近期，西南交通大學(xué)翁杰、譚歡和南京兒童醫(yī)院鄭朋飛研究員在科愛創(chuàng)辦的期刊Bioactive Materials上聯(lián)合發(fā)表研究性文章：3D打印具有抗菌潛力的三元素?fù)诫s羥基磷灰石/聚己內(nèi)酯復(fù)合支架用于骨肉瘤治療和骨再生。體外研究表明Se、Sr和Zn摻雜羥基磷灰石（Se/Sr/Zn-HA）具有良好的生物相容性、抗菌性、抗腫瘤和促成骨功能，其與聚己內(nèi)酯混合制備的復(fù)合支架（Se/Sr/Zn-HA-PCLs）表現(xiàn)出良好的保真度和力學(xué)性能。體內(nèi)研究證實(shí)Se/Sr/Zn-HA具有優(yōu)異的抗腫瘤效果，Se/Sr/Zn-HA-PCLs能有效促進(jìn)骨缺損修復(fù)。
1、研究?jī)?nèi)容簡(jiǎn)介
骨肉瘤是一種常見的惡性骨腫瘤，主要發(fā)生于兒童和青少年，已成為引起青少年癌癥死亡的第二大原因。目前，骨肉瘤的主要治療方法包括手術(shù)切除、化療和放療，而骨肉瘤引起的骨缺損常通過自體骨移植修復(fù)，但手術(shù)切除不能完全消除病灶部位殘留的骨腫瘤細(xì)胞，殘留腫瘤細(xì)胞可增殖轉(zhuǎn)移，增加腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。此外，骨肉瘤對(duì)放療無反應(yīng)，且有很高的化療耐藥傾向。自體骨移植治療骨肉瘤切除術(shù)引起的骨缺損是一種替代方法，但存在供體部位并發(fā)癥、免疫排斥反應(yīng)和供應(yīng)有限等多個(gè)問題，限制了其臨床應(yīng)用。因此，開發(fā)具有修復(fù)骨肉瘤引起的骨缺損，又能消除癌細(xì)胞并抑制細(xì)菌感染的人工骨替代物成為臨床亟待解決的問題。羥基磷灰石（HA）是人體硬組織的主要無機(jī)成分，因其優(yōu)異的生物相容性、骨傳導(dǎo)性和生物活性而廣泛用于骨組織工程。不同的微量元素在骨組織的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮不同的作用。例如，鋅（Zn）、錳（Mn）和鍶（Sr）具有良好的成骨作用；鎂（Mg），銅（Cu）以及鈷（Co）具有出色的血管生成作用；硅（Si）和硼（B）具有成骨和血管生成作用；硒（Se）可以促進(jìn)骨組織發(fā)育、抗腫瘤和抗衰老。然而，單元素?fù)诫sHA很難修復(fù)由骨肉瘤引起的骨缺損，而多元素?fù)诫sHA具備的復(fù)合功能使其在修復(fù)骨肉瘤引起的骨缺損中具有潛力。據(jù)悉，使用三元素?fù)诫sHA治療骨肉瘤，修復(fù)骨缺損和術(shù)后抗感染的研究較少。因此，本研究旨在設(shè)計(jì)并制造一種多功能支架，在消除腫瘤的同時(shí)修復(fù)骨缺損，并預(yù)防骨肉瘤的術(shù)后感染。如圖1所示，將水熱法合成的Se、Sr和Zn共摻雜HA（Se/Sr/Zn-HA）和聚己內(nèi)酯（PCL）混合并通過3D打印技術(shù)制備Se/Sr/Zn-HA-PCLs復(fù)合支架，并驗(yàn)證Se/Sr/Zn-HA的抗菌潛力和評(píng)估Se/Sr/Zn-HA的體外和體內(nèi)抗腫瘤特性，以及促成骨分化潛力。最后在大鼠股骨缺損模型驗(yàn)證了Se/Sr/Zn-HA-PCLs的骨缺損修復(fù)功能。
圖 1. 用于腫瘤治療、骨缺損修復(fù)和抗菌的Se/Sr/Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA-PCLs的制備和功能示意圖。
一、HA和元素?fù)诫sHA的制備和表征
本研究采用水熱法合成HA和元素?fù)诫sHA，其優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)溫度低，產(chǎn)物結(jié)晶度好，產(chǎn)品形貌易于控制，為獲得亞微米甚至納米級(jí)或納米結(jié)構(gòu)材料提供了可能性。SEM結(jié)果表明，純HA呈帶狀晶體形狀（圖2 A），長(zhǎng)度為2–10 μm，寬度為1 μm，Se-HA促進(jìn)片狀的聚集，而長(zhǎng)度縮短至2–5 μm，寬度有所增加。與Se-HA相比，Sr-HA表現(xiàn)出更規(guī)則的放射花瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)，其平均寬度約為5 μm，并且有少數(shù)不完整微球結(jié)構(gòu)，表明Sr-HA隨著摻雜量增加從放射花瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榍驙罱Y(jié)構(gòu)。Zn-HA的顆粒形態(tài)相對(duì)均勻，由薄片聚集形成直徑約7-9μm的規(guī)整微球結(jié)構(gòu)。Se/Sr-HA是一種球狀連接結(jié)構(gòu)，由薄片聚集組成，球狀結(jié)構(gòu)為徑向，與Sr-HA的結(jié)構(gòu)相似。Se/Zn-HA是薄片聚集而成的球形結(jié)構(gòu)，且薄片相對(duì)稀疏，球形度不如Zn-HA，直徑為15–25 μm。Sr/Zn-HA呈規(guī)則球形結(jié)構(gòu)，為稀疏和徑向片狀，部分Sr/Zn-HA的薄片密度大于Zn-HA，直徑為20–30 μm。Se/Sr/Zn-HA由放射狀花瓣?duì)詈臀⑶蚪M成，微球直徑范圍為2-10 μm，徑向花瓣?duì)罱Y(jié)構(gòu)與Sr-HA結(jié)構(gòu)相似，微球狀結(jié)構(gòu)與Zn-HA結(jié)構(gòu)一致。三元素?fù)诫s的Se/Sr/Zn-HA的形貌與Se-HA、Sr-HA或Zn-HA的組合形貌相似。采用XRD分析樣品物相，結(jié)果表明，元素?fù)诫s HA的衍射峰與HA標(biāo)準(zhǔn)圖（JCPDS09-0432）相似，元素?fù)诫s的HA樣品保持HA的主相（圖2B）。采用FTIR分析摻雜HA的化學(xué)結(jié)構(gòu)（圖2C），在所有樣品的FTIR光譜中均顯示了HA的官能團(tuán)吸收峰。EDS（圖2D）結(jié)果表明，Zn、Sr和Se在Se/Sr/Zn-HA表面均勻分布，表明Se/Sr/Zn-HA的成功制備。
圖 2. HA、Se-HA、Sr-HA、Zn-HA、Se/Sr-HA、Se/Zn-HA、Sr/Zn-HA 和 Se/Sr/Zn-HA 的表征。（A）SEM圖像，（B）XRD圖譜，（C）FTIR光譜和（D）Se/Sr/Zn-HA的元素分布。
二、HA和元素?fù)诫sHA的抗菌性評(píng)價(jià)
將HA、Se-HA、Sr-HA、Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA浸提液和金黃色葡萄球菌和大腸桿菌共培養(yǎng)后進(jìn)行定量分析，細(xì)菌的活性如圖3A和圖3B所示。HA和Se-HA抗菌效果略優(yōu)于對(duì)照組，Sr-HA和Zn-HA組比Se-HA和對(duì)照組的抗菌效果更好，尤其是Zn-HA，這與Zn2+優(yōu)異的抗菌功能有關(guān)。雖然Sr-HA、Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA的抗菌效果與對(duì)照組有顯著差異，但Se/Sr/Zn-HA浸提液與大腸桿菌或金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)后均表現(xiàn)出最佳的抗菌效果，表明SeO32−、Sr2+和Zn2+的協(xié)同給藥獲得最佳的抗菌效果。將樣品浸提液和細(xì)菌懸液涂覆到固體培養(yǎng)基上，觀察菌落生長(zhǎng)。雖然Se/Sr/Zn-HA的金黃色葡萄球菌菌落密度高于大腸桿菌，但Se/Sr/Zn-HA仍表現(xiàn)出優(yōu)越的抗菌效果，表明SeO32−、Sr2+和Zn2+聯(lián)合給藥可獲得最佳的抗菌效果。綜上所述，Se/Sr/Zn-HA對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有最佳的抗菌效果，證實(shí)了SeO32−、Sr2+和Zn2+協(xié)同給藥的抗菌優(yōu)勢(shì)。
圖 3. HA，Se-HA，Sr-HA，Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA浸提液與細(xì)菌共培養(yǎng)24小時(shí)的抗菌性能評(píng)價(jià)。（A）浸提液與大腸桿菌共培養(yǎng)后的OD值；（B）浸提液與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)后的OD值；（C）大腸桿菌和浸提液共涂板；（D）金黃色葡萄球菌和浸提液共涂板。
三、HA和元素?fù)诫sHA的體外成骨分化評(píng)價(jià)
通過檢測(cè)樣品浸提液和大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）共培養(yǎng)后的ALP活性和茜素紅染色來評(píng)估樣品促成骨分化能力。培養(yǎng)7天后，元素?fù)诫sHA組的ALP活性與對(duì)照組相比無明顯差異（圖4A），但BMSC表現(xiàn)出分化成骨細(xì)胞的趨勢(shì)。培養(yǎng)14 天后，HA的ALP活性強(qiáng)于對(duì)照組，并觀察到成骨分化，而Se/Sr/Zn-HA培養(yǎng)的BMSCs ALP水平顯著高于對(duì)照組。Zn-HA對(duì)ALP活性的影響最小，培養(yǎng)7天和14天后ALP水平均略高于對(duì)照組。Se/Sr/Zn-HA含有上述離子，具有良好的促骨分化潛力。
茜素紅染色結(jié)果與ALP結(jié)果相似，但Zn-HA比對(duì)照組、HA和Se-HA可促進(jìn)更多的鈣質(zhì)沉積，如圖4B所示。與對(duì)照組相比，材料組均有明顯的鈣質(zhì)沉積。此外，隨著元素類型的增加，鈣質(zhì)沉積的效果變得更明顯。由此可見，SeO32−、Sr2+和Zn2+均可促進(jìn)BMSCs的成骨分化，三者的協(xié)同給藥可達(dá)到最佳的成骨分化效果。免疫熒光染色顯示BMSCs呈多角星形擴(kuò)散而無分化（圖4C），表明BMSCs培養(yǎng)7天后形態(tài)沒有發(fā)生變化；而與Se/Sr/Zn-HA共培養(yǎng)的BMSCs形態(tài)卻發(fā)生顯著變化，細(xì)胞長(zhǎng)寬比增加，細(xì)胞假足延伸形成拉伸結(jié)構(gòu)，表明SeO32−、Sr2+和Zn2+協(xié)同給藥能促進(jìn)BMSCs的鋪展。
圖 4. HA，Se-HA，Sr-HA，Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA的體外成骨分化潛力評(píng)價(jià)。（A）BMSC在用HA，Se-HA，Sr-HA，Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA培養(yǎng)7天和14天后ALP的分泌水平；（B）用HA，Se-HA，Sr-HA，Zn-HA，Se/Sr-HA，Se/Zn-HA，Sr/Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA的α-MEM培養(yǎng)BMSCs 21天后的ARS染色；（C）用Se/Sr/Zn-HA的α-MEM培養(yǎng)BMSC7天后的羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽和DAPI免疫熒光染色。
四、HA和元素?fù)诫sHA的體外抗腫瘤評(píng)價(jià)
將HA和元素?fù)诫sHA浸提液與人骨肉瘤細(xì)胞（143b）共培養(yǎng)來評(píng)價(jià)材料的體外抗腫瘤能力。結(jié)果顯示，含有SeO32−浸提液的143b數(shù)量最少，且與其他組存在顯著差異，表明SeO32−具有更好的抗腫瘤作用，如圖5A所示。培養(yǎng)1 天后，Zn-HA的143b數(shù)量高于Sr-HA和對(duì)照組；培養(yǎng)3 天后，材料組143b數(shù)量均低于對(duì)照組；培養(yǎng)5天后，Zn-HA的143b數(shù)量低于Sr-HA，表明Zn2+發(fā)揮抗腫瘤作用的時(shí)間較長(zhǎng)。培養(yǎng)5 天后，除Sr/Zn-HA外，雙元素?fù)诫sHA的143b數(shù)量均低于單元素?fù)诫sHA組和對(duì)照組，這與Sr2+抗腫瘤效果較差有關(guān)。雖然Sr2+抗腫瘤效果較差，但仍高于HA組和對(duì)照組。然而，在培養(yǎng)期間，Se/Sr/Zn-HA的143b數(shù)量均明顯低于對(duì)照組和不含SeO32-組，表明Se/Sr/Zn-HA具有顯著且持久的抗腫瘤作用。Tunel 染色結(jié)果表明，143b與 Se-HA 和 Se/Sr/Zn-HA 共培養(yǎng)3天后的存活率最低，如圖 5B 所示。此外，含SeO32−浸提液均具有優(yōu)異的抗腫瘤效果，而對(duì)照組、HA和Sr-HA幾乎沒有觀察到143b凋亡，Se/Sr/Zn-HA中143b凋亡最多，這表明了Sr2+和Zn2+摻入進(jìn)一步強(qiáng)化了SeO32−的抗腫瘤效果， SeO32−、Sr2+和Zn2+三者的協(xié)同給藥能達(dá)到最佳的抗腫瘤能力。
圖 5. HA，Se-HA，Sr-HA，Zn-HA，Se/Sr-HA，Se/Zn-HA，Sr/Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA浸提液與143b共培養(yǎng)評(píng)價(jià)體外抗腫瘤潛力。（A）1 天、3 天和5天的OD值；（B）第3天的Tunell染色。
五、HA和元素?fù)诫sHA的體內(nèi)抗腫瘤評(píng)價(jià)
將各類HA分別與PBS混合后注射到荷瘤小鼠的腫瘤部位，結(jié)果如圖6（A）和（B）所示。結(jié)果表明，注射PBS的小鼠腫瘤顯著增大，而HA處理的小鼠腫瘤沒有顯著抑制，但仍略小于PBS處理的小鼠腫瘤。Sr-HA、Zn-HA和Sr/Zn-HA的抗腫瘤效果與HA相似，表明Sr2+和Zn2+的抗腫瘤效果較差。Se-HA、Se/Sr-HA、Se/Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA的腫瘤顯著小于其他組，表明SeO32−具有比Sr2+ 和Zn2+更好的抗腫瘤效果。Se/Sr-HA和Se/Zn-HA的抗腫瘤效果與Se-HA相當(dāng)，表明Sr2+和Zn2+的摻入并沒有削弱SeO32−的抗腫瘤效果，這與體外抗腫瘤結(jié)果一致。然而，Se/Sr/Zn-HA處理的小鼠的腫瘤最小。采用H&E（圖6C）和Ki67染色（圖6D）分析腫瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示對(duì)照組腫瘤細(xì)胞未發(fā)生明顯凋亡，HA、Sr-HA、Zn-HA和Sr/Zn-HA的結(jié)果相似，表現(xiàn)出微小的抗腫瘤作用。而Se-HA、Se/Sr-HA、Se/Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA給藥后出現(xiàn)明顯的腫瘤細(xì)胞凋亡，其抗腫瘤效果優(yōu)于對(duì)照組、HA、Sr-HA、Zn-HA和Sr/Zn-HA，這與體外結(jié)果一致。因此，SeO32−具有優(yōu)異的抗腫瘤效果，而SeO32−、Sr2+和Zn2+的協(xié)同給藥增強(qiáng)了抗腫瘤效果。
圖6. HA，Se-HA，Sr-HA，Zn-HA，Se/Sr-HA，Se/Zn-HA，Sr/Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA體內(nèi)抗腫瘤潛力評(píng)價(jià)。（A）處死小鼠后提取腫瘤；（B）樣品注射后相對(duì)腫瘤體積隨時(shí)間變化；（C）第8天腫瘤組織的H&E染色，比例尺：100μm；（D）第8天腫瘤組織的Ki67染色，比例尺：100μm。
六、HA-PCLs、Se-HA-PCLs、Sr-HA-PCLs、Zn-HA-PCLs 和 Se/Sr/Zn-HA-PCLs 支架的構(gòu)建及體內(nèi)成骨評(píng)價(jià)
本研究進(jìn)一步采用PCL和HA的混合生物墨水結(jié)合3D打印技術(shù)構(gòu)建多孔支架，相應(yīng)支架的形貌如圖7A所示。所有復(fù)合支架均表現(xiàn)出均勻且相互穿透的三維多孔結(jié)構(gòu)，大孔尺寸約為350 μm。Sr-HA-PCLs和Se/Sr/Zn-HA-PCLs的表面較粗糙，其他組表面光滑，這與Sr-HA和Se/Sr/Zn-HA的結(jié)構(gòu)有關(guān)。Se/Sr/Zn-HA-PCLs的橫截面元素分布如圖7B所示，橫截面顯示出直徑約為400 μm的規(guī)則圓形輪廓，Se、Sr和Zn在支架內(nèi)均勻分布，表明Se/Sr/Zn-HA和PCL均勻混合。
通過修復(fù)SD大鼠股骨缺損來評(píng)估支架的促成骨能力，結(jié)果如圖7C所示。H&E染色表明，3D打印支架的成骨作用優(yōu)于對(duì)照組。Se-HA-PCL、Sr-HA-PCLs和Zn-HA-PCLs的成骨作用優(yōu)于HA-PCLs。Sr-HA-PCLs和Zn-HA-PCLs的成骨作用相似，Sr-HA-PCLs與對(duì)照組相似。Masson染色與H&E染色結(jié)果相似：HA-PCLs優(yōu)于對(duì)照組，而Se-HA-PCLs，Sr-HA-PCLs和Zn-HA-PCLs優(yōu)于HA-PCLs，Se/Sr/Zn-HA-PCLs的修復(fù)效果最佳。上述結(jié)果表明，SeO32−、Sr2+或Zn2+可以改善HA的成骨效果，且Se/Sr/Zn-HA-PCLs的效果優(yōu)于Se-HA-PCLs，Sr-HA-PCLs和Zn-HA-PCLs，這與 ALP活性和茜素紅染色結(jié)果相似。在這項(xiàng)研究中，SeO32−、Sr2+和Zn2+協(xié)同改善了HA的生物活性，表現(xiàn)出比HA或單元素?fù)诫sHA更好的促骨、抗腫瘤和抗菌效果，從而顯著提高骨修復(fù)效果，降低腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。
圖 7. HA-PCLs、Se-HA-PCLs、Sr-HA-PCLs、Zn-HA-PCLs 和 Se/Sr/Zn-HA-PCLs 的表征。（A）SEM圖像；（B） Se/Sr/Zn-HA-PCLs橫截面元素分布。(C) 復(fù)合支架植入大鼠股骨4周和12周后的H&E和Masson染色;S代表支架，NB代表新骨;比例尺：1000 μm，放大區(qū)域比例尺：100 μm。
2、原文信息
Hao Huang, Lei Qiang,Minjie Fan, Yihao Liu, Anchun Yang, Dongbiao Chang, Jinsheng Li, Tong Sun,Yiwei Wang, Ruoyi Guo, Hanjie Zhuang, Xiangyu Li, Tailin Guo, Jinwu Wang, HuanTan***, Pengfei Zheng**, Jie Weng*.
3D-printed tri-element-doped hydroxyapatite/polycaprolactone composite scaffolds with antibacterial potential forosteosarcoma therapy and bone regeneration.
BioactiveMaterials, 31 (2024) 18-37.
DOI: 10.1016/j.bioactmat.2023.07.004.
京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
