心血管疾病導(dǎo)致全世界每年超過1790萬人死亡，以心肌梗死(MI)為代表的缺血性心臟病是心血管疾病相關(guān)死亡的主要原因。心肌梗死再灌注后發(fā)生不可逆的病理重構(gòu)，包括左心室擴(kuò)張和心肌梗死后的過度炎癥反應(yīng)，常常導(dǎo)致致命性的功能損害。
基于此，來自韓國忠南國立大學(xué)的Youngkeun Ahn和韓國光州科學(xué)技術(shù)學(xué)院的Jae Young Lee開發(fā)了一種使用葡聚糖醛(Dex-ald)和明膠的可涂性和粘附性水凝膠貼片，將抗炎蛋白ANGPTL4加入水凝膠中，直接向梗塞心臟持續(xù)釋放，以減輕炎癥。
1. 作者優(yōu)化了材料的組成，包括聚合物的濃度和分子量。該水凝膠在135秒內(nèi)形成原位凝膠，具有心臟組織生理模量(40.5 kPa)，合適的組織粘附性(4.3 kPa)，以及優(yōu)異的機(jī)械穩(wěn)定性。ANGPTL4從明膠/dex-ald水凝膠中持續(xù)釋放，明膠/dex-ald水凝膠可以方便地涂在跳動的心臟上并在體內(nèi)降解。
2. 體內(nèi)研究表明，含有ANGPTL4的水凝膠心臟貼片可顯著改善心臟組織修復(fù)。經(jīng)ANGPTL4水凝膠貼片處理的心臟組織血管化增加，炎癥巨噬細(xì)胞減少，心臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)成熟。該水凝膠系統(tǒng)具有易涂性、適當(dāng)?shù)慕M織粘連性和抗炎藥物的持續(xù)釋放，將成為修復(fù)各種組織的有效平臺，包括心臟、肌肉和軟骨。
相關(guān)論文“A paintable and adhesive hydrogel cardiac patch with sustained release of ANGPTL4 for infarcted heart repair”于2023年8月29日發(fā)表于雜志《Bioactive Materials》上。
圖1 可涂膠水凝膠的示意圖
1. 可涂水凝膠的設(shè)計(jì)與制備
使用明膠和葡聚糖作為基礎(chǔ)水凝膠材料，因?yàn)樗鼈兙哂泄逃械恼掣叫院蜕锵嗳菪?。將右旋糖酐修飾為dex-ald，它可以通過希夫反應(yīng)與明膠和心臟組織自發(fā)反應(yīng)，分別與心外膜形成共價水凝膠網(wǎng)絡(luò)和強(qiáng)粘連鍵，使水凝膠可以涂在左室心外膜上(圖1)。在明膠含量恒定(10%)的情況下，dex-ald的濃度在1%到5%之間變化?；旌狭现衐ex-ald含量越高，彈性模量增加越快，膠凝時間越短。此外，含有更多dex-ald的凝膠具有更高的模量(圖2A和B)。結(jié)果表明，密集存在于dex-ald鏈上的醛基與明膠中的胺基形成席夫堿鍵的接近性和反應(yīng)性有限，需要比胺基更大的醛含量才能形成網(wǎng)絡(luò)。明膠含量從2.5%到10%的變化，在恒定的dex-ald含量(5%)下，對凝膠化時間沒有實(shí)質(zhì)性影響(圖2C和D)。然而，明膠/dex-ald的彈性模量隨著明膠含量的增加而增加。此外，用不同分子量的葡聚糖(150 kDa、500 kDa和1.5 MDa)制備不同的葡聚糖前體和明膠/葡聚糖水凝膠。有趣的是，由dex-ald(由500 kDa葡聚糖氧化而成)和10%明膠組成的前體溶液形成凝膠的速度比其他溶液快(圖2E和F)。流變學(xué)研究表明，用dex-ald (500 kDa右旋糖酐)制備的水凝膠在1Hz下具有更高的存儲模量(G’)，為13.5±1.2 kPa，與凝膠時間相反(圖2G和H)。此外，通過將混合前驅(qū)體溶液以螺旋或直線的方式應(yīng)用于玻璃管上，驗(yàn)證了水凝膠的可注射性和可涂性。雙注射器注射后水凝膠保持穩(wěn)定不流動(圖2I)。SEM圖像顯示出孔徑為3.8±1.7μm的高孔隙結(jié)構(gòu)(圖2J)。
圖2 可涂明膠/dex-ald水凝膠的制備與表征
2. 明膠/dex-ald水凝膠的粘附性
作者目標(biāo)是開發(fā)一種不需要手術(shù)縫合并穩(wěn)定支持心外膜機(jī)械性能的粘性水凝膠心臟貼片。因此，研究了明膠/dex-ald 水凝膠的粘附特性（圖3）。將由10%明膠和5% dex-ald組成的水凝膠注射到組織片上，然后將另一個組織片覆蓋到水凝膠上（圖3A）。該水凝膠對豬心外膜和皮膚的界面粘合強(qiáng)度分別為4.2±0.3kPa和19.5±1.7kPa（圖3A和B）。此外，水凝膠粘合組織的循環(huán)伸長不會引起粘合強(qiáng)度的實(shí)質(zhì)性變化（圖3C），表明具有優(yōu)異的持久組織粘合力。在扭轉(zhuǎn)、彎曲和水沖洗等各種變形下，水凝膠仍牢固地附著在心外膜上（圖3D）。
圖3 可涂水凝膠的粘附性能
3. ANGPTL4從明膠/dex-ald水凝膠中釋放
由于ANGPTL4可以通過可逆席夫堿與dex-ald 發(fā)生化學(xué)鍵合，因此ANGPTL4具有高負(fù)載能力和持續(xù)釋放。將ANGPTL4與dex-ald溶液混合進(jìn)行偶聯(lián)，然后將其與明膠混合，得到負(fù)載ANGPTL4的水凝膠(A4/明膠/dex-ald)。使用Cy5共軛ANGPTL4負(fù)載的水凝膠檢測ANGPTL4從水凝膠中的釋放譜(圖4A)。A4/明膠/ dexald在早期孵育時間點(diǎn)表現(xiàn)出持續(xù)釋放的特征，沒有明顯的爆發(fā)釋放(圖4B)。ANGPTL4持續(xù)釋放，并在第7天達(dá)到飽和釋放，表明ANGPTL4在水凝膠內(nèi)保持穩(wěn)定。A4/明膠/dex-ald在酸性緩沖液(pH 5.8)中比在中性緩沖液(pH 7.4)中釋放ANGPL4更快。結(jié)果表明，酸性條件下，ANGPTL4與水凝膠基質(zhì)之間的席夫堿會逐漸失穩(wěn)，從而促進(jìn)ANGPTL4的釋放。由于心肌梗死心臟呈輕微酸性pH值，根據(jù)心肌梗死的嚴(yán)重程度，可能會誘導(dǎo)ANGPTL4的釋放(圖4C)。
圖4 A4/明膠/dex-ald水凝膠和明膠水凝膠中ANGPTL4的體外釋放
4. 明膠/dex-ald水凝膠體外細(xì)胞培養(yǎng)
通過在直接和間接培養(yǎng)模式下用明膠/dex-ald水凝膠培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞（CMs）來研究細(xì)胞相容性。LDH 測定顯示，在明膠/dex-ald水凝膠中培養(yǎng)的CM在長達(dá)7天的時間內(nèi)表現(xiàn)出優(yōu)異的細(xì)胞活力（圖5A）。此外，在Transwell插入物中以水凝膠作為間接接觸模式培養(yǎng)的CM具有高達(dá)7天的高活力 (>95%)（圖5B）?；?死染色表明，在帶有水凝膠的 Transwell 插入物中培養(yǎng)的CM與在組織培養(yǎng)板(TCP)上培養(yǎng)的CM之間的細(xì)胞活力沒有顯著差異（圖5C和D）。如圖5E所示，在培養(yǎng)第7天在水凝膠上培養(yǎng)的CM中觀察到α-肌動蛋白的高表達(dá)和獨(dú)特的肌節(jié)結(jié)構(gòu)。
圖5 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)
5. 明膠/dex-ald 的體內(nèi)可涂性和可降解性
使用活體大鼠檢查了明膠/dex-ald 水凝膠作為可涂心臟貼片的適用性。水凝膠成功覆蓋了整個左心室，包括梗塞區(qū)，并且在跳動心臟的左心室上保持完整（圖6A）。在處理后的第7天和第14天，通過收集心臟組織來檢測涂覆明膠/dex-ald水凝膠的體內(nèi)生物降解性(圖6B)，結(jié)果顯示涂覆的水凝膠逐漸降解。第7天和第14天，心臟上的初始貼片分別保留了46.6%和30.0%，這表明明膠/dex-ald貼片在體內(nèi)是可降解的。
圖6 明膠/dex-ald水凝膠在心臟上的可涂性和可降解性的體內(nèi)研究
6. 負(fù)載ANGPTL4的可涂水凝膠修復(fù)心臟
為了確定A4/明膠/dex-ald貼片是否能改善心肌梗死(MI)后的心功能，在心肌梗死后第14天用超聲心動圖測量了心室收縮力。假手術(shù)組、MI組、明膠/dex-ald水凝膠貼片的MI和A4/明膠/dex-ald水凝膠貼片的MI實(shí)驗(yàn)組如圖7A所示。代表性超聲心動圖顯示MI組左室尺寸增大，室間隔和后壁運(yùn)動減弱，而明膠/dex-ald和A4/明膠/dex-ald組減弱(圖7B)。與MI組相比，以EF和FS為特征的收縮功能障礙在明膠/dex-ald和A4/明膠/dex-ald組中均減弱（圖 7C）。FS(%)值顯示出與EF(%)相似的趨勢(圖7D)。A4/明膠/dex-ald組的EF(%)和FS(%)回收率優(yōu)于明膠/dex-ald組。結(jié)果表明水凝膠貼片（明膠/dex-ald和A4/明膠/dex-ald）對心臟功能恢復(fù)具有積極作用，并且A4的摻入進(jìn)一步改善了功能恢復(fù)。使用馬松三色染色分析MI誘導(dǎo)的纖維化疤痕形成（圖7E）。A4/明膠/dex-ald治療后纖維化面積顯著減少，小于MI和明膠/dex-ald組的纖維化面積（圖7F）。此外，在貼片治療組中，左心室壁厚度的減少有所減弱，其中負(fù)載A4的心臟貼片更有效（圖7G）。
圖7 明膠/dex-ald水凝膠心臟貼片對MI后心臟功能和重塑的影響
接下來，使用α-SMA和vWF免疫熒光染色確定了水凝膠貼片在血管生成中的作用。與MI和明膠/dex-ald組相比，A4/明膠/dexald 貼片治療顯著增加了新血管形成，特別是在邊緣區(qū)域（圖 8A）。A4/明膠/dex-ald貼片組中血管生成的增強(qiáng)可能歸因于ANGPTL4的促血管生成能力和炎癥的減少。此外，通過CD68（全巨噬細(xì)胞標(biāo)記物）和CD206（抗炎巨噬細(xì)胞標(biāo)記物）染色來評估巨噬細(xì)胞的類型和分布（圖8B）。結(jié)果表明，使用水凝膠心臟貼片局部遞送 ANGPTL4 可通過促進(jìn)抗炎和血管生成來有效誘導(dǎo)心臟修復(fù)途徑。
圖8 MI后2周大鼠心臟組織的代表性免疫熒光圖像
綜上，作者成功開發(fā)了生物相容性和粘附性水凝膠，能夠使用10%明膠和5% dex-ald通過希夫堿原位形成凝膠。這種水凝膠適用于心臟貼片，可以通過穩(wěn)定的組織粘附力而無需縫合而附著在心外膜上，為心肌梗死后有效的心臟修復(fù)提供組織般的柔軟度和機(jī)械支撐。此外，將組織再生因子ANGPTL4負(fù)載到明膠/dex-ald水凝膠上進(jìn)行局部持續(xù)遞送。負(fù)載ANGPTL4的水凝膠貼片改善了心肌梗死的功能恢復(fù)并防止病理組織重塑。免疫組織學(xué)分析表明，負(fù)載 ANGPTL4的水凝膠貼片增強(qiáng)了梗塞心肌中的血管生成并增加了抗炎巨噬細(xì)胞的數(shù)量。
文章來源：https://doi.org/10.1002/adfm.202307766
京公網(wǎng)安備11010802046783號
