膜是器官芯片(OOC)平臺的基本元素，因為它們?yōu)橘N壁細(xì)胞提供支持，允許營養(yǎng)物質(zhì)(和其他相關(guān)分子)通過膜孔滲透/交換，并實現(xiàn)機(jī)械或化學(xué)刺激的傳遞。通過OOC平臺，生理過程可以在體外研究，而OOC膜拓寬了機(jī)械和化學(xué)線索如何影響細(xì)胞和器官的知識。帶膜的OOC是體外微流控模型，用于各種應(yīng)用如藥物研發(fā)和疾病建模，或用于替代動物試驗。
來自墨西哥蒙特雷理工學(xué)院的Sergio O. Martínez-Chapa、Mohammad Mahdi Aeinehvand綜述了OOCs與膜的相關(guān)性，以及它們在不同器官模型中的支架和驅(qū)動作用、性質(zhì)(物理和材料)和制造方法。相關(guān)論文“Polymeric and biological membranes for organ-on-a-chip devices”于2023年8月29日發(fā)表于雜志《Microsystems & Nanoengineering》上。
首先描述了液體流動和循環(huán)應(yīng)變的機(jī)械刺激，以及它們對細(xì)胞產(chǎn)生的生理相關(guān)性(IPR)的影響；
其次，還包括合成和ECM(細(xì)胞外基質(zhì))蛋白膜的制備方法、它們的特性(例如，厚度和孔隙率可以根據(jù)應(yīng)用進(jìn)行調(diào)整)，以及用于其涂層的生物材料；
最后，討論并描述了膜在不同研究目的中的作用及其優(yōu)勢和挑戰(zhàn)。
1. 提高細(xì)胞生理相關(guān)性的相關(guān)力學(xué)條件
剪切力以及化學(xué)和機(jī)械信號不僅對細(xì)胞存活至關(guān)重要，而且還影響細(xì)胞活動，如細(xì)胞遷移、通過離子通道的質(zhì)量傳輸和蛋白質(zhì)構(gòu)象變化。如圖1所示，OOCs中生理流動和機(jī)械應(yīng)力的實現(xiàn)和組合對于闡明細(xì)胞相互作用及其對微環(huán)境的反應(yīng)至關(guān)重要，這與病理學(xué)研究越來越相關(guān)，因為更現(xiàn)實的生理環(huán)境(例如，全血灌流)能夠?qū)崿F(xiàn)更多的生理反應(yīng)(例如，患者來源的細(xì)胞培養(yǎng))。在以上方面，OOC上的膜作為支撐物、屏障或減震器間接調(diào)節(jié)細(xì)胞暴露于外力(剪切力、流體流動、機(jī)械刺激)。這一部分綜述了聚合物膜對OOCs的研究，其中討論了流體切應(yīng)力和機(jī)械驅(qū)動在不同組織培養(yǎng)中的影響。
圖1 膜介導(dǎo)細(xì)胞在流體剪切應(yīng)力和機(jī)械驅(qū)動下的機(jī)械感應(yīng)
（1）OOCs中的流體剪切應(yīng)力
流體剪切應(yīng)力(FSS)通過血液流動直接存在于體內(nèi)，在代謝物去除和觸發(fā)表型變化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在許多OOC中，連續(xù)的流體流動會去除代謝物，限制了與細(xì)胞的相互作用和攝取。盡管不利于藥物暴露研究，但這一特征導(dǎo)致抑制因子的去除，從而有助于細(xì)胞的生理相關(guān)性(IPR)、基因表達(dá)和細(xì)胞性能的提高。反過來，細(xì)胞IPR(例如，通過屏障功能所需的緊密連接)有助于限制成熟細(xì)胞中的物質(zhì)通透性。多孔膜會影響OOC內(nèi)的液體流動。Chung等人的研究基于膜的厚度和孔隙度計算了滲透率和流速分布。結(jié)果表明，從溶質(zhì)擴(kuò)散、流體流動和電流方面表征組織屏障的滲透性可以指導(dǎo)組織屏障和共培養(yǎng)模型的設(shè)計和評估。溶質(zhì)通透性是組織屏障緊密性和主動運(yùn)輸速率的指標(biāo)，可以通過示蹤分子的通透性來估計。另一方面，流體滲透性表明屏障形成成熟，組織屏障的一般漏性可以通過經(jīng)上皮/經(jīng)內(nèi)皮電阻(TEER)快速評估。因此，F(xiàn)SS在OOC內(nèi)創(chuàng)造了一個動態(tài)的微環(huán)境，與多孔膜等元素相互作用，使細(xì)胞更接近于器官水平的結(jié)構(gòu)和功能。
（2）創(chuàng)造一個動態(tài)的環(huán)境來促進(jìn)細(xì)胞的特化
剪應(yīng)力的相關(guān)性可以追溯到它對細(xì)胞機(jī)制的影響，細(xì)胞機(jī)制感知并響應(yīng)外部變化。例如，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞對FSS(例如，毛細(xì)血管樣剪應(yīng)力~6dynes/cm2)的反應(yīng)是通過增加細(xì)胞骨架蛋白的產(chǎn)生以及緊密連接和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來實現(xiàn)的。在腎臟，F(xiàn)SS(0.2-5dynes/cm2)有助于F-肌動蛋白的聚合和解聚，從而影響腎小管的形態(tài)和極化。FSS(0.002-0.03dynes/cm2)影響腸上皮細(xì)胞(如Caco-2細(xì)胞)的微絨毛形成和機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)。
剪切力通過刺激機(jī)械感應(yīng)蛋白F-肌動蛋白和絨毛蛋白，導(dǎo)致上皮刷狀邊界重組，這是腸道功能的基礎(chǔ)。如圖2a所示，Caco-2細(xì)胞的緊密連接在中等FSS(0.02dyn/cm2)時形成，但在低FSS(0.002 dyn/cm2)和高FSS(0.03dyn/cm2)時減少。高水平的FSS增加了空泡化(一種細(xì)胞應(yīng)激指標(biāo))，保護(hù)性粘液的產(chǎn)生，以及線粒體的活性，這是由于對ATP屏障完整性的依賴。FSS與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外刺激一起影響細(xì)胞特化，最終使FSS感應(yīng)產(chǎn)生反饋循環(huán)。
（3）應(yīng)用FSS技術(shù)研究細(xì)胞體外分化機(jī)制
當(dāng)使用OOC時，細(xì)胞暴露在FSS中，通常使用膜來提供支持，并通過毛孔實現(xiàn)營養(yǎng)擴(kuò)散。Shin等人進(jìn)行了一項研究，以闡明基底液和頂部液剪切力對培養(yǎng)在芯片上的腸道上皮細(xì)胞的影響。研究人員收集了在靜態(tài)Transwell中培養(yǎng)三天的Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)液，并將樣本流過芯片上腸管的底腔，同時保持頂腔上持續(xù)的液體流動，導(dǎo)致培養(yǎng)在芯片上的腸道中的Caco-2細(xì)胞的3D形態(tài)發(fā)生停止。此外，作者將一個三周的Caco-2單層膜轉(zhuǎn)移到由有機(jī)硅創(chuàng)建的混合流體設(shè)備中(圖2b，c)，僅對底部腔施加液體流動，在48小時內(nèi)觀察到三維形態(tài)發(fā)生。
圖2 微流控裝置中流體流動的相關(guān)性
（4）利用FSS更接近地模擬器官水平的功能
在這些研究中，模擬了多層器官，并通過同時接觸流體或FSS使膜兩側(cè)的細(xì)胞層分化。在OOCs中，細(xì)胞暴露于外部機(jī)械信號，如FSS和應(yīng)力/應(yīng)變，可以被調(diào)節(jié)以產(chǎn)生不同的特化特征，而膜可以使小室和細(xì)胞層之間的通信并提供支持，進(jìn)一步培育動態(tài)的封閉微環(huán)境。
2. 膜機(jī)械驅(qū)動
通過循環(huán)運(yùn)動對膜的機(jī)械刺激在生理上與經(jīng)歷呼吸的肺細(xì)胞、經(jīng)歷蠕動運(yùn)動的腸細(xì)胞或跳動的心臟細(xì)胞有關(guān)。機(jī)械刺激通常是通過膜兩側(cè)的一對側(cè)室的真空吸(圖3)或通過電產(chǎn)生的負(fù)壓來實現(xiàn)的。
圖3 OOC機(jī)械驅(qū)動
機(jī)械驅(qū)動也被證明影響細(xì)胞排列，這可能是由應(yīng)變避免機(jī)制或存在或不存在約束邊界條件(拉伸或約束)驅(qū)動的。在內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和成骨細(xì)胞中均存在應(yīng)變避免或垂直于施加的循環(huán)拉伸的方向。最后，除了支持和驅(qū)動外，OOC中的膜還可以保護(hù)組織免受非生理性剪切力的不利影響。例如，當(dāng)使用離心將hiPSC(人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞)衍生的心肌細(xì)胞裝入芯片時，膜限制了介質(zhì)模塊中的對流運(yùn)輸，而位于組織腔室的細(xì)胞保持活力和功能。
OOC中的FSS和機(jī)械驅(qū)動
復(fù)雜的機(jī)械條件，如FSS和機(jī)械刺激的結(jié)合，導(dǎo)致器官水平的結(jié)構(gòu)和功能的產(chǎn)生，更接近于在體內(nèi)觀察到的結(jié)構(gòu)和功能，從而允許重述復(fù)雜的機(jī)制。另一個例子是血管，由于跨壁壓力和血液流動摩擦產(chǎn)生的壁切應(yīng)力，血管在體內(nèi)經(jīng)歷周期性應(yīng)變。跨壁壓力導(dǎo)致血管壁擴(kuò)張(向各個方向變形)并改變剪應(yīng)力，而剪應(yīng)力在血流方向上起作用，這兩種力量都能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)芽并增加屏障功能。
3. 膜特性
細(xì)胞可以感知環(huán)境的變化，包括影響其黏附、形態(tài)、生長、交流和遷移過程的機(jī)械和化學(xué)變化/線索。要實現(xiàn)這種靈敏度，必須精確控制膜的特性，如硬度。硬度可以通過成分變化、表面形貌和厚度來調(diào)整，這可以通過微米和納米軟化來實現(xiàn)。用于開發(fā)用作細(xì)胞培養(yǎng)支架的膜的主要參數(shù)如圖4所示。
圖4 膜的特性可以調(diào)整來模擬體內(nèi)表面和促進(jìn)細(xì)胞特化
（1）硬度
基底硬度產(chǎn)生與ECM和粘附蛋白相關(guān)的不同基因表達(dá)模式，從而影響細(xì)胞活性。例如，當(dāng)在堅硬的表面上培養(yǎng)時，人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)更容易擴(kuò)散，表現(xiàn)出更穩(wěn)定的局灶粘附，并表現(xiàn)出更快的遷移和更高的增殖率。模擬大腦的軟基質(zhì)是神經(jīng)源性的，而更硬的、類似肌肉的支架是肌源性的，而堅硬的膠原基質(zhì)是成骨性的。
（2）形貌
膜的形貌特征包括多孔，孔狀結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)組織的粘附和聚集。例如，孔隙度使細(xì)胞遷移并增加表面積。膜的表面結(jié)構(gòu)可以是凸起或凹陷的，并根據(jù)幾何形狀或纖維影響接觸引導(dǎo)細(xì)胞?？梢酝ㄟ^納米球、微柱或提供錨點的納米顆粒對表面進(jìn)行修飾，暴露于FSS的細(xì)胞對具有凹槽形貌的膜表面具有更高的粘附性，因為它們與天然ECM相似。
（3）厚度
膜厚度影響細(xì)胞通訊、接觸，甚至影響組織結(jié)構(gòu)。商用膜和許多復(fù)制品模制的PDMS膜的厚度約為10μm，這阻礙了所需的凸起和通過孔的細(xì)胞類型之間的并置。體內(nèi)肺泡膜厚度為2.2 μm，胎盤厚度為4.53 μm，血管基膜厚度小于100 nm。
4. 合成聚合物膜的制造
（1）PDMS膜的制備方法
PDMS除了具有高彈性、光學(xué)透明性和生物相容性外，還具有高機(jī)械穩(wěn)定性、低化學(xué)反應(yīng)性和低導(dǎo)熱性，是一種彈性體和標(biāo)準(zhǔn)材料。然而，PDMS的組成和固有剛度與天然ECM有很大不同，影響了細(xì)胞的生長和粘附。此外，PDMS的疏水性阻礙了生物分子的附著和蛋白質(zhì)的吸附。
PDMS膜是一種多功能且有前途的OOCs元件，膜制造技術(shù)的最新發(fā)展為人體生理和疾病的體外研究創(chuàng)造了新的途徑。然而，傳統(tǒng)的PDMS微流控器件制造技術(shù)，包括軟光刻技術(shù)，可能存在諸如高成本和有限的可擴(kuò)展性等缺點。因此，為了克服這些限制，正在開發(fā)新的制造技術(shù)，包括靜電紡絲、表面改性、增材制造和模板。
軟光刻技術(shù)
亞微米特征是細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵，因為它們允許細(xì)胞間交流和物理接觸，而薄膜提高生物分子運(yùn)輸和營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)移率。由于傳統(tǒng)光刻的衍射限制(圖5，左)，很難生產(chǎn)孔徑和厚度小于5 μm的PDMS膜。用于制造硅模具的高分辨率光掩模(<2 μm)是可用的，但價格昂貴。無掩模激光直寫技術(shù)提供了克服這一限制的替代解決方案，并提供了關(guān)于微米級圖案設(shè)計和3D幾何的靈活性。聚乙烯醇(PVA)被用作PDMS結(jié)構(gòu)的犧牲層。Pensabene及其合作者提出了一種制造犧牲PVA納米針的方法，以制造用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)培養(yǎng)的聚L -乳酸(PLLA)膜。該方法使用飛秒激光加工形成具有1 μm直徑孔的硅晶片，然后涂上稱為Partall®Film #10的水/醇基PVA脫模劑(圖5，右)。
圖5 多孔膜的制作過程可分為以下幾個主要步驟：模具制作、減少附著的處理和膜制作
高壓飽和蒸汽形成孔隙
Jang和他的合作者通過高壓滅菌循環(huán)探索了高壓飽和蒸汽的孔隙形成。該方法結(jié)合溫度、壓力和濕度，產(chǎn)生微米級氣泡，一旦PDMS固化，這些氣泡就會變成孔隙(圖6)。該工藝減少了膜的厚度，從而增強(qiáng)了膜的物理性能，增加了楊氏模量、粗糙度和透氣性。
圖6 Jang等(2019)提出的高壓飽和蒸汽法制備多孔PDMS膜
替代方法:3D打印、靜電紡絲等
替代技術(shù)包括PDMS 3D打印和使用多孔素(如鹽和糖等可溶解顆粒)和用于微圖案的顆粒(玻璃微球)。Ozbolat及其合作者進(jìn)行的一項研究發(fā)現(xiàn)，與鑄造樣品相比，PDMS 3D打印改善了其機(jī)械性能(圖7)。
圖7 PDMS 3D打印改善了由于表面不均勻而導(dǎo)致的細(xì)胞粘附和擴(kuò)散
（2）蛋白質(zhì)和水凝膠膜涂層
本節(jié)介紹用于增強(qiáng)合成膜生物相容性或促進(jìn)細(xì)胞與底物相互作用的主要生物材料。重點放在普遍實施和良好表征的生物材料，如膠原蛋白，纖維連接蛋白和水凝膠。
OOC膜涂層中的蛋白質(zhì)
膠原蛋白和纖維連接蛋白是體外模擬細(xì)胞外基質(zhì)的兩種主要蛋白質(zhì)。Matrigel®是一種基于細(xì)胞外基質(zhì)的鼠源性水凝膠，由于其類似于上皮基底膜，因此是一種廣泛使用的基質(zhì)。蛋白質(zhì)可以作為單層或局部以特定形狀或圖案被覆在膜上。選擇性轉(zhuǎn)移通過微接觸打印(μCP)或微流體實現(xiàn)，并提供細(xì)胞(例如，心臟組織或肌肉纖維)通過改變方向和排列對其作出反應(yīng)的幾何線索。μCP蛋白質(zhì)圖案的大小可以低至0.5μm；然而，圖案的完整性取決于膜的特征大小和化學(xué)性質(zhì)，因為更大的特征和疏水表面呈現(xiàn)更強(qiáng)大的結(jié)合。Wright和他的合作者進(jìn)行的一項研究使用可重復(fù)使用的10 μm厚的對二甲苯-C模板在PDMS和聚苯乙烯上實現(xiàn)了纖維連接蛋白圖案(圖8)。
圖8 蛋白質(zhì)與細(xì)胞構(gòu)型
OOC膜涂層用水凝膠
水凝膠有效地模擬了ECM的化學(xué)成分和機(jī)械性能127，因此可以生物物理地刺激細(xì)胞分化和排列。水凝膠可以通過光刻和微圖像化、立體光刻、微成型、微流體粘指法和生物打印等方法進(jìn)行微制造。刺激響應(yīng)水凝膠可以通過pH值、溫度、離子強(qiáng)度和電場或磁場來驅(qū)動或定型。如聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PIPAAm)是一種熱響應(yīng)性水凝膠，由于其較低的臨界溶液溫度(LCST)，它可以開關(guān)其溶解度和聚集性；海藻酸、殼聚糖和透明質(zhì)酸（HA）等天然水凝膠具有生物相容性，例如，HA 具有CD44受體，當(dāng)與細(xì)胞結(jié)合時可產(chǎn)生細(xì)胞粘附力；半合成水凝膠，如甲基丙烯?；髂z（GelMA），含有天然和合成成分。明膠是膠原蛋白水解的產(chǎn)物，含有細(xì)胞粘附序列，如 RGD 和基質(zhì)金屬蛋白酶，細(xì)胞可通過這些序列粘附、增殖和擴(kuò)增。
5. 生物ECM蛋白膜
細(xì)胞外基質(zhì)在結(jié)構(gòu)上可分為兩部分，一部分是致密多孔的基底膜，由膠原蛋白 IV、纖連蛋白和層粘連蛋白等蛋白質(zhì)組成；另一部分是致密的親水性間質(zhì)，由蛋白聚糖和纖維狀（I 型）膠原組成。整合素是一種跨膜蛋白，可傳遞外部信號并經(jīng)歷構(gòu)象變化。整合素與ECM蛋白(膠原蛋白、纖維連接蛋白、層粘連蛋白)相互作用，并通過與細(xì)胞骨架的連接影響細(xì)胞形狀。一種實現(xiàn)原位制造的血腦屏障(BBB)芯片利用微流體實現(xiàn)了臨時殼聚糖膜，膜作為星形膠質(zhì)細(xì)胞的支撐，一旦星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)建立，去除膜，與星形膠質(zhì)細(xì)胞直接接觸的內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)(圖9e)。利用殼聚糖的pH響應(yīng)性，通過界面聚合制備膜。碳酸鹽(中性，pH 7.0)和磷酸鹽(堿性，pH 9.6)緩沖液在微流控裝置上共流動(圖9b)。殼聚糖膜在緩沖液之間的界面之間形成，注入碳酸鹽與殼聚糖接觸，碳酸鹽使殼聚糖質(zhì)子化并使其可溶。然后，殼聚糖接觸堿性磷酸鹽緩沖液時，通過去質(zhì)子化發(fā)生聚合。在膜的一側(cè)植入星形膠質(zhì)細(xì)胞后，通過醋酸溶液(pH 5.0)通過質(zhì)子化去除殼聚糖(圖9c, d)。
圖9 Tibbe等人(2018)原位殼聚糖膜制備
綜上，OOC中的膜有助于提供與細(xì)胞在體內(nèi)所經(jīng)歷的環(huán)境非常相似的環(huán)境，這些環(huán)境涉及機(jī)械因素，特別是剪切應(yīng)力和機(jī)械拉伸，或固有的材料特性，如剛度和形貌。本文綜述了不同膜的主要特性、作用和材料。PDMS是拉伸應(yīng)用和基因表達(dá)研究的首選材料，但通常需要蛋白質(zhì)涂層，含有蛋白質(zhì)的ECM膜可以長時間支持細(xì)胞生長并誘導(dǎo)更多的生理反應(yīng)。最佳的膜應(yīng)該由足夠薄的天然蛋白質(zhì)組成，以使細(xì)胞通信和/或接觸，而不犧牲機(jī)械刺激所需的靈活性。
文章來源：https://doi.org/10.1038/s41378-023-00579-z
京公網(wǎng)安備11010802046783號
