工藝表征和工藝驗(yàn)證是藥物開發(fā)臨床實(shí)驗(yàn)后期需要進(jìn)行的重要工作，所處節(jié)點(diǎn)如圖1。
圖1：工藝表征和工藝驗(yàn)證在藥物研發(fā)流程中所處環(huán)節(jié)
FDA工藝指南將工藝驗(yàn)證 (Process Validation, PV) 定義為：“從工藝設(shè)計(jì)階段到商業(yè)化生產(chǎn)階段的數(shù)據(jù)收集和評(píng)估，建立科學(xué)證據(jù)表明工藝能夠始終如一地提供優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品。”FDA將工藝驗(yàn)證定義為一個(gè)連續(xù)的生命周期的過程。
工藝表征 (Process Characterization, PC) 的目標(biāo)是確保有效和成功的工藝驗(yàn)證和保證一致的工藝性能。工藝表征工作一般在臨床Ⅱ期結(jié)束后，工藝性能確認(rèn) (Process Performance Qualification, PPQ) 開始前進(jìn)行。
工藝表征的目的是系統(tǒng)性地研究工藝參數(shù)和原材料屬性對(duì)工藝表現(xiàn)的影響，同時(shí)獲得工藝參數(shù)和工藝性能/質(zhì)量屬性的可接受范圍，從而制定工藝控制策略。工藝表征實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是在藥品上市前，除臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)外，可向監(jiān)管部門提供的具備長期穩(wěn)定生產(chǎn)質(zhì)量的證據(jù)。不充分的工藝表征可能會(huì)導(dǎo)致昂貴的批生產(chǎn)失敗和事故，失敗的驗(yàn)證運(yùn)行和困難的檢查。
該如何正確地準(zhǔn)備和完成工藝表征研究呢?
基于法規(guī)解讀、行業(yè)實(shí)踐及生物工藝的可操作性，一個(gè)完整和成功的工藝表征研究主要包括工藝表征前的準(zhǔn)備工作Pre-PC和工藝表征研究PC兩個(gè)階段，共7個(gè)主要步驟組成，詳見圖2。
圖2：工藝表征過程的關(guān)鍵步驟
1、信息收集
生產(chǎn)工藝是在工藝開發(fā)過程中定義的，在工藝開發(fā)前需要使用工藝流程圖或魚骨圖等，對(duì)生產(chǎn)工藝包括單元操作、工藝輸入和工藝輸出進(jìn)行詳細(xì)描述。通常需要收集的數(shù)據(jù)包括：
收集臨床生產(chǎn)批次數(shù)據(jù)，確定生產(chǎn)工藝；
收集工藝開發(fā)和優(yōu)化數(shù)據(jù)；
收集產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性CQA相關(guān)信息。
2、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估
FDA的工藝驗(yàn)證指南指出，因?yàn)椴豢赡軐?duì)所有參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性研究，因此需要使用一定的工具來篩選出高風(fēng)險(xiǎn)的工藝參數(shù)，即對(duì)工藝性能和產(chǎn)品質(zhì)量屬性影響風(fēng)險(xiǎn)比較高的工藝參數(shù)。常使用的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具有：因果效應(yīng)矩陣 (C&E) 、失敗模式與效應(yīng)分析 (FMEA) 以及風(fēng)險(xiǎn)排序與過濾 (RRF) 等。
2.1風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估所處階段
工藝表征研究需要進(jìn)行兩次風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，即風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估-2和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估-3，如圖3 A-Mab中總結(jié)了生物制藥工藝生命周期內(nèi)的質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)管理的應(yīng)用。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估-2主要用于工藝表征之前，利用工具篩選出那些高風(fēng)險(xiǎn)性的工藝參數(shù)，這個(gè)過程需要考慮工藝平臺(tái)知識(shí)、文獻(xiàn)知識(shí)以及工藝開發(fā)過程中積累的知識(shí)。該階段的目的是指導(dǎo)工藝表征工作，包括確定工藝步驟的優(yōu)先級(jí)，以及篩選需要進(jìn)行工藝表征的工藝參數(shù)。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估-3是在工藝表征之后，即已經(jīng)完成了工藝表征工作，該風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估用來定義設(shè)計(jì)空間和形成控制策略草案。因此，尋找工藝中的潛在失敗模式并且制定緩解措施是該過程的主要工作。
圖3：生物制藥工藝生命周期內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估
2.2風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工具
工藝表征后的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估目的是尋找工藝失敗模式和制定緩解策略，失敗模式和效應(yīng)分析 (FMEA) 則是常用到的工具。FMEA是通過對(duì)識(shí)別的失敗模式進(jìn)行其嚴(yán)重度S、發(fā)生頻率O和可探測度D三個(gè)維度的評(píng)估。根據(jù)評(píng)分?jǐn)?shù)表對(duì)每一種失敗模式進(jìn)行打分，最終失敗模式的風(fēng)險(xiǎn)程度是三個(gè)維度的乘積，即風(fēng)險(xiǎn)順序數(shù) (RPN) =嚴(yán)重度S×發(fā)生頻率O×可探測度D。
風(fēng)險(xiǎn)分析通常先要對(duì)改進(jìn)措施進(jìn)行定義，明確現(xiàn)有的預(yù)防措施和探測措施后，可以對(duì)照FMEA評(píng)估表對(duì)S、O、D的值進(jìn)行獨(dú)立評(píng)估，根據(jù)不同的S、O、D組合，查表確定風(fēng)險(xiǎn)控制的優(yōu)先級(jí) (AP) ，進(jìn)而用于評(píng)估產(chǎn)品的可能 CQA，以及可能影響產(chǎn)品質(zhì)量的CPP。
2.3CQAs評(píng)估和pCPP、CMA評(píng)估
關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (Critical Quality Attributes, CQA) ，ICH Q8 (R2) 法規(guī)指南中定義CQA指在適宜限度、范圍和分布內(nèi)以保證藥品質(zhì)量的物理、化學(xué)、生物或微生物屬性或特性。通過風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，結(jié)合對(duì)產(chǎn)品的理解，以及相關(guān)歷史數(shù)據(jù)，評(píng)估出產(chǎn)品CQA，這是表征活動(dòng)的出發(fā)點(diǎn)。CQA主要由產(chǎn)品的QTPP概況引申而來，分別由其安全性和有效性決定。CQA的評(píng)估主要基于產(chǎn)品對(duì)患者的影響，而不是工藝的能力或歷史數(shù)據(jù)，如圖4基于QbD風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估蛋白藥物的質(zhì)量屬性。
圖4：基于QbD風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估蛋白藥物的質(zhì)量屬性
關(guān)鍵工藝參數(shù) (Critical Process Parameter, CPP) 根據(jù)ICH Q8指對(duì)關(guān)鍵質(zhì)量屬性 (CQA) 有影響的工藝變量，應(yīng)予以監(jiān)控或控制以確保藥品獲得所需的質(zhì)量。根據(jù)評(píng)估得到的CQA，進(jìn)一步采用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的方法（如FMEA、因果矩陣、流程圖、魚骨圖）從大量的工藝參數(shù)中剔除出非關(guān)鍵的工藝參數(shù)，篩選出潛在的CPP (pCPP) ，如圖5A-mab中生產(chǎn)生物反應(yīng)器中工藝參數(shù)的第一輪風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果。通過后續(xù)實(shí)驗(yàn)中研究，進(jìn)而獲得穩(wěn)健的控制策略。
圖5：A-mab中生產(chǎn)生物反應(yīng)器中工藝參數(shù)的第一輪風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果。CPP=影響質(zhì)量屬性的參數(shù) - 必需嚴(yán)格控制，穩(wěn)定性有限；WC-CPP=影響質(zhì)量屬性的參數(shù) - 良好控制，運(yùn)行穩(wěn)定；KPP=影響工藝屬性的參數(shù)；Non-KPP=不影響QA或PA的參數(shù)
3、建立和確認(rèn)縮小模型
在生產(chǎn)規(guī)模上對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行研究型工作是不現(xiàn)實(shí)的，因此需要設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的模型來代表生產(chǎn)規(guī)模是非常必要的，即縮小模型。
3.1細(xì)胞培養(yǎng)縮小模型的建立原則
在細(xì)胞培養(yǎng)縮小模型的建立過程中與細(xì)胞放大原則一致，一般來說非體積依賴性參數(shù)保持一致（如pH值、溫度、補(bǔ)料策略等）；對(duì)于體積依賴參數(shù)，通常采用等P/V或等葉尖速度，從而保證攪拌效果一致；或者保持O2、CO2的Kla與商業(yè)化生產(chǎn)保持一致，以保證氧氣傳質(zhì)和CO2移除效率一致。
3.2縮小模型的多變量分析和等效性確認(rèn)
法規(guī)指南對(duì)縮小模型的唯一要求是，縮小模型需要能夠代表商業(yè)化生產(chǎn)工藝。即需要對(duì)縮小模型進(jìn)行確認(rèn)，縮小模型的確認(rèn)可以在大規(guī)模生產(chǎn)使用的操作范圍的中心點(diǎn)上來運(yùn)行，需要確認(rèn)縮小模型與大規(guī)模生產(chǎn)運(yùn)行的性能一致，并且需要一個(gè)縮小模型確認(rèn)的可接受標(biāo)準(zhǔn)?？s小模型的驗(yàn)證，通常采用統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)的驗(yàn)證方法，比如T檢驗(yàn)、雙單側(cè)檢驗(yàn)TOST、主成分分析PCA和多變量分析PLS等。
對(duì)建立的縮小模型，需要與生產(chǎn)批數(shù)據(jù)進(jìn)行過程代謝，產(chǎn)品質(zhì)量等方面進(jìn)行可比性研究，確認(rèn)縮小模型可代替商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模。上游案例是通過9批商業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模數(shù)據(jù)（圖6虛線），經(jīng)SIMCA軟件（PLS分析模型）處理，建立±3SD或者95%置信區(qū)間，細(xì)胞培養(yǎng)過程代謝參數(shù)，產(chǎn)品質(zhì)量數(shù)據(jù)和過程數(shù)據(jù)均處于該區(qū)間內(nèi)，則證明縮小模型可比（圖7）。即該縮小模型可代替商業(yè)化規(guī)模，用于PC研究。
圖6：上-不同天數(shù)細(xì)胞代謝曲線得分圖 (SIMCA) ；下-預(yù)測六批次的縮小模型數(shù)據(jù) (SIMAC)
4、工藝表征研究
工藝表征研究，從根本上是要解決兩個(gè)問題：
工藝參數(shù)的分類，即哪些是關(guān)鍵工藝參數(shù) (CPPs) ，哪些是非關(guān)鍵工藝參數(shù) (Non-CPPs) ；
關(guān)鍵工藝參數(shù)的設(shè)計(jì)空間范圍，也就是關(guān)鍵工藝參數(shù)必須要控制在什么范圍內(nèi)，才能保證關(guān)鍵質(zhì)量屬性的可接受范圍；
除此之外，工藝表征研究還需要考慮到雜質(zhì)清除的研究（包括挑戰(zhàn)性實(shí)驗(yàn)），關(guān)鍵原材料的研究以及單元操作之間的鏈接研究。
對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)階段，如細(xì)胞復(fù)蘇、傳代、擴(kuò)增、N-1和生產(chǎn)階段，通常在縮小模型上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以研究高風(fēng)險(xiǎn)的工藝參數(shù)對(duì)工藝性能和產(chǎn)品質(zhì)量的影響，常用的實(shí)驗(yàn)類型包括單因素 (OFAT) 、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) (DoE) 、最差條件研究 (Worst case) 或N-1連接 (Linkage) 等的研究。
4.1單因素實(shí)驗(yàn)OFAT
單因素實(shí)驗(yàn)，也稱為一次一個(gè)因子 (OFAT) 實(shí)驗(yàn)（圖8），即每一次實(shí)驗(yàn)只改變一個(gè)工藝參數(shù)的水平，而其他的工藝參數(shù)保持某一水平不變。單因素實(shí)驗(yàn)是比較簡單的實(shí)驗(yàn)方法，可以采用方差分析或回歸分析來分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出工藝參數(shù)的關(guān)鍵性和可接受范圍。單因素實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)是無法研究工藝參數(shù)之間的交互效應(yīng)，而這在生物制藥工藝中常常是存在的。
4.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)DoE
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) (DoE) 是一種結(jié)構(gòu)化、有組織的方法，是監(jiān)管機(jī)構(gòu)鼓勵(lì)采用的方法，用于確定特定工藝過程中影響因素和輸入結(jié)果之間的關(guān)系（圖8）。在工藝表征過程中，需要進(jìn)行科學(xué)合理的DoE實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)CPP進(jìn)一步表征，從而確定出CPP的操作范圍。這部分工作的主要目的是為了給商業(yè)化生產(chǎn)制定工藝操作范圍的邊界，最終確定控制策略。在工藝表征中，原材料可變性如培養(yǎng)基的研究，也可以將原材料的批次作為一個(gè)因子納入實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) (DoE) 中從而在工藝表征的實(shí)驗(yàn)性研究中。
圖8：單因素實(shí)驗(yàn) (OFAT) 和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) (DoE)
5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和最差條件研究
5.1CPP和KPP的確認(rèn)
實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，需對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過采用蒙特卡洛Monte Carlo模擬，并結(jié)合等高線刻畫的方式確定參數(shù)的設(shè)定范圍及最佳操作點(diǎn)（如圖10）。同時(shí)可采用蒙特卡洛模擬對(duì)最差條件進(jìn)行預(yù)測，即分別對(duì)某關(guān)鍵質(zhì)量屬性CQAs中達(dá)到最差情況時(shí)，對(duì)重要工藝參數(shù)KPP和關(guān)鍵工藝參數(shù)CPP進(jìn)行預(yù)測，然后在縮小模型上進(jìn)行Worst case的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
在統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析中，當(dāng)某工藝參數(shù)的變化對(duì)CQA影響的p值<0.05時(shí)，就認(rèn)為這一參數(shù)具有統(tǒng)計(jì)顯著性（如圖9），這些工藝參數(shù)被人們定義為關(guān)鍵工藝參數(shù)CPP，但是可能會(huì)導(dǎo)致一些對(duì)于CQA有影響但變異性不大的參數(shù)被識(shí)別為CPP，不合理地增加了CPP的數(shù)量，加大了后續(xù)工藝控制的難度。很多國際大廠如Roche/Genentech等可采用實(shí)際顯著差異的理念對(duì)CPP進(jìn)行識(shí)別，通過實(shí)際顯著性的理念結(jié)合DoE數(shù)據(jù)分析及CQA實(shí)際情況兩個(gè)維度對(duì)關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行評(píng)估，從而更加合理地進(jìn)行CPP的識(shí)別工作。
圖9：CPP評(píng)估流程。注：P<0.05 只能說是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，同時(shí)可采用Roche/Genentech等實(shí)際顯著差異的理念對(duì)CPP進(jìn)行識(shí)別，這里不過多介紹。
5.2定義設(shè)計(jì)空間
根據(jù)DoE實(shí)驗(yàn)結(jié)果或單因素/失敗邊緣考察，確定設(shè)計(jì)空間。針對(duì)設(shè)計(jì)空間的邊界可確定單因素的參數(shù)經(jīng)驗(yàn)證的可接受范圍 (PAR) ，當(dāng)保持其他參數(shù)恒定時(shí)，此參數(shù)范圍內(nèi)操作將生成符合相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的物料。
在參數(shù)設(shè)定中點(diǎn)上，結(jié)合設(shè)備和工藝的波動(dòng)范圍，在PAR范圍內(nèi)可確定正常操作范圍 (NOR) 。在商業(yè)化生產(chǎn)中工藝參數(shù)一旦超過PAR/NOR就表示該批次失敗，而任何在設(shè)計(jì)空間范圍內(nèi)的變化都不視為變更，無需向監(jiān)管部門提交補(bǔ)充申請(qǐng)并獲得批準(zhǔn)（圖10）。
圖10：蒙特卡洛模擬結(jié)合等高線圖確認(rèn)設(shè)計(jì)空間
6、第二輪風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估更新
在完成表征工作后，返回重復(fù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估FMEA評(píng)估可能是有價(jià)值的。此時(shí)，每個(gè)操作參數(shù)的嚴(yán)重程度因子已知，在某些情況下，這可能會(huì)極大地改變風(fēng)險(xiǎn)優(yōu)先級(jí)數(shù)字的結(jié)果。如圖11生產(chǎn)生物反應(yīng)器中工藝參數(shù)的最終風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果和對(duì)比圖5的第一輪風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果相對(duì)比，我們不難發(fā)現(xiàn)一些之前被認(rèn)為是影響關(guān)鍵質(zhì)量屬性CQA的CPP參數(shù)可能是良好控制，運(yùn)行穩(wěn)定的WC-CPP，一些第一輪我們認(rèn)為會(huì)影響工藝性能KPA的重要工藝參數(shù)KPP，可能是Non-KPP。通過兩輪的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，工廠工程師可以將他們的時(shí)間更好地投入到那些需要最大控制和檢測的操作單元和操作參數(shù)上。
圖11：A-mab中生產(chǎn)生物反應(yīng)器中工藝參數(shù)的最終風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果。WC-CPP=影響質(zhì)量屬性的參數(shù)-良好控制，運(yùn)行穩(wěn)定；KPP=影響工藝屬性的參數(shù)；Non-KPP=不影響QA或PA的參數(shù)
7、建立控制策略
通過工藝表征研究需要確定關(guān)鍵質(zhì)量屬性和關(guān)鍵工藝參數(shù)的列表，以及關(guān)鍵質(zhì)量屬性的可接受范圍與關(guān)鍵工藝參數(shù)的設(shè)計(jì)空間，以確保對(duì)藥物的安全性和有效性。
關(guān)鍵質(zhì)量屬性CQA上通常需要各種分析檢測來控制，比如工藝中控、放行檢測、穩(wěn)定性檢測、表征和可比性檢測等；
關(guān)鍵工藝參數(shù)CPP的控制則是通過工藝程序和操作規(guī)程控制，保證其在設(shè)計(jì)空間內(nèi)；
關(guān)鍵物料參數(shù)CMA如培養(yǎng)基是通過良好的可擴(kuò)展性、準(zhǔn)確的可預(yù)測性以及較小批次之間差異。
Genentech公司曾介紹了一個(gè)基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的屬性檢測策略 (ATS) 的控制策略，如圖12所示。
圖12：Genentech屬性檢測策略 (ATS) 的控制策略流程圖案例
總 結(jié)
工藝表征的目的是系統(tǒng)性地研究工藝參數(shù)和原材料屬性對(duì)工藝表現(xiàn)的影響，通過第一階段工藝表征前Pre-PC的信息收集、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、縮小模型建立，第二階段工藝表征PC階段的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、統(tǒng)計(jì)學(xué)預(yù)測、最差條件研究、結(jié)合第二輪風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估篩選出關(guān)鍵工藝參數(shù)CPPs、關(guān)鍵物料屬性CMAs和KPPs并確定其可接受范圍PAR和可操作空間NOR，最終建立工藝控制策略，為后續(xù)工藝驗(yàn)證PV、采用PAT過程監(jiān)控控制策略CS、產(chǎn)品整個(gè)生命周期管理打下基礎(chǔ)。
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