在色譜分析過程中常常需要使用緩沖鹽來調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，緩沖鹽的不當(dāng)使用對(duì)色譜柱可能造成柱壓升高、柱效下降以及使化合物的保留時(shí)間發(fā)生變化等影響，緩沖鹽使用不當(dāng)對(duì)色譜柱的影響及解決辦法。
緩沖鹽是指對(duì)pH有緩沖能力的鹽，能夠讓pH維持在一個(gè)恒定的數(shù)值。
何時(shí)應(yīng)用緩沖鹽
樣品或樣品中需研究的關(guān)鍵雜質(zhì)有離子化傾向，其他特定少數(shù)情況另行敘述。
存在較強(qiáng)離子化傾向的組分，其中一部分是分子狀態(tài)，與反相色譜固定相結(jié)合的更好；另一部分是離子狀態(tài)，更親和于流動(dòng)相。如不使用緩沖鹽控制其電離狀態(tài)，即分子狀態(tài)和離子狀態(tài)的比例，很容易出現(xiàn)峰拖尾分叉變形的情況。這種情況下一般就不應(yīng)該使用水/有機(jī)相系統(tǒng)作為流動(dòng)相，應(yīng)選用緩沖鹽/有機(jī)相系統(tǒng)。
常見的緩沖鹽有哪些
緩沖鹽類型的選擇，主要取決于所需要的緩沖能力，在反向色譜中，流動(dòng)相中水相的pH和離子強(qiáng)度在開發(fā)對(duì)條件微小變化不敏感的耐用方法中非常重要。對(duì)于離子型化合物，典型的樣品的保留隨pH改變而明顯變化。通常在pH2到4條件下，保留時(shí)間對(duì)pH的微小改變穩(wěn)定性最高。因此建議將這一pH范圍作為大多數(shù)樣品方法開發(fā)的起始pH，包括堿性化合物和一般的弱酸。緩沖鹽溶液的pH值越接近其pka，緩沖能力越強(qiáng)。一般緩沖鹽溶液的pH值應(yīng)在其pka±1的范圍內(nèi)。
比起單純的酸堿，鹽類，特別是具有緩沖能力的鹽類可以很好的控制流動(dòng)相的pH值，根據(jù)不同緩沖鹽中兩種鹽的配比，可以很容易的配置出一定pH的緩沖溶液。
1、甲酸鹽
通常在液相色譜中常用的甲酸鹽都是甲酸銨，這類鹽的溶解度好，完全兼容液質(zhì)聯(lián)用的方法，對(duì)色譜柱的傷害也比較小，但是缺點(diǎn)是離子強(qiáng)度比較低，另外就是甲酸鹽比較容易吸潮，稱量的時(shí)候比較困難，在流動(dòng)相里還可能揮發(fā)。與甲酸配合，可以得到甲酸-甲酸銨緩沖體系，大概緩沖能力在pH3～4.5的范圍之內(nèi)，只要調(diào)節(jié)兩者濃度的比例即可。
2、乙酸鹽
常見為乙酸銨，在使用上，和甲酸鹽十分類似，離子強(qiáng)度也不高，與乙酸配合的乙酸-乙酸銨緩沖體系pH的控制能力在pH4～5.5左右。
3、磷酸鹽
常用的是磷酸的鈉鹽和鉀鹽，二者對(duì)pH的控制能力十分接近，只是離子強(qiáng)度稍有差異，絕大多數(shù)情況下是可以互換使用的，磷酸由于是多元酸，能夠形成一氫鹽和二氫鹽，所以使用磷酸緩沖體系調(diào)節(jié)pH也是組合比較多，跨度比較大的，并且可以提供較高的離子強(qiáng)度，可惜，磷酸鹽流動(dòng)相體系無法兼容質(zhì)譜，并且對(duì)色譜柱損傷較大。
以磷酸鈉鹽為例，可以有以下兩種組合的緩沖體系：磷酸-磷酸二氫鈉：pH可以達(dá)到1.2～3.1左右的范圍；磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉：pH可以達(dá)到6.5～8左右的范圍。
上述的緩沖對(duì)能調(diào)節(jié)的pH范圍指的都是在保持緩沖能力的范圍之內(nèi)，如果僅僅是調(diào)節(jié)pH的話，范圍還可以再擴(kuò)展一些。
緩沖鹽使用不對(duì)產(chǎn)生的影響
1、柱壓升高
原因：緩沖鹽使用不當(dāng)導(dǎo)致緩沖鹽析出，堵塞塞板和鍵合相顆粒之間的孔隙，阻礙流動(dòng)相傳質(zhì)，引起柱壓升高。
2、相同化合物的保留時(shí)間發(fā)生變化
原因：如果沒有沖洗干凈就進(jìn)行進(jìn)樣，色譜柱內(nèi)含有的鹽會(huì)使化合物的保留時(shí)間發(fā)生變化。
3、柱效下降
原因：
1）有些緩沖鹽會(huì)滲入到鍵合相的深處，損害硅膠基體，導(dǎo)致色譜柱鍵合相流失，柱床變松，柱效下降；
2)凝結(jié)在鍵合相表面，使C18碳鏈難以舒展，對(duì)物質(zhì)的保留能力下降，導(dǎo)致柱效下降。因此用過緩沖鹽后需要對(duì)色譜柱進(jìn)行沖洗，水中緩沖鹽濃度較大時(shí)應(yīng)特別引起注意。
緩沖鹽的正確使用方法
1、使用前的處理：在使用緩沖鹽作流動(dòng)相之前需要用不含緩沖鹽的流動(dòng)相沖洗色譜柱，直至基線平穩(wěn)。原則上，用于沖洗的流動(dòng)相與分析時(shí)所用的流動(dòng)相含水的比例相同(或含水更多)，不同的只是用于沖洗用的流動(dòng)相中不含緩沖鹽。
理由：緩沖鹽通常易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑。用含緩沖鹽的(特別是做流動(dòng)相的水為飽和的緩沖鹽溶液時(shí))流動(dòng)相進(jìn)行分析時(shí)，如果分析前色譜柱中用于保存色譜柱的流動(dòng)相中含水的比例相對(duì)較小，不先沖洗掉，接下來做樣品的時(shí)候所用的流動(dòng)相中如果有機(jī)溶劑含量大，而其比例中所含的水又不足以溶解該緩沖鹽時(shí)，緩沖鹽將會(huì)在色譜柱柱體上析出，沉積下來，這將可能導(dǎo)致上述對(duì)色譜柱的損害。
2、使用后的處理：用與分析時(shí)含水比例相同的流動(dòng)相(與分析用流動(dòng)相唯一的區(qū)別是，用于沖洗的流動(dòng) 相不含緩沖鹽)進(jìn)行沖洗約30min，直至基線平穩(wěn)。如果該色譜柱在接下來很長的一段時(shí)間內(nèi)不使用，要長期保存，則需再加上一步，即用純的有機(jī)溶劑沖洗一遍，直至基線平穩(wěn)。
用與分析時(shí)含水比例相同的流動(dòng)相(與分析用流動(dòng)相唯一的區(qū)別是，用于沖洗的流動(dòng)相不含緩沖鹽)進(jìn)行沖洗約30min，直至基線平穩(wěn)。如果該色譜柱在接下來很長的一段時(shí)間內(nèi)不使用，要長期保存，則需再加上一步，即用純的有機(jī)溶劑沖洗一遍，直至基線平穩(wěn). 緩沖液可以提供離子平衡的反離子，并使流動(dòng)相保持一定的離子強(qiáng)度和ph值，減少拖尾。
使用緩沖液要注意幾點(diǎn)
1、避免使用鹽酸鹽，鹽酸鹽對(duì)鋼質(zhì)有腐蝕作用。
2、緩沖液最好要現(xiàn)配現(xiàn)用，往往緩沖液是良好的菌類培養(yǎng)液，隔天或放置長時(shí)間實(shí)驗(yàn)時(shí)會(huì)有很多怪現(xiàn)象發(fā)生。
3、實(shí)驗(yàn)后不可用有機(jī)溶劑直接過度，有機(jī)溶劑會(huì)處使鹽類析出，造成液路或色譜柱堵塞，可用95：5的水甲醇沖洗。
4、使用緩沖液要及時(shí)掌握ph范圍，做到胸中有數(shù)。
5、清洗液路和柱子時(shí)，有溫控可加熱到30攝氏度易于沖洗。
6、長時(shí)間用緩沖溶液要注意觀察接頭處有無析出，若有白色鹽類析出，可考慮一定周期用10%硝酸沖洗一下液路(拆下柱子，走30ml，再用5倍水沖洗)可以避免液路的堵塞。
7、選擇緩沖液要用可靠的試劑，避免不純的鹽類造成不必要的麻煩。
如果流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的比例很高是不能用來沖洗緩沖鹽的，是洗不出來的。通常C18柱先用5%~10%的甲醇沖洗，是可以把緩沖鹽沖洗出來的，然后用純的有機(jī)溶劑來保護(hù)柱子。最好的方法是使用與流動(dòng)相相同濃度不含鹽的流動(dòng)相進(jìn)行清洗。但就是速度慢一些。用水是為了快速替換，一般在15分鐘以內(nèi)最好，且用0.8的流速較好. 如果用純水沖，容易造成鍵合的碳鏈的流失，最好用5%~10%甲醇水溶液沖. 可以用純水代替流動(dòng)相中的緩沖液，有機(jī)相不變。這樣沖洗柱子比較穩(wěn)妥。
流動(dòng)相流速的選擇
因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。當(dāng)選用最佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。
注意：
a.由于甲醇廉價(jià)，對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場(chǎng)合除外)。
b.對(duì)于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相，沒有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。
c.含水流動(dòng)相在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過夜。最好加入疊氮化鈉，防止細(xì)菌生長。
d.流動(dòng)相要求使用0.45µm濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。
e.使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。
小結(jié)
正確使用緩沖鹽很有必要，既可以防止緩沖鹽析出，也可以達(dá)到提高色譜柱使用壽命的目的。我們不妨用一句話來總結(jié)它的使用方法：用前要過濾，用后需沖洗。
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