隨著納米載體藥物類型的不斷增加，載體中包封藥物的形式及游離藥物的形式多樣化，檢測(cè)包封率的方法也趨于多樣化。本篇就接觸過的一些納米載體藥物類型，對(duì)載體中的包封藥物形式、游離藥物形式及包封率的檢測(cè)方法做一個(gè)歸納，并對(duì)包封及游離存在形式的推斷、證明、包封率方法的選擇及自身工作中的一些問題做一個(gè)反思。
納米載體藥物類型（以結(jié)構(gòu)劃分）及相關(guān)結(jié)構(gòu)：
納米載體藥物的結(jié)構(gòu)大體分為五種：
（a）、載體邊緣形成一層薄薄的外殼，內(nèi)部為實(shí)心填充物，藥物溶解于內(nèi)部的填充物或與之以共價(jià)鍵或其他形式結(jié)合。
（b）、載體外殼與內(nèi)部填充物為不同的兩相或內(nèi)部無填充，藥物溶解于內(nèi)部填充物或與之結(jié)合或直接吸附于載體外殼的內(nèi)表面。
（c）、載體外殼與內(nèi)部填充物為不同的兩相，藥物溶解于外殼中或與之結(jié)合。
（d）、載體呈現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)或多囊結(jié)構(gòu)，藥物吸附于孔隙中或溶解/結(jié)合于囊內(nèi)填充物。
（e）、藥物載體是由單個(gè)片段堆積而成，每個(gè)片段均攜帶一定的藥物，片段與片段間通過鍵合或吸附作用形成一個(gè)單獨(dú)整體，該結(jié)構(gòu)不存在明確界限的外殼。（結(jié)構(gòu)示意圖詳見圖1）
圖1 納米載體藥物結(jié)構(gòu)類型[1]
載體中包封藥物與游離藥物的存在形式：
包封藥物的存在形式與藥物在填充物中的溶解度有一定關(guān)系。當(dāng)填充物能夠全部溶解藥物時(shí)，藥物大多以溶解狀態(tài)存在；當(dāng)填充物不能完全溶解藥物時(shí)，部分藥物以溶解狀態(tài)存在，部分藥物與填充物形成聚集體或者藥物直接以晶體的形式嵌合在填充物內(nèi)。游離藥物的存在形式主要有兩種：（1）藥物直接溶解在載體外相，（2）藥物以晶體的形式懸浮在載體外相中。
包封率檢測(cè)方法匯總：
目前常用的包封率檢測(cè)方法有：低速離心法、超速離心法、超濾離心法、葡聚糖凝膠柱法、微柱離心法、透析（反透析）法、絮凝離心法、魚精蛋白凝聚法和固相萃取法等。其中超速離心法、超濾離心法是目前最常用的兩種方法，葡聚糖凝膠柱法、微柱離心法和魚精蛋白凝聚法常用于脂質(zhì)體的包封率檢測(cè)。
以上方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，針對(duì)不同的納米載體藥物類型和不同的包封藥物、游離藥物存在形式，有時(shí)候一種方法無法完全說明其分離的完全性，往往需要用其他方法加以佐證或用其他指標(biāo)說明其適用性。下面就納米載體藥物結(jié)構(gòu)剖析、包封及游離藥物存在形式推斷和包封率方法的選擇做一個(gè)簡(jiǎn)單分析。
不同的輔料組成、不同的工藝導(dǎo)致了納米載體藥物的結(jié)構(gòu)差異。首先對(duì)納米載體藥物的種類做一個(gè)大的劃分：如現(xiàn)在市面上存在的脂質(zhì)體、脂肪乳、膠束、微球、脂質(zhì)納米顆粒、白蛋白納米顆粒、水凝膠等；其次對(duì)納米載體藥物的結(jié)構(gòu)類型進(jìn)行判斷（如：脂質(zhì)體和脂肪乳可能為上述的構(gòu)型（b）或構(gòu)型（c），多囊脂質(zhì)體和微球可能為上述的構(gòu)型（d），脂質(zhì)納米顆?？赡転樯鲜龅臉?gòu)型（a）），往往一種納米載體藥物中會(huì)存在一個(gè)或多個(gè)構(gòu)型（普遍存在多個(gè)構(gòu)型）。在上述基礎(chǔ)上，需要對(duì)存在構(gòu)型的基本特性（如載體外層的親水親脂性、載體是硬顆粒還是可變形顆粒、載體在配伍時(shí)的形態(tài)等）進(jìn)行一次分析，這決定了包封率方法的初次粗篩結(jié)果（大多數(shù)硬顆粒載體可以通過低速離心法和超速離心法檢測(cè)包封率）。接下來需要對(duì)包封及游離藥物的存在形式進(jìn)行推斷，這需要從輔料的組成、藥物的親水親脂性、載體內(nèi)外相的輔料成分進(jìn)行分析：（1）分析藥物在各種輔料中的溶解情況，初步判斷藥物主要溶解在哪個(gè)輔料中；（2）各輔料中溶解藥物的總量是否超過處方量，初步判斷藥物是否絕大部分以溶解狀態(tài)存在；（3）主要溶解藥物的輔料在載體中的哪一部分（外殼、內(nèi)部填充物或載體外相）；這其中存在一個(gè)問題：未溶解藥物的存在形式該如何判斷？就該問題，目前已經(jīng)找到幾種方法：1、顯微觀察，當(dāng)未溶解藥物以晶體的形式存在時(shí)，可明顯觀察到晶體的存在；2、小角度XRD，當(dāng)未溶解藥物以晶體形式嵌在載體內(nèi)或以共聚物形式存在時(shí)，可明顯觀察到其與空白載體的差異；3、DSC，未溶解藥物的存在會(huì)使得乳液的相變溫度發(fā)生明顯的改變。經(jīng)過上述包封及游離藥物存在形式的判斷，對(duì)包封率方法進(jìn)行二次初篩：當(dāng)有藥物晶體存在時(shí)，超速離心法、超濾離心法、絮凝離心法基本不適用，因其無法有效分離游離藥物晶體與載體顆粒；當(dāng)藥物為全溶狀態(tài)及可少量溶于水時(shí)，大多數(shù)方法均適用，固相萃取法不適用，因藥物兼具親水親脂兩種特性，無法選擇非常合適的溶劑對(duì)固相萃取柱進(jìn)行沖洗使包封與游離藥物達(dá)到完全分離。在經(jīng)過上述兩次方法初篩后，基本確定分離包封與游離藥物的方向。
對(duì)于具體的包封率方法選擇，本文就鹽酸多柔比星的兩種不同構(gòu)型載體（脂質(zhì)體和PCL納米顆粒）為例進(jìn)行一個(gè)簡(jiǎn)單剖析。
鹽酸多柔比星脂質(zhì)體的關(guān)鍵輔料成分有氫化大豆磷脂酰膽堿（HSPC）、膽固醇、培化磷脂酰乙醇胺（MPEG-DSPE），這些成分共同形成脂質(zhì)體的膜結(jié)構(gòu)；鹽酸多柔比星通過硫酸銨梯度法（主動(dòng)載藥）進(jìn)入到空白脂質(zhì)體的內(nèi)水相，形成多柔比星硫酸鹽[2]。鹽酸多柔比星具有親脂和親水的雙重特性，未包封于脂質(zhì)體中的鹽酸多柔比星溶解在外水相中。基于上述分析，可初步判斷出兩個(gè)不適用的包封率方法：1、低速離心法：由于游離藥物溶解在外層水相中，脂質(zhì)體顆粒的粒徑較小，較低的離心力很難使其沉降，包封藥物與游離藥物無法有效分離。2、超速離心法：超高的離心力可以時(shí)脂質(zhì)體顆粒沉降，但脂質(zhì)體顆粒是柔性可變形顆粒，過高的離心力使得脂質(zhì)體的完整性被破壞，內(nèi)部包封的藥物外泄，導(dǎo)致測(cè)得的包封率結(jié)果偏低。有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)可使用固相萃取法檢測(cè)鹽酸多柔比星脂質(zhì)體的包封率及在血漿中的釋放情況[3][4]，對(duì)于該方法的論證，盡管文獻(xiàn)中做了較多的分析，但尚缺少包封藥物與未包封藥物分離完全度的考量；在另一篇兩性霉素B脂質(zhì)體的包封率方法考察文獻(xiàn)中[5]，作者詳細(xì)分析了C18填料和HLB填料固相萃取柱測(cè)定脂質(zhì)體包封率的一些缺陷，兩性霉素B脂質(zhì)體同樣使用了大豆磷脂和膽固醇，在用純水進(jìn)行洗脫時(shí)，可能由于填料與輔料之間的強(qiáng)相互作用，導(dǎo)致脂質(zhì)體變得較難洗脫，同時(shí)在使用純水進(jìn)行洗脫時(shí)由于大量水的引入導(dǎo)致脂質(zhì)體的外環(huán)境受到破壞，增加了脂質(zhì)體破裂的風(fēng)險(xiǎn)。與兩性霉素B不同的是，鹽酸多柔比星溶于水，在使用純水洗脫脂質(zhì)體顆粒時(shí)，游離的藥物會(huì)一同被洗脫下來。相對(duì)于固相萃取法而言，超濾離心法、魚精蛋白凝聚離心法、葡聚糖凝膠柱法和微柱離心法測(cè)定鹽酸多柔比星脂質(zhì)體包封率的結(jié)果更可靠一些。
鹽酸多柔比星PCL納米顆粒與其脂質(zhì)體有著較大的不同，PCL顆粒為硬質(zhì)顆粒，相對(duì)而言具有更強(qiáng)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，大粒徑的PCL顆粒更容易沉降，因此超速離心法測(cè)定包封率變得可行[6]。在文獻(xiàn)[6]中，作者使用熒光標(biāo)記法驗(yàn)證了超速離心法、超濾離心法和葡聚糖凝膠柱法檢測(cè)包封率的準(zhǔn)確性（以熒光標(biāo)記的納米顆粒載體的分離程度作判斷），證實(shí)了超濾離心法對(duì)PCL納米顆粒的截留最完全，最終判斷超濾離心法檢測(cè)PCL納米顆粒的包封率結(jié)果更加準(zhǔn)確。但是，該論證缺少兩個(gè)重要的論點(diǎn)：1、熒光標(biāo)記PCL納米顆粒的完全程度，2、未包封藥物分離的完全度。對(duì)于超速離心法，由于鹽酸多柔比星溶解在外水相中，PCL納米顆粒能否完全離心沉降是其驗(yàn)證的重點(diǎn)，而另一個(gè)需要考慮的是：超速離心后，外水相如何完全轉(zhuǎn)移（即未包封藥物分離的完全度）。由于超速離心后包封部分與未包封部分仍然在同一個(gè)體系中，離心后的溶液傾倒出上層可以將絕大部分未包封藥物分離，但若要想達(dá)到完全分離，一是可以通過一次離心足夠大的量讓未包封藥物的殘留量能夠忽略不計(jì)，二是可以通過反復(fù)清洗殘?jiān)⑹占瘉磉_(dá)到完全分離。但總體而言，超速離心法只適用于大粒徑PCL顆粒的包封率測(cè)試，且其相對(duì)于超濾離心法而言離心時(shí)間較長(zhǎng)。對(duì)于超濾離心法，由于超濾膜的孔隙小，幾乎所有的PCL納米顆粒都可以被截留，但超濾膜對(duì)游離鹽酸多柔比星的吸附會(huì)導(dǎo)致測(cè)得的包封率結(jié)果偏高，因此在實(shí)際操作過程中可以通過預(yù)先將超濾膜飽和化處理來提升結(jié)果的準(zhǔn)確性；但隨之出現(xiàn)的問題是由于超濾膜的飽和處理導(dǎo)致部分孔隙堵塞，使得分離時(shí)間變長(zhǎng)、分離效率變差。
值得關(guān)注的是，在證明包封率方法的可行性時(shí)，除了多種檢測(cè)方法的相互對(duì)比外，對(duì)游離藥物及包封藥物的表征也是較為關(guān)鍵的，好的表征手段可以極大的促進(jìn)包封率的方法開發(fā)。除了文獻(xiàn)[6]中提到的通過熒光標(biāo)記納米顆粒載體外，通過檢測(cè)輔料在分離物中的分布情況也是一個(gè)較為實(shí)用的手段。
下面結(jié)合自身工作中碰到的一些問題對(duì)各包封率方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行一個(gè)簡(jiǎn)單分析。
低速離心法、超速離心法需要地耗材較少，操作相對(duì)簡(jiǎn)便，在實(shí)現(xiàn)不同粒徑的硬質(zhì)載體與游離藥物的分離上有較大的優(yōu)勢(shì)。另外，脂肪乳中存在的游離晶體也適合用低速離心法進(jìn)行分離，但分離完全度的判斷一直是一個(gè)難題；如果脂肪乳中存在游離的晶體，這便意味著溶液的均一性受到挑戰(zhàn)，取樣量的選擇及離心轉(zhuǎn)速的選擇會(huì)變成證明方法可行性的兩個(gè)重點(diǎn)。對(duì)于不透明的液體納米載體藥物，低速離心法用于分離不溶性的游離藥物更加難以證實(shí)其方法的準(zhǔn)確性。對(duì)于超速離心法的應(yīng)用，白蛋白納米粒的包封率測(cè)定是較為成功的應(yīng)用案例，這份成功建立在證明了藥物的無定形狀態(tài)和藥物與白蛋白存在高結(jié)合率的基礎(chǔ)上。對(duì)于可變形納米載體，超速離心法會(huì)破壞載體的完整性從而導(dǎo)致包封率結(jié)果失真。
超濾離心法使用的超濾離心管成本相對(duì)較高，但包封率檢測(cè)方法的優(yōu)化（降低藥物吸附及孔隙堵塞）可以增加超濾管的重復(fù)使用率。對(duì)于溶解在載體外相中的游離藥物的分離，超濾離心法是較好的選擇，但超濾膜吸附會(huì)導(dǎo)致包封率結(jié)果偏高、回收率偏低；對(duì)于分散在載體外相的游離藥物晶體，超濾離心法無法將包封與游離部分進(jìn)行有效分離；超濾膜吸附問題是超濾離心法的一大弊病。
微柱離心法所用的微柱成本相對(duì)較高，理論上可重復(fù)使用多次（因分離物質(zhì)的性質(zhì)而異）；葡聚糖凝膠柱法與微柱離心法具有相似的分離效果，這兩種方法的適用范圍較廣，既可以用作分離游離的的藥物晶體，也可以根據(jù)體積排阻原理分離溶解型的游離藥物；相對(duì)而言，微柱離心法具有更好的重現(xiàn)性。
絮凝離心法和魚精蛋白凝聚法具有相同的分離作用，前者是向體系內(nèi)加入絮凝劑使載體聚集，后者是利用魚精蛋白的正電荷使帶負(fù)電荷或中性的載體聚集。對(duì)于溶解型的游離藥物，兩種方法具有較好的分離作用；對(duì)于游離的藥物晶體，兩種方法均會(huì)因?yàn)檩d體凝聚包裹原本游離的藥物晶體導(dǎo)致包封率結(jié)果偏高。絮凝劑/魚精蛋白的用量、樣品的加入量、載體凝聚的時(shí)間、如何完全分離聚集的載體和外相介質(zhì)是這兩種方法的考察重點(diǎn)。針對(duì)這兩種方法，目前市面上存在一種下端可拆卸型離心管，用以解決分離聚集的載體和外相介質(zhì)這一難題。
透析（反透析）法多見于體外釋放中應(yīng)用，在分離包封與游離藥物時(shí)，需要考慮藥物在透析介質(zhì)中的溶解度、滲透速率、透析介質(zhì)對(duì)載體的破壞性和納米載體藥物本身的穩(wěn)定性。透析（反透析）法一般耗時(shí)較長(zhǎng)，少則需要十多個(gè)小時(shí)，多則需要數(shù)天，這對(duì)納米載體藥物在實(shí)驗(yàn)條件下的穩(wěn)定性是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。反向透析法對(duì)納米載體藥物在透析介質(zhì)中的穩(wěn)定性挑戰(zhàn)極大，因稀釋倍數(shù)過高，原本的內(nèi)環(huán)境被破壞。
固相萃取法常用的固相萃取柱填料為HLB（聚苯乙烯），固相萃取柱的成本較低，可重復(fù)使用多次，經(jīng)過方法優(yōu)化可獲得極高的回收率和良好的重現(xiàn)性。對(duì)于分離多構(gòu)型載體及多種存在形式的游離藥物，固相萃取法具有較好的適用性。拋開固相萃取柱的內(nèi)部填料，用于固定填料的篩板也會(huì)存在與超濾膜一樣的吸附問題，但相對(duì)而言篩板的吸附量較少。
綜上所述，包封率方法需根據(jù)納米載體藥物本身的性質(zhì)進(jìn)行選擇。本文僅局限于作者本身閱歷及實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行了相應(yīng)歸納，存在一定的缺陷，僅供參考。
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