乙醇作為消毒劑廣泛用于皮膚黏膜以及器具、設(shè)備表面消毒，還廣泛用于各種皮膚黏膜消毒劑的復(fù)配成分。乙醇作為消毒劑《中國藥典》推薦使用濃度為體積分數(shù)70%～75% ，在復(fù)配消毒劑中作為增效或增溶劑并沒有限定使用濃度。
在最新修訂頒布的國家推薦標準GB/T 26373－2020《醇類消毒劑衛(wèi)生標準》推薦乙醇( 含異丙醇和復(fù)合醇) 使用濃度≥體積分數(shù)60%或質(zhì)量分數(shù)50%。實際使用中，以乙醇為主要成分的快速手消毒劑的乙醇含量在60%～90%，有的快速手消毒劑乙醇含量甚至更低。但是，關(guān)于不同濃度乙醇溶液的定量殺菌效果的報道很少見到。
為此，本研究采用懸液定量殺菌試驗法，對濃度為體積分數(shù) 35%以上不同濃度乙醇溶液進行了殺菌效果觀察?，F(xiàn)將觀察結(jié)果報告如下。
1、 材料和方法
1.1 試驗材料
試驗用乙醇溶液為分析純無水乙醇，乙醇含量≥99.7%，國內(nèi)市售產(chǎn)品;稀釋用水無菌標準硬水，試驗時按體積分數(shù)配制成系列百分濃度。試驗指標菌有金黃色葡萄球菌(ATCC 6538) 、大腸桿菌(8099) 和白色念珠菌(ATCC 10231) ，均由中國菌種保藏中心提供。試驗用生化試劑及培養(yǎng)基均為國內(nèi)市售成品，中和劑用D/E肉湯，市售產(chǎn)品。
1.2 試驗方法
1.2.1 菌懸液制備
取標準菌株培養(yǎng)分純的典型菌落接種于營養(yǎng)培養(yǎng)基斜面，經(jīng)37℃培養(yǎng)18～24h，用胰蛋白胨生理鹽水(TPS)洗下斜面上菌苔，轉(zhuǎn)移到無菌試管中，經(jīng)充分震蕩混勻，用TPS稀釋成所需的濃度備用。試驗時，將菌懸液與30g/L的牛血清白蛋白作對倍混合。微菌量法: 將菌懸液與300g/L的牛血清白蛋白對倍混合。
1.2.2 中和劑鑒定試驗
取滅菌后的D/E中和肉湯水溶液，并依據(jù)2002年版《消毒技術(shù)規(guī)范》規(guī)定的懸液定量試驗程序進行了中和劑效果鑒定，試驗證明有效，試驗操作和結(jié)果均省略。
1.2.3 常規(guī)懸液定量殺菌試驗
試驗在20℃水浴條件下進行，首先對試驗用乙醇溶液和菌懸液均恒溫5min。在無菌試管內(nèi)加入菌懸液1.0 mL和4.0mL某濃度乙醇溶液(陽性對照為TPS) ，混合計時。作用至預(yù)定時間，吸取0.5mL混合樣液加入到含有4.5 mL中和劑的試管中，混勻中和作用10 min。然后用混勻的樣液以平板傾注法接種培養(yǎng)，做活菌培養(yǎng)計數(shù)，計算殺滅對數(shù)值。所有試驗重復(fù)3次。
1.2.4 微菌量法懸液定量殺菌試驗
在無菌試管內(nèi)加入菌懸液0.1 mL和某濃度乙醇溶液4.9mL(陽性對照為TPS)，混合計時。以下操作同上述常規(guī)懸液定量殺菌試驗。
2、 結(jié)果
2.1 對金黃色葡萄球菌殺滅效果
結(jié)果表明，濃度為45%～90%范圍的乙醇溶液作用3min，對金黃色葡萄球菌殺滅對數(shù)值＞5.0；濃度≤40%或≥95%的乙醇溶液作用3min，對金黃色葡萄球菌殺滅對數(shù)值均≤5.0(表1)。
2.2 對大腸桿菌殺滅效果
結(jié)果顯示，濃度為40%～98%范圍的乙醇溶液作用1min，對大腸桿菌殺滅對數(shù)值均＞5.0；濃度為35%的乙醇溶液作用3min，對大腸桿菌殺滅對數(shù)值均＜3.0( 表2) 。
2.3 對白色念珠菌殺滅效果
結(jié)果表明，濃度為45%～98%范圍的乙醇溶液作用2min，對白色念珠菌殺滅對數(shù)值均＞5.0；40%的乙醇溶液作用2min，對白色念珠菌的平均殺滅對數(shù)值為3.28；濃度為35%的乙醇溶液作用3min，對白色念珠菌殺滅對數(shù)值均＜3.0( 表3) 。
3、 討論
3CH2OH或C2H5OH，俗稱酒精，是最常見的一元醇。在常溫常壓下是一種易燃、易揮發(fā)的無色透明液體，低毒性，有刺激的辛辣滋味。易燃，其蒸氣能與空氣形成爆炸性混合物，能與水以任意比互溶。能與氯仿、乙醚、甲醇、丙酮和其他多數(shù)有機溶劑混溶，相對密度0.816。
乙醇消毒劑的殺菌機制是:
①使蛋白質(zhì)變性。乙醇分子進入蛋白質(zhì)分子的肽鏈，使蛋白質(zhì)變性沉淀。
②破壞細菌細胞壁。乙醇分子以自由擴散的方式迅速滲透到菌體內(nèi)，使細菌細胞破壞溶解。
③對微生物酶系統(tǒng)的破壞。通過抑制酶系統(tǒng)，特別是脫氫酶和氧化酶等，阻礙其正常代謝。
濃度范圍70%～80%的乙醇更容易進入菌體細胞內(nèi)，能迅速殺菌。因為無水或過高濃度的乙醇溶液使菌體細胞迅速脫水，導(dǎo)致菌體表面蛋白質(zhì)凝固，在菌體表面形成保護膜，阻止乙醇進入細胞，阻礙殺死菌體;過低濃度的乙醇溶液，因為乙醇濃度過低，殺菌能力會迅速減弱，甚至無殺菌效果。所以乙醇濃度過高或過低時都會影響其殺菌效果。
關(guān)于75%乙醇溶液的殺菌效果報道很多，但是其他濃度的乙醇溶液的定量殺菌效果報道很少。試驗中定量檢測了不同濃度乙醇溶液的殺菌效果。試驗中發(fā)現(xiàn)，懸液定量殺菌試驗中，45%～90%的乙醇溶液對金黃色葡萄球菌有效，40%～98%的乙醇溶液對大腸桿菌和白色念珠菌有效；95%及以上濃度和 40%及以下濃度的乙醇溶液對金黃色葡萄球菌殺菌效果不符合標準要求，35%及以下濃度的乙醇溶液對大腸桿菌和白色念珠菌殺菌效果不符合標準要求。
所以，從試驗結(jié)果得出:乙醇的最高有效殺菌濃度為90%，最低有效殺菌濃度為45%。30%及以下濃度的乙醇溶液作用3min對試驗菌的殺滅作用很微弱。
試驗中發(fā)現(xiàn)，與75%乙醇消毒劑相比，更低濃度的乙醇溶液仍然能有效殺滅細菌和真菌，這個數(shù)據(jù)對以乙醇為主要殺菌成分或復(fù)配成分的消毒劑生產(chǎn)有指導(dǎo)意義。
一般認為，對于相同的消毒劑，真菌比細菌的耐受性更強，但是試驗中發(fā)現(xiàn)，對于乙醇溶液，白色念珠菌比金黃色葡萄球菌更敏感，這一現(xiàn)象與含氯類消毒劑、過氧乙酸消毒劑和過氧化氫消毒劑有區(qū)別。
因為《消毒技術(shù)規(guī)范》提出在進行試驗時首選懸液法，所以試驗中采用懸液法進行定量殺菌試驗。從乙醇消毒液的使用場景出發(fā)，載體法的殺菌試驗，有待進一步研究。
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