叔丁基醚（MTBE）,乙酸乙酯，正己烷，1-氯代正丁烷等。通過LLE可以有效的將目標(biāo)化合物從水相萃取到有機溶劑中，而將大部分基質(zhì)組分（如磷脂，蛋白質(zhì)，無機鹽等）留在水相中，提取的樣品更加干凈和簡單，因此LLE相比PPT是一種選擇性更強的樣品預(yù)處理技術(shù)。
優(yōu)點：LLE非常適用于非極性至中等極性的分析物，可以起到富集濃縮效果，能降低基質(zhì)效應(yīng)，成本低，方法易轉(zhuǎn)移，開發(fā)時間較短。
缺點：不適用于親水極性物質(zhì)，操作中易污染，耗時較長。
④ 固相萃取法(SPE)
固相萃取是將生物樣品上樣至鍵合固定相吸附劑的SPE小柱/提取板/提取柱上，目標(biāo)分析物通過不同的作用機制與鍵合相發(fā)生相互作用后被保留，干擾基質(zhì)可能在上樣的過程中直接流過吸附劑，在淋洗時被洗脫或者仍然保留在固定相中，而目標(biāo)化合物則被保留在固定相中，選用合適的洗脫液洗脫出來后，進行LC-MS分析。根據(jù)填料的不同，SPE主要分為三種類型，反相SPE;正相SPE和離子交換SPE（還有基于以上模式的混合型SPE），通常固相萃取法(SPE)適用于目標(biāo)物濃度很低的痕量樣品，基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重或者目標(biāo)物化合物難于分離的生物樣品。
優(yōu)點：適用于極性到非極性多種類型化合物，可自動化操作，可富集痕量樣品分析。
缺點：操作繁瑣，耗時長，成本高，需要豐富的操作技巧和分離科學(xué)知識。
⑤ 免疫親和萃取法（IA-SPE）
免疫吸附劑是將分析物專屬抗體固定于固相載體的一種選擇性提取材料。當(dāng)免疫吸附劑暴露于含有目標(biāo)分析物(抗原)的樣品中時,分析物和固定的抗體之間會發(fā)生具選擇性的可逆的抗原-抗體結(jié)合。利用免疫吸附劑提取目標(biāo)分析物的方法稱為免疫親和(IA)提取.將免疫吸附劑填充于 SPE提取板或小柱上進行樣品預(yù)處理的方法稱IA-SPE, 免疫提取SPE 的操作步驟可分為4步:活化、樣品滲透、淋洗和洗脫。
活化:活化這一步是為了建立適合分析物和抗體作用的環(huán)境。免疫吸附劑一般儲存于含有少量疊氮化物的磷酸緩沖液(PBS)中,以保持抗體活性?？梢允褂媚苁鼓繕?biāo)分析物和抗體發(fā)生相互作用的溶液換該緩沖液.
上樣:將預(yù)處理后的生物樣品上樣或者和免疫吸附劑一起溫孵。這一步必須充分考慮免疫吸附劑的容量以避免吸附劑過載。
淋洗:這一步是為了除去通過特異性吸附（NSB）于吸附劑上的干擾化合物,這些NSB有疏水性的和離子間的相互作用。類似常規(guī)SPE的操作,淋洗液需要有效去除干擾物質(zhì),但同時不破壞抗原-抗體的相互作用。
洗脫:任何能有效破壞分析物和抗體間作用力的溶液,如置換劑、離液劑、pH調(diào)節(jié)劑、有機溶劑等,均能用來洗脫分析物和內(nèi)標(biāo)。
優(yōu)點：是五種方法中選擇性特異性最高的，具有高靈敏度、重現(xiàn)性好，適用于具有頑固干擾和其他預(yù)處理手段不能解決的蛋白質(zhì)核酸的大分子方法開發(fā)。
缺點：操作繁瑣，耗時長，成本非常高昂。
3. 在項目的方法開發(fā)中如何選擇最佳的預(yù)處理方法？
一個科學(xué)合理的生物分析方法必須有恰當(dāng)?shù)臉悠奉A(yù)處理，其關(guān)鍵是需要了解你的需要分析的目標(biāo)物和樣品，目前擁有的實驗工具和實驗項目的需求。
首先對于目標(biāo)分析物，應(yīng)該盡可能的掌握其目標(biāo)化合物的相關(guān)理化性質(zhì)，如脂水分配系數(shù)LogP,酸堿度PKa,溶解度，蛋白質(zhì)結(jié)合率，化學(xué)穩(wěn)定性等，在實驗之前花點時間去關(guān)注這些性質(zhì)，對于選擇預(yù)處理技術(shù)的適用性和實驗條件的選擇是至關(guān)重要的。
同時不同的基質(zhì)組成（血漿，血清，全血，尿液，腦脊液和各種組織樣品）和復(fù)雜程度（基質(zhì)的PH，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)性質(zhì)和濃度，鹽的含量）都是明顯不一樣的，了解分離的基質(zhì)是選擇預(yù)處理的關(guān)鍵因素之一。
例如，在處理全血樣品時，化合物在血漿和紅細(xì)胞之間的分布，化合物在全血中的酶穩(wěn)定性，血漿蛋白結(jié)合率的差異都要考慮，當(dāng)分析物明顯存在紅細(xì)胞內(nèi)時，預(yù)處理方法就需要通過物理或者化學(xué)手段將分析物從紅細(xì)胞中釋放出來，同時還要平衡優(yōu)化帶來的溶血基質(zhì)效應(yīng)的不良結(jié)果。
對于實驗工具你需要了解其性能和選擇，根據(jù)實驗要求和檢測限選擇合適的質(zhì)譜平臺，還有許多看似不起眼的細(xì)節(jié)往往也是生物定量分析中至關(guān)重要的的步驟。
例如對于那些尿液樣品，玻璃材質(zhì)的離心管的會產(chǎn)生非特異性結(jié)合（NSB），這時候就要考慮更換為聚丙烯材質(zhì)的低吸附管來解決，移液前的樣品裝的太滿導(dǎo)致混合不均勻，所以要求液體的混合體積最好不要超過體積的二分之一，樣品處理和液體轉(zhuǎn)移時的交叉污染，移液裝置的液體殘留等，要做好操作人員的培訓(xùn)，另外也可以考慮應(yīng)用液體工作站這樣的自動化工具，同時對于復(fù)雜的分析方法要平衡好人工操作和自動化工具的利弊，人工操作成本低但是存在操作誤差和重現(xiàn)性不佳帶來的項目實驗失敗率的較高的風(fēng)險，而自動化處理具備更好的精密度，減輕重復(fù)操作給人帶來的壓力和疲勞但是成本較高，這都需要把這些因素考慮在內(nèi)。
最終的生物分析策略應(yīng)該是項目所需要的技術(shù)能力和實驗成本（時間，金錢和其他資原）之間的綜合評估的結(jié)果，例如一個不要求高靈敏度的分析項目可以通過簡單的稀釋來執(zhí)行，一次性的小實驗可以用PPT，但如果建立的分析方法用來支持多個研究項目并且樣品量大時，該方法必須非常耐用，只要最終每個樣品的分析成本可以接受，不必太在意最初方法開發(fā)和驗證時的成本。綜上，最佳的生物分析策略時滿足項目需求的最經(jīng)濟的策略。
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