近年來，隨著生物材料的發(fā)展，3D打印支架形式的生物材料在骨再生研究中得到了廣泛的應(yīng)用。由于其個性化設(shè)計和良好的生物相容性，可以通過提高手術(shù)準(zhǔn)確性和安全性來加速骨再生。當(dāng)生物材料激活再生系統(tǒng)時，生物材料與免疫系統(tǒng)之間的相互作用反應(yīng)是不可避免的。因此，骨替代生物材料的開發(fā)應(yīng)促進成骨分化，并注重誘導(dǎo)適度的骨免疫微環(huán)境。
近日，來自中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院的賴毓霄研究員團隊利用低溫3D打印技術(shù)開發(fā)了聚（乳酸-乙醇酸）（PLGA）摻入黑磷（BP）納米片支架（PLGA/BP支架），以滿足各種成骨材料結(jié)構(gòu)的特殊要求（方案1）。PLGA/BP支架表現(xiàn)出適當(dāng)?shù)纳锵嗳菪?、生物可降解性和機械性能，作為支持新骨形成的優(yōu)異微環(huán)境。通過細胞學(xué)、免疫組化等手段對BP骨免疫調(diào)節(jié)和成骨的影響進行了詳細的探究（方案1）。
相關(guān)研究成果以“Regulation of Osteoimmune Microenvironment and Osteogenesis by 3D-Printed PLAG/black Phosphorus Scaffolds for Bone Regeneration”為題于2023年8月24日發(fā)表在《Advanced Science》上。
方案1 3D打印制造的PLGA/BP支架示意圖以及BP降解誘導(dǎo)骨免疫環(huán)境加速骨再生的機制
1. 3D打印BP納米片作為支架的制造和表征
該研究利用低溫沉積3D打印技術(shù)來制造PLGA/BP支架，可生物降解聚合物PLGA用作形成復(fù)合支架的基質(zhì)，將不同量的BP納米片添加PLGA基質(zhì)中在-30 ℃下打?。▓D1a）。利用低溫3D打印技術(shù)調(diào)節(jié)支架的孔隙率，使PLGA/BP支架具有大孔和微孔的高互連性，可以增加骨傳導(dǎo)性，促進骨細胞增殖及其與細胞外基質(zhì)的粘附。SEM表明支架具有良好的互連結(jié)構(gòu)，平均大孔橫向尺寸為408.69±29.76 μm，支架表面微孔橫向尺寸為1- 50 μm（圖1b）。EDS進一步表明磷元素在骨架中的比例隨著BP含量的增加而增加（圖1c）。作者還利用拉曼、XRD和XPS證實了BP納米片成功引入PLGA支架中（圖1d-g）。
圖1 3D打印支架的形態(tài)和表征
2. PLGA/BP支架的體外研究
隨后作者研究了PLGA/BP支架的降解性。BP納米片可以緩慢降解并連續(xù)釋放磷酸分子長達28天（圖2a），并且PBS中的P元素濃度也不斷增加。PLGA/BP支架的最終降解產(chǎn)物是無毒的磷酸鹽和乳酸。PLGA/BP支架在指示降解時間點的抗壓強度和抗壓模量的變化如圖2c、d所示。力學(xué)測試表明，在為期4周的降解過程中，不同PLGA/BP支架的機械性能在所有組中均呈現(xiàn)下降趨勢。此外，作者培養(yǎng)三種不同濃度的PLGA/BP支架7天后進行鬼筆環(huán)肽的熒光染色。實驗結(jié)果表明支架上粘附有大量的hBMSC或RAW264.7細胞以及豐富的細胞骨架，證明了該材料良好的生物相容性。總的來看，PLGA/BP支架還具有合適的生物相容性、生物可降解性和出色的機械性能，是骨缺損治療的理想選擇。
圖2 不同BP濃度PLGA/BP支架的體外降解行為及生物相容性測試
初始炎癥階段比隨后的活躍骨修復(fù)階段更為重要，巨噬細胞在控制炎癥反應(yīng)和維持骨再生過程中發(fā)揮著決定性作用。因此，作者首先在體外研究了不同支架上巨噬細胞的極化。使用免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡定性評估了不同的PLGA/BP支架如何影響巨噬細胞響應(yīng)LPS刺激的極化。巨噬細胞典型的表面標(biāo)志物在不同基因型中存在差異表達，CD86被發(fā)現(xiàn)在促炎巨噬細胞階段（M1）強表達。M2表型由典型表面標(biāo)記CD163激活，有助于下調(diào)炎癥并增強組織愈合。（圖3a-c）。與LPS刺激的對照組相比，PLGA組CD163表達的熒光強度相似。這表明PLGA/BP支架可以促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞的轉(zhuǎn)化。
此外，在相同培養(yǎng)條件下檢測12和24小時抗炎細胞因子的分泌，以證實不同材料對細胞的影響。結(jié)果表明PLGA/BP支架可以招募巨噬細胞并抑制炎癥，從而刺激巨噬細胞的M2極化并促進骨再生。
圖3 PLAG/BP支架上的巨噬細胞極化
為了進一步研究BP對成骨分化和礦化的分子機制，對在降解釋放浸出的PLGA/BP支架上培養(yǎng)的hBMSC進行了轉(zhuǎn)錄組分析（圖4a-b）。本節(jié)的結(jié)果（圖4c）表明BP最有可能在骨基質(zhì)形成中發(fā)揮積極作用。而且KEGG數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果（圖4d）顯示細胞粘附分子、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、cGMP-PKG信號通路、PI3K-AKT信號通路，這些與組織損傷修復(fù)相關(guān)的信號通路顯著上調(diào)，而且PI3K-AKT也顯著上調(diào)，信號通路可能有助于維持巨噬細胞M2極化。
圖4 PLGA/BP 支架成骨分化的轉(zhuǎn)錄組分析
通過鈣結(jié)節(jié)染色的半定量分析評估不同PLGA/BP支架組的成骨分化水平。成骨誘導(dǎo)第14天，觀察到支架提取物誘導(dǎo)的hBMSC細胞在各實驗組均出現(xiàn)不同程度的深紅色鈣沉積（圖5a），尤其是40BP提取物培養(yǎng)后鈣沉積密度最大（圖5b），表明40BP支架更有效地促進成骨分化。為了進一步評估成骨分化過程中相關(guān)基因的表達情況，檢測并驗證了轉(zhuǎn)錄組相關(guān)篩選基因（PI3K、IBSP、SPP1、OPN，圖5c1）和成骨相關(guān)基因（Runx2、Osterix、ALP、BMP2，圖5c2）。對于成骨中的功能蛋白，與對照組和PLGA組相比，40BP組的Runx2表達也顯著上調(diào)（圖5d）。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果與成骨分化實驗結(jié)果一致，提示40BP支架可通過PI3K-AKT信號通路促進成骨細胞蛋白分泌、成骨分化和成骨行為。
圖5 PLGA/BP支架通過激活PI3K-AKT信號通路促進成骨分化和礦化
3. 支架在體內(nèi)的成骨研究
體外數(shù)據(jù)結(jié)果表明BP在體外誘導(dǎo)巨噬細胞M2極化并抑制炎癥以協(xié)調(diào)骨再生，作者還進一步利用SAON大鼠模型研究了其免疫調(diào)節(jié)功能。通過對大鼠股骨切片上不同實驗組的巨噬細胞進行了免疫熒光染色展示各組單核巨噬細胞CD68免疫熒光表達情況（圖6a-d）。統(tǒng)計結(jié)果顯示PLGA和40BP支架均可招募M2巨噬細胞（圖6d）。免疫熒光結(jié)果進一步證實PLGA/BP支架可以誘導(dǎo)巨噬細胞M1（CD86）向M2（CD163）極化。BP可以調(diào)節(jié)大鼠植入部位周圍的骨免疫環(huán)境。40BP組能有效促進體內(nèi)M2巨噬細胞表型、降低M1巨噬細胞表型，對抗炎局部微環(huán)境中新骨形成產(chǎn)生積極影響。
圖6 PLGA/BP支架對SAON大鼠股骨遠端缺損免疫調(diào)節(jié)作用的體內(nèi)評估
最后將40BP支架植入SAON大鼠模型的股骨遠端缺損來評估其成骨效果。術(shù)后4周和8周，通過微型CT掃描骨缺損部位并重建以進行分析（圖7a）。術(shù)后4周各組支架均無松動、脫落，缺損腔內(nèi)開始長出新骨組織。術(shù)后8周，空對照組和PLGA組手術(shù)腔內(nèi)外新生骨逐漸增多，但與40BP組不同的是，仍未完全恢復(fù)。骨生長定量分析如圖7b-g所示，包括骨密度（BMD）、骨體積（BV）、骨體積百分比（BV/TV）和骨小梁分析。綜合信息表明BP支架表現(xiàn)出優(yōu)異的成骨和骨整合能力，證明骨免疫微環(huán)境促進成骨和骨再生過程。
圖7 micro-CT檢測骨缺損中PLGA/BP支架對新骨形成的作用
為了評估新骨組織的生長和骨-種植體界面的整合效果，在對照組、PLGA和40BP組中進行了Goldner三色染色（圖8a）和H&E染色。在40BP組中，通過染色檢測到大量礦化骨組織（綠色）。為了進一步分析骨再生，通過免疫組織化學(xué)染色檢測與骨生成相關(guān)的蛋白質(zhì)（BMP2、OPN和OCN，圖8c）。支架植入后4周和8周，與成骨相關(guān)的40BP蛋白表達較對照組和PLGA組顯著增加（圖8d，e），表明40BP支架具有優(yōu)異的骨再生能力。
為了研究新骨形成和重塑的效果，在不同時間點用連續(xù)熒光標(biāo)記對礦化骨組織進行標(biāo)記。使用熒光圖像（圖8b），定量分析發(fā)現(xiàn)40BP組的礦物質(zhì)沉積率（MAR，圖8f）和骨形成率（BFR，圖8g）顯著增加，骨組織的形成和修復(fù)速度明顯高于對照組和PLGA組，表明植入40BP支架后骨組織形成和修復(fù)加速。這些組織學(xué)數(shù)據(jù)表明40BP支架可以顯著改善新骨的形成，達到對骨缺損的有效治療效果。
圖8 術(shù)后4周和8周SAON大鼠股骨遠端缺損區(qū)域新骨形成的組織學(xué)分析
綜上，本文利用多孔PLGA/BP支架的3D打印來研究BP對骨組織微環(huán)境乃至隨后的骨再生的骨免疫調(diào)節(jié)作用。多孔PLGA/BP支架可以顯著抑制炎癥細胞因子并促進巨噬細胞極化至M2型。在體內(nèi)，這種促成骨微環(huán)境通過上調(diào)IBSP、SPP1、ALP、Osterix、OPN、R2和BMP2來促進hBMSC的增殖和分化，從而進一步加速骨再生。此外，PLGA/BP支架具有優(yōu)異的成骨性、生物相容性和力學(xué)性能，可以通過PI3K-AKT信號通路有效促進骨再生。因此，PLGA/BP支架是一種優(yōu)良的骨替代物，可用于通過免疫調(diào)節(jié)原位骨和成骨來治療骨缺損。
文章來源：https://doi.org/10.1002/advs.202302539
京公網(wǎng)安備11010802046783號
