依那普利是臨床上常用的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑，用于各種原發(fā)性高血壓、腎性高血壓、充血性心力衰竭。原料藥主要以馬來酸依那普利的形式存在，原料存在的主要雜質(zhì)為依那普利拉（雜質(zhì)Ⅰ）和依那普利雙酮（雜質(zhì)Ⅱ），其中主要是雜質(zhì)Ⅰ。
本文擬以歐洲藥典的方法為基礎(chǔ)，對(duì)其進(jìn)行色譜條件優(yōu)化，進(jìn)行雜質(zhì)定量測(cè)定方法的驗(yàn)證，以期為雜質(zhì)Ⅰ提供可靠的定量檢測(cè)方法，同時(shí)為該類方法的驗(yàn)證提供更加科學(xué)全面的驗(yàn)證參數(shù)。
1、 儀器和試藥
1.1 儀器
XP205DR電子天平；2臺(tái)島津LC20A液相色譜儀；Mili-QIntegrals超純水系統(tǒng)；酸度計(jì)；KQ-300DV型數(shù)控超聲波清洗儀。
1.2 試劑和試藥
對(duì)照品：馬來酸依那普利（批號(hào)100705-201604，含量99.9%）、依那普利拉（雜質(zhì)Ⅰ）（批號(hào)2016-784，含量88.1%）。
樣品：馬來酸依那普利原料（批號(hào)5113-6-015）。
試劑：磷酸（分析純，批號(hào)20171026）；磷酸二氫鉀（分析純，批號(hào)20161208；乙腈（色譜級(jí)，批號(hào)171011）；甲醇（色譜級(jí)，批號(hào)163201）。
2、 流動(dòng)相及其他溶液的配制
2.1 流動(dòng)相及溶劑
緩沖液：稱取磷酸二氫鉀5.4g，加水制成1000mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0；溶劑1：緩沖液-乙腈-甲醇（1∶2∶2）；溶劑2：溶劑1-緩沖液（8∶92）；流動(dòng)相A：溶劑1-緩沖液（1∶9）；流動(dòng)相B：乙腈。
2.2 供試品儲(chǔ)備液
精密稱取馬來酸依那普利原料適量，置50mL量瓶中，加甲醇10mL，加溶劑2稀釋至刻度，制成20mg·mL-1的供試品儲(chǔ)備液。
2.3 對(duì)照品溶液
精密稱取依那普利拉對(duì)照品適量，置20mL量瓶中，加甲醇2mL，加溶劑2稀釋至刻度，制成1mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2和3mL至100mL量瓶中，加溶劑2稀釋至刻度，分別制成質(zhì)量濃度為10、20和30μg·mL-1的對(duì)照品溶液。
2.4 混合對(duì)照品溶液
精密稱取馬來酸依那普利對(duì)照品和依那普利拉對(duì)照品至10mL量瓶中，加甲醇2mL，加溶劑2稀釋至刻度。精密量取1mL至100mL量瓶中，加溶劑2稀釋至刻度，制成20μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。
3、 色譜條件及測(cè)定方法
3.1 色譜條件
采用ShiseidoC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），柱溫65℃，進(jìn)樣器溫度4℃，進(jìn)樣量20μL，流動(dòng)相同“2.1”項(xiàng)，梯度洗脫，洗脫順序見表1，流速1mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。
3.2 測(cè)定法
精密稱取馬來酸依那普利適量，加甲醇2mL，加溶劑2稀釋至刻度，制成每1mL中約含2mg的溶液，作為供試品溶液，精密量取20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取依那普利拉對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇6mL，加溶劑2制成每1mL約含6μg·mL-1的對(duì)照品溶液，同法測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算含量，依那普利拉的含量不大于0.3%。
4、 統(tǒng)計(jì)分析軟件
本文所用統(tǒng)計(jì)軟件包括JMP和理化方法驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)軟件（PCMV）。
5、 方法驗(yàn)證及結(jié)果
5.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
取“2.4”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按照“3.1”的色譜條件進(jìn)樣，獲得的色譜圖見圖1，出峰順序?yàn)轳R來酸、依那普利拉和依那普利。依那普利峰的拖尾因子為1.0<2.0，馬來酸與依那普利拉分離度19.0>1.5，依那普利拉與依那普利分離度為30.9>4.0，依那普利拉理論塔板數(shù)不低于5000。
5.2 專屬性
取“2.4”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按照“3.1”的色譜條件，進(jìn)樣，獲得的色譜圖如圖1所示，馬來酸與依那普利拉分離度19.0>1.5，依那普利拉與依那普利分離度為30.9>4.0，方法的專屬性良好。
5.3 線性、檢測(cè)下限與定量下限和范圍
5.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
在濃度范圍為其質(zhì)量限度標(biāo)準(zhǔn)（0.3%）的8.0%（預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的LOD）~200.0%內(nèi)設(shè)置9個(gè)濃度點(diǎn)，0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0μg·mL-1，每個(gè)濃度獨(dú)立制備3份。
5.3.2 操作步驟
精密量取“2.3”項(xiàng)下10μg·mL-1的對(duì)照品溶液0.5、1和2mL，20μg·mL-1的對(duì)照品溶液2、4、5mL，30μg·mL-1的對(duì)照品溶液1、2和4mL，分別置10mL量瓶中，加溶劑2稀釋至刻度，制成約0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0μg·mL-1的對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度獨(dú)立制備3份，進(jìn)樣測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見表2。
5.3.3 線性數(shù)據(jù)分析
線性方程：以濃度X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，得濃度-峰面積的最小二乘回歸圖，見圖2。線性方程：Y=139.86+38982.17X r=0.9998截距估計(jì)值：截距為-139.86，截距的標(biāo)準(zhǔn)誤為867.04，t比為-0.16，概率>|t|值為0.87>0.5，統(tǒng)計(jì)上顯示截距與0沒有顯著性差異，由此確定依那普利拉雜質(zhì)可通過外標(biāo)法確定其含量?；貧w線的標(biāo)準(zhǔn)誤為2695.87。
5.3.4 檢測(cè)下限與定量下限
基于“5.3.3”項(xiàng)的回歸方程，采用線性 95% 的預(yù)測(cè)區(qū)間確定分析方法的檢測(cè)下限與定量下限分為：
5.3.5 線性范圍
該分析方法在0.5~12.0μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)均滿足線性要求。
5.4 準(zhǔn)確度和精密度
5.4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
（1）對(duì)影響此方法的因素進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分析，確定本方法的主要影響因素：儀器、分析人員以及每個(gè)分析人員的獨(dú)立操作次數(shù)（時(shí)間）；
（2）通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定偏倚約為10%，變異約為5%，將α設(shè)為5%，效能設(shè)為90%時(shí)，通過JMP軟件求得所需的樣本量，即實(shí)驗(yàn)次數(shù)不少于5次；
（3）以上述2個(gè)條件為基礎(chǔ)，將3個(gè)主要因素均設(shè)置2個(gè)水平，采用3因素全析因
設(shè)計(jì)，確定8個(gè)實(shí)驗(yàn)條件（見表4），滿足參數(shù)計(jì)算的樣本量需求；
（4）濃度范圍選擇：以加標(biāo)濃度為其質(zhì)量限度標(biāo)準(zhǔn)（0.3%）的8.0%（預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的LOD）~150.0%為參考，設(shè)置7個(gè)濃度點(diǎn)：0.5、1、2、4、6、8、9μg·mL-1。
5.4.2 操作步驟
精密量取“2.3”項(xiàng)下10μg·mL-1的對(duì)照品溶液0.5、1、2mL，20μg·mL-1的對(duì)照品溶液2、4mL，30μg·mL-1的對(duì)照品溶液2、3mL，分別置10mL量瓶中，分別加“2.2”項(xiàng)下的供試品儲(chǔ)備液1mL，加溶劑2稀釋至刻度，制成加樣濃度約為0.5、1、2、4、6、8、9μg·mL-1的溶液，每個(gè)濃度獨(dú)立制備3份。按照“3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果匯總于表4。
5.4.3 結(jié)果分析
5.4.3.1 精密度
通過對(duì)每個(gè)濃度進(jìn)行方差成分分析，可獲得該分析方法在不同濃度下的重復(fù)性，中間精密度及其精密度上限值。設(shè)α=0.05，精密度結(jié)果表見表5。
5.4.3.2 準(zhǔn)確度
通過對(duì)每個(gè)濃度下真實(shí)值（100%）與回收率結(jié)果的差值獲得方法在該濃度下的偏倚值，以及獲得其置信區(qū)間。設(shè)α=0.05時(shí)的結(jié)果分析表見表6。
5.4.3.3 方法能力的綜合評(píng)價(jià)
對(duì)于準(zhǔn)確度與精密度的聯(lián)合判定，引入新的統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)參數(shù)，方法變異、方法能力指數(shù)（MCI）、方法誤判率、方法分級(jí)、預(yù)測(cè)區(qū)間和容忍區(qū)間。假定雜質(zhì)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在90.0%~110.0%時(shí)能滿足產(chǎn)品檢測(cè)的需求，則分析結(jié)果見表7。
圖3和圖4為在不同濃度下的預(yù)測(cè)區(qū)間或容忍區(qū)間與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系圖。從表7、圖3和圖4可以看出，此分析方法在2.0~9.0μg·mL-1時(shí)，方法的準(zhǔn)確度與精密度能滿足產(chǎn)品檢測(cè)需求。
5.5 方法適用范圍
在準(zhǔn)確度、精密度、LOQ和線性滿足前提下的方法適用濃度范圍為2.0~9.0μg·mL-1。
5.6 溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)
一次進(jìn)樣需運(yùn)行45min，為保證在方法驗(yàn)證期間，所配制溶液的穩(wěn)定性，考察了供試品溶液在60h內(nèi)的穩(wěn)定性。
精密量取“2.1”供試品儲(chǔ)備液1mL至10mL量瓶中，加溶劑2稀釋至刻度，在0、5、10、20、30、40、50、60h按照“3”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，獲得依那普利和依那普利拉的峰面積。從表中可以看出，隨著所配制溶液放置時(shí)間的延長(zhǎng)，依那普利拉逐漸增多，依那普利減少。在40h內(nèi)，依那普利拉峰面積的RSD=0.72%，溶液維持穩(wěn)定。
6、 討論和結(jié)論
6.1 馬來酸依那普利原料藥中依那普利拉雜質(zhì)定量測(cè)定的檢測(cè)方法
2015年版《中國(guó)藥典》中對(duì)馬來酸依那普利原料藥中依那普利拉雜質(zhì)進(jìn)行的是限度檢查，該方法的系統(tǒng)適用性試驗(yàn)在主成分和雜質(zhì)組分均為20.0μg·mL-1時(shí)滿足藥典要求。但在進(jìn)行實(shí)際產(chǎn)品檢測(cè)時(shí)，由于試驗(yàn)時(shí)按2.0mg·mL-1濃度進(jìn)樣（高于系統(tǒng)適用性濃度100倍），導(dǎo)致馬來酸峰與依那普利拉峰出現(xiàn)一定程度重合（圖5），使含量計(jì)算存在被低估的風(fēng)險(xiǎn)。
為使馬來酸峰與依那普利拉峰能完全分開，保證能夠準(zhǔn)確定量依那普利拉峰，作者以歐洲藥典中原料藥依那普利拉的雜質(zhì)進(jìn)行限度測(cè)定方法的色譜條件為基礎(chǔ)進(jìn)行優(yōu)化，綜合考慮峰形、馬來酸峰與依那普利峰的分離度以及分析時(shí)間等因素，最終確定的色譜條件。
該方法的缺點(diǎn)是無法檢測(cè)到馬來酸依那普利中的雜質(zhì)依那普利雙酮，但本實(shí)驗(yàn)主要用于對(duì)雜質(zhì)類定量分析方法性能參數(shù)的評(píng)估探討，故不影響此目的的闡述。
6.2 LOD和LOQ的確定
目前ICHQ2（R1）指南和專著給出的確定LOD與LOQ的方法可以歸為4類：
1）可視化的評(píng)估；
2）基于空白分布；
3）基于線性；
4）基于分析方法的精密度。
國(guó)內(nèi)最常應(yīng)用的是基于空白分布中信噪比法來確定LOD與LOQ。本文所計(jì)算LOD的方法是基于USP<1210>提出的線性95%的預(yù)測(cè)區(qū)間來確定，此方法不僅考慮了Ⅰ類錯(cuò)誤與Ⅱ類錯(cuò)誤，同時(shí)將實(shí)驗(yàn)測(cè)定的變異性（不確定度）考慮在內(nèi)。因此更加可靠和科學(xué)。
按照<1210>的闡述，該方法所得LOD可作為最小LOQ使用，但為保證LOQ更加可靠，本實(shí)驗(yàn)將LOQ用10替代計(jì)算公式中的（t1-α；n-2+t1-α；n-2）。
6.3 準(zhǔn)確度和精密度的獲取和描述
目前國(guó)內(nèi)有關(guān)方法驗(yàn)證的文章中通常對(duì)方法準(zhǔn)確度的評(píng)價(jià)僅提供偏倚及其置信區(qū)間，無法從整體體現(xiàn)方法的變異。系統(tǒng)精密度和重復(fù)性的驗(yàn)證，通過對(duì)某一對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6針來確定儀器精密度，將同一供試品溶液平行制備6份來確定方法的重復(fù)性。該方法節(jié)省時(shí)間成本，但是不能夠正確表明方法在不同濃度下的變異性。
本文中有8個(gè)實(shí)驗(yàn)條件，每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)每個(gè)濃度獨(dú)立制備3份溶液，通過方差成分分析可以同時(shí)確定中間精密度與重復(fù)性。同理對(duì)于重復(fù)性和儀器精密度也可以按照本文的方法確定。本文的試驗(yàn)設(shè)計(jì)充分考慮了不同濃度下該方法的變異，從整體把握方法的適用性及其適用范圍。
為了更充分表達(dá)所獲準(zhǔn)確度和精密度，本文所采用的設(shè)計(jì)，還能有效地計(jì)算出準(zhǔn)確度置信區(qū)間和精密度置信上限，從而為技術(shù)人員和監(jiān)管者更好地把握所得參數(shù)的可靠性提供依據(jù)。
6.4 方法能力綜合評(píng)價(jià)參數(shù)及其比單獨(dú)使用準(zhǔn)確度
和精密度評(píng)價(jià)的優(yōu)勢(shì)目前ICH指南、《中國(guó)藥典》和歐洲官方實(shí)驗(yàn)室都使用準(zhǔn)確度和精密度單獨(dú)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行方法驗(yàn)證的判定。這里的限度標(biāo)準(zhǔn)多通過經(jīng)驗(yàn)確定出，主觀性較大，且沒有與所檢測(cè)產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)直接聯(lián)系。
本次新增方法變異、預(yù)測(cè)區(qū)間和容忍區(qū)間、方法能力指數(shù)等綜合評(píng)價(jià)方法滿足其預(yù)期用途的參數(shù)（有關(guān)其詳細(xì)含義請(qǐng)參見參見USP<1210>和本專欄《定量理化分析類方法滿足預(yù)期用途的判斷標(biāo)準(zhǔn)探討》），是對(duì)準(zhǔn)確度和精密度進(jìn)行合成后衍生出的新參數(shù)，這些參數(shù)是對(duì)方法整體評(píng)價(jià)更全面的把握。
此外，將各濃度下計(jì)算的容忍區(qū)間和預(yù)測(cè)區(qū)間按濃度-質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度進(jìn)行構(gòu)圖（見表7和圖3和圖4），可更清晰和直觀地了解方法在不同濃度下的判斷，具有科學(xué)、直觀的優(yōu)勢(shì)。
本方法對(duì)依那普利拉雜質(zhì)的檢測(cè)，在LOQ0.8~2.0μg·mL-1的范圍，只可確保標(biāo)示量的±20%的變異內(nèi)檢測(cè)準(zhǔn)確，在2.0~9.0μg·mL-1濃度范圍，其容忍區(qū)間均包含于±10%以內(nèi)，且對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量限度標(biāo)準(zhǔn)為6.0μg·mL-1濃度周圍，該方法的變異容忍區(qū)小于±5%，方法能力指數(shù)達(dá)到1.02，因方法變異產(chǎn)生的誤判率為0.2%；故認(rèn)為是一個(gè)非?？煽康亩繖z測(cè)方法。
本次方法驗(yàn)證所獲預(yù)測(cè)區(qū)間和容忍區(qū)間不僅可用于新方法進(jìn)行方法驗(yàn)證，也為后續(xù)方法的轉(zhuǎn)移和驗(yàn)證判定提供依據(jù)，即方法轉(zhuǎn)移或確認(rèn)時(shí)，進(jìn)行一次實(shí)驗(yàn)所獲得的結(jié)果應(yīng)分布于預(yù)測(cè)區(qū)間內(nèi)，所有試驗(yàn)結(jié)果的90%應(yīng)處于容忍區(qū)間內(nèi)。
6.5 結(jié)論
該方法滿足對(duì)馬來酸依那普利原料藥中依那普利拉雜質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)的要求。在專屬性方面，依那普利拉峰與馬來酸峰和依那普利峰間的分離度分別為19.0和30.9。在線性、LOD和范圍方面：在0.5~1.2μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，線性方程為Y=139.86+38982.17X，r=0.9998；殘差標(biāo)準(zhǔn)誤為2693.44，且殘差呈隨機(jī)分布，截距與零無顯著差異。
由此確定雜質(zhì)依那普利拉可通過外標(biāo)法確定其含量；基于線性95%的預(yù)測(cè)區(qū)間確定的LOQ為0.76μg·mL-1。在綜合能力評(píng)價(jià)方面：2.0~9.0μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)，方法的預(yù)測(cè)區(qū)間與容忍區(qū)間均分布于限度標(biāo)準(zhǔn)的90.0%~110%內(nèi)，在產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度6.0μg·mL-1周圍，方法可達(dá)到Ⅲ級(jí)方法，因方法產(chǎn)生的誤判率僅為0.2%。溶液穩(wěn)定性：在40h內(nèi)溶液維持穩(wěn)定。
文章來源：《藥物分析雜志》2019年第39卷第2期
原標(biāo)題：《雜質(zhì)類定量分析方法驗(yàn)證中的統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)價(jià)》
作者：朱容蝶 ，耿穎 ，譚德講，楊化新，何蘭，劉萬卉（中國(guó)食品藥品檢定研究院）
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