殘留的腫瘤細(xì)胞和骨組織缺損是臨床骨肉瘤治療的兩個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)。近日，上海大學(xué)陳雨教授、馮煒副研究員和山東大學(xué)齊魯醫(yī)院劉培來教授通過將MoO3−x亞納米線集成到3D打印生物活性玻璃支架上構(gòu)建自適應(yīng)功能組織工程支架，從而提出亞納米醫(yī)學(xué)概念。MoO3−x亞納米線是通過一鍋水熱法合成的，該方法在酸性腫瘤微環(huán)境中聚集，并與過氧化氫反應(yīng)產(chǎn)生活性氧，用于特定的化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療。而且它們可以在生理?xiàng)l件下快速降解而不引起毒性。此外，自適應(yīng)增強(qiáng)的光熱轉(zhuǎn)換使腫瘤靶向光熱治療，同時(shí)增強(qiáng)化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療。通過免疫印跡分析、共聚焦激光掃描顯微鏡觀察和mRNA轉(zhuǎn)錄組分析，Mo5+-Mo6+轉(zhuǎn)變使脂質(zhì)過氧化物積累和谷胱甘肽耗盡，從而導(dǎo)致谷胱甘肽過氧化物酶4蛋白失活和鐵死亡。所構(gòu)建的支架除了具有抗骨肉瘤的穩(wěn)健性外，還能刺激大鼠骨間充質(zhì)干細(xì)胞的分化和增殖，促進(jìn)骨缺損的成骨。因此，這種多功能支架不僅驗(yàn)證了亞納米醫(yī)學(xué)的概念，而且為骨組織工程提供了一個(gè)很有前途的臨床策略。
相關(guān)研究?jī)?nèi)容以“Self-Adaptive MoO3−x Subnanometric Wires Incorporated Scaffolds for Osteosarcoma Therapy and Bone Regeneration”為題于2023年9月8日發(fā)表在《Advanced Functional Materials》。
圖1 MoO3−x-BG支架和相應(yīng)的PTT增強(qiáng)CDT聯(lián)合抗骨肉瘤并促進(jìn)成骨的構(gòu)建過程示意圖
亞納米線（SNWs）是一類新興的具有機(jī)械靈活性的一維（1D）亞納米材料（SNMs），具有高度高效的能量轉(zhuǎn)換和優(yōu)異的催化活性。在此，本研究報(bào)道了一個(gè)自適應(yīng)功能治療平臺(tái)，該平臺(tái)將合理設(shè)計(jì)的MoO3−xPOM亞納米線（MoO3−xSNWs）集成到3D打印生物活性玻璃（BG）支架上，表示為MoO3−x-BG支架，用于骨肉瘤（OS）治療和成骨（圖1）。
圖2 MoO3−xSNWs的表征
掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）圖像顯示，MoO3−xSNWs為典型的線狀結(jié)構(gòu)（圖2a、b）。線狀結(jié)構(gòu)的高分辨率透射電子顯微鏡（HRTEM）圖像顯示晶格間距為0.35nm（圖2c）。對(duì)MoO3−xSNWs的高角環(huán)形暗場(chǎng)圖像、特征元素映射和相應(yīng)的能量色散X射線光譜分析顯示，Mo和O的比例分布良好（圖2d、f）。TEM觀察發(fā)現(xiàn)較長(zhǎng)的攪拌時(shí)間導(dǎo)致卷繞結(jié)構(gòu)（圖2e）。X射線光電子光譜（XPS）顯示其表面的化學(xué)成分和狀態(tài)，其中Mo、O和C在全測(cè)量掃描中顯示（圖2g）。Mo 3d的高分辨率XPS譜顯示，235.18和232 eV的結(jié)合能與Mo6+的存在有關(guān)，而233.8和230.8 eV的結(jié)合能與Mo5+的存在有關(guān)（圖2h）。在O 1s光譜中，在531.36 eV處的峰值歸因于氧缺陷（圖2i）。MoO3−xSNWs的獨(dú)特結(jié)構(gòu)與氧缺陷的不對(duì)稱分布密切相關(guān)（圖2j）。傅里葉變換紅外光譜鑒定了MoO3−xSNWs的結(jié)構(gòu)（圖2k）。MoO3−xSNWs的典型衍射峰被很好地索引到標(biāo)準(zhǔn)的α-MoO3六邊形PDF卡（圖2l）。MoO3−xSNWs的拉曼光譜如圖2m所示。
圖3 MoO3−xSNWs的化學(xué)動(dòng)力學(xué)性能
1,3-二苯異苯并呋喃（DPBF）是一種黃色的1O2指示劑，與1O2反應(yīng)后褪色（圖3a）。DPBF與H2O2和MoO3−xSNWs孵育30 min后，455 nm處的特征吸收峰下降（圖3b）。電子自旋共振（ESR）光譜證實(shí)1O2的產(chǎn)生（圖3c），其中2,2,6,6-四甲基哌啶（a 1O2捕獲劑）與H2O2和MoO3−xSNWs反應(yīng)，顯示一個(gè)1：1：1的特征信號(hào)峰。當(dāng)溫度升高到37℃后，信號(hào)逐漸增強(qiáng)，表明1O2的產(chǎn)率隨溫度的升高而增加。以3，3′，5，5′·-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）作為·OH指標(biāo)，評(píng)價(jià)·OH的產(chǎn)量（圖3d）。隨著濃度的增加，在650 nm處的特征吸光度峰的強(qiáng)度顯著增加（圖3e）。使用5,5-二甲基-1-吡咯烷n-氧化物作為自旋陷阱，通過ESR定性地確認(rèn)了·OH的產(chǎn)生（圖3f）。與其他基團(tuán)相比，（GSH +H2O2+MoO3−xSNWs）組在412 nm處的吸收峰明顯較低（圖3h），說明MoO3−xSNWs介導(dǎo)的催化反應(yīng)可以耗盡GSH。因此可以合理地推斷，MoO3−xSNWs中的Mo5+與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生·OH和1O2，而產(chǎn)生的Mo6+消耗GSH產(chǎn)生氧化谷胱甘肽（圖3j）。為了評(píng)估其穩(wěn)定性和生物降解性，將MoO3−xSNWs分散在不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液中（圖3i）。
圖4 MoO3−x-BG支架的組成特性和光熱性能
獲得的支架表現(xiàn)出設(shè)計(jì)良好、均勻交錯(cuò)的微觀結(jié)構(gòu)，隨著MoO3−xSNWs濃度的增加，藍(lán)色逐漸變暗（圖4a1-d1）。SEM圖像顯示，BG支架表現(xiàn)出良好的大孔和粗糙的表面（圖4b2-d2），MoO3−xSNWs修飾賦予BG支架光滑的表面（圖4b2、d4）。相應(yīng)的元素映射圖像證實(shí)Mo、O、Si和Ca的分布均勻（圖4b），表明支架與MoO3−xSNWs的成功整合。在808 nm激光照射下，溫度隨時(shí)間顯著增加，且呈劑量和功率密度依賴性（圖4d-g）。純BG的溫度變化可以忽略不計(jì)（圖4d），說明MoO3−xSNWs的存在可以有效地、快速地將NIR光轉(zhuǎn)化為熱能。MoO3−x-BG支架的光熱性能在5次激光開/關(guān)照射周期后的衰退可以忽略不計(jì)（圖4h），從而確定光熱學(xué)穩(wěn)定性。MoO3−x-BG支架的光熱轉(zhuǎn)換效率為52.5%（圖4i），表明它們具有用于后續(xù)光熱癌消融的潛力。
圖5 在體外，通過MoO3−xSNWs進(jìn)行PTT增強(qiáng)的血流動(dòng)力學(xué)治療（CDT）
在人成骨肉瘤（KHOS）細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞研究MoO3−xSNWs的細(xì)胞相容性（圖5a），即使在500gmL−1的高濃度下處理24 h后，其細(xì)胞毒性可以忽略不計(jì)。隨后使用MoO3−xSNWs研究了體內(nèi)PTT增強(qiáng)的CDT（圖5b），結(jié)果表明PTT可以促進(jìn)CDT的殺傷作用。使用鈣綠素乙酰甲酯（綠色）和碘化丙啶（PI 紅色）染色活/死亡細(xì)胞，確定MoO3−xSNWs介導(dǎo)和PTT增強(qiáng)的CDT的顯著治療效果（圖5c）。MoO3−xSNWs+H2O2處理后的細(xì)胞凋亡率為22.1%，在激光照射下進(jìn)一步上升至32.4%（圖5e），表明加熱可促進(jìn)治療效果。為了研究其殺傷機(jī)制，采用2,7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA，綠色）試驗(yàn)，通過共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）來驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)ROS的生成（圖5d）。根據(jù)蛋白印跡分析（圖5f），MoO3−xSNWs+H2O2組的GPX4表達(dá)量明顯低于H2O2和MoO3−xSNWs+H2O2組，而MoO3−xSNWs+H2O2組的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于H2O2組。KHOS細(xì)胞在對(duì)照組、NIR和MoO3−xSNWs組中表現(xiàn)出強(qiáng)烈的紅色和弱綠色熒光（圖5h），從而表明脂質(zhì)過氧化作用（LPO）的生成最少。
圖6 MoO3−xSNWs介導(dǎo)協(xié)同治療后的KHOS細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析
根據(jù)火山圖和熱圖（圖6），協(xié)同治療組較對(duì)照組共鑒定出約690個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），其中485個(gè)上調(diào)基因，205個(gè)下調(diào)基因，主要與炎癥調(diào)節(jié)和應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。如維恩圖所示，690個(gè)DEGs涉及鐵死亡、凋亡、腫瘤壞死因子信號(hào)通路和核因子-kappaB信號(hào)通路（圖6b），證實(shí)MoO3−xSNWs治療可緩解氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、鐵死亡和炎癥。篩選690個(gè)DEGs進(jìn)行KEGG分析，結(jié)果顯示在MoO3−xSNWs介導(dǎo)的協(xié)同治療中，這四種信號(hào)通路與鐵死亡、凋亡和炎癥顯著相關(guān)。這37個(gè)相關(guān)功能基因的和弦圖表明，MoO3−xSNWs在OS治療過程中發(fā)揮鐵死亡和炎癥調(diào)節(jié)因子的作用（圖6f）。通過蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析從4個(gè)通路中基因與DEGs的交叉點(diǎn)中獲得的37個(gè)相關(guān)功能基因（圖6g），發(fā)現(xiàn)與主要蛋白相連的鄰近蛋白涉及PTGS2、CXCL1家族和MAP3K14，這是鐵死亡和炎癥的關(guān)鍵調(diào)控蛋白。綜上結(jié)果表明，MoO3−xSNWs+H2O2+ NIR治療可以調(diào)控與鐵死亡、細(xì)胞凋亡和炎癥調(diào)控相關(guān)的基因表達(dá)模式。
圖7 MoO3−x-BG支架的CDT抗腫瘤作用
由于其具有良好的體外抗腫瘤效果，接下來研究其對(duì)OS的體內(nèi)治療性能（圖7a）。MoO3−x-BG支架+ NIR激光組在5 min內(nèi)的腫瘤溫度從33.2°C迅速增加到64.9°C，而NIR激光組的溫度變化可以忽略不計(jì)（圖7b、c）。MoO3−x-BG+NIR組以100%的抑制率完全消除腫瘤（圖7d-k）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證抗腫瘤療效，收集所有組的腫瘤切片進(jìn)行病理評(píng)估（圖7l）。分別采用H&E染色、TUNEL和Ki-67抗體染色方法評(píng)估腫瘤組織的壞死/凋亡和細(xì)胞增殖活性。H&E染色結(jié)果顯示MoO3−x-BG+NIR激光組有大量OS細(xì)胞壞死。TUNEL圖像顯示，MoO3−x-BG+NIR激光組的凋亡細(xì)胞多于其他各組，從而驗(yàn)證其有效性。Ki-67染色圖像顯示，MoO3−x-BG+NIR激光組在四組中OS細(xì)胞增殖最少，表明癌細(xì)胞的增殖受到顯著抑制。GPX4的免疫組化分析顯示，MoO3−x-BG+NIR激光組中GPX4的表達(dá)下調(diào)。
圖8 成骨生物活性的體內(nèi)外成骨生物活性評(píng)價(jià)
CLSM圖像顯示不同處理后的成骨蛋白，即1型膠原蛋白（COL1）、骨鈣素（OCN）、骨橋蛋白（OPN）和runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）的表達(dá)（圖8a）。MoO3−x-BG組的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于Ctrl組和BG組，從而驗(yàn)證MoO3−x-BG支架可以促進(jìn)rBMSC的增殖。MoO3−x-BG支架組中成骨蛋白COL 1、OPN、RUNX2和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）的表達(dá)水平均顯著高于其他各組（圖8b），從而進(jìn)一步證實(shí)MoO3−x-BG支架的成骨特性。與其他組不同，MoO3−x-BG支架組促進(jìn)成骨相關(guān)基因的表達(dá)（圖8c），證明MoO3−x-BG支架具有理想的成骨分化能力。在孵育21天后，MoO3−x-BG支架組比Ctrl和BG組含有更多的鈣結(jié)節(jié)（圖8d）。采集的顱骨顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描（micro-CT）重建圖像直接證實(shí)缺損區(qū)域的新骨形成（圖8e），MoO3−x-BG支架組在第3周從邊緣擴(kuò)展至顱骨缺損區(qū)中心，到第6周時(shí)幾乎看不見空洞。接下來進(jìn)行組織學(xué)和免疫組化染色，以進(jìn)一步評(píng)估顱骨修復(fù)的療效（圖8f），結(jié)果提示MoO3−x-BG支架促進(jìn)骨組織形成，膠原纖維生成及成骨基因表達(dá)。
本研究通過設(shè)計(jì)具有強(qiáng)大物理化學(xué)性質(zhì)和獨(dú)特生物效應(yīng)的多功能亞納米生物材料，將亞納米醫(yī)學(xué)的概念引入到生物材料的設(shè)計(jì)和工程中。本研究構(gòu)建一個(gè)基于3D打印MoO3−x-BG支架的自適應(yīng)多功能工程平臺(tái)，用于OS治療和成骨。作為一種基于Mo的POMs，MoO3−xSNWs不僅具有優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換效率，而且具有pH和氧化還原響應(yīng)性。腫瘤內(nèi)MoO3−xSNWs和還原劑GSH之間的氧化還原反應(yīng)導(dǎo)致GSH的消耗。同時(shí)，Mo6+還原為Mo4+，隨后Mo4+氧化為Mo5+，分別通過羅素機(jī)制和芬頓樣反應(yīng)與H2O2反應(yīng)，觸發(fā)了1O2和·OH的形成，而GPX4的表達(dá)下調(diào)。因此，LPO由于ROS爆發(fā)、GSH耗盡和GPX4失活而增強(qiáng)，從而導(dǎo)致鐵死亡。MoO3−x-BG支架結(jié)合光子熱療與ROS觸發(fā)的鐵死亡，對(duì)OS表現(xiàn)出良好的治療效果。更重要的是，工程設(shè)計(jì)的MoO3−x-BG支架促進(jìn)rBMSC的分化和增殖，從而加速新生骨的再生。
文章來源：https://doi.org/10.1002/adfm.202304163
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