人工重建膠原組織的納米纖維結(jié)構(gòu)是構(gòu)建肌腱類似物的一種有前景的方法，該肌腱類似物具有與組織相似的生物力學(xué)特性，較高的機(jī)械強(qiáng)度、韌性以及耐受性，抗疲勞和抗斷裂特性。近日，來(lái)自上?？萍即髮W(xué)的凌盛杰和復(fù)旦大學(xué)江立波教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了模仿自然組織結(jié)構(gòu)和力學(xué)的仿生工程纖維用于肌腱修復(fù)和再生的相關(guān)研究。研究成果以“Tendon Repair and Regeneration Using Bioinspired Fibrillation Engineering That Mimicked the Structure and Mechanics of Natural Tissue”為題于9月1日發(fā)表在《ACS Nano》上。
本研究受天然紡絲蛋白纖維啟發(fā)，構(gòu)建了人工肌腱（FAT）。該人造纖維肌腱具有高度有序的分子和納米纖維結(jié)構(gòu)，與軟膠原組織的結(jié)構(gòu)相似，具有肌腱的機(jī)械和抗斷裂特性。這種相似性為研究FAT在跟腱缺損修復(fù)中的應(yīng)用提供動(dòng)力。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞中肌腱相關(guān)基因表達(dá)以及肌腱損傷體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)AT中高度定向的納米纖維大大促進(jìn)肌腱相關(guān)基因的表達(dá)，并促進(jìn)跟腱損傷后結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)。這些結(jié)果為FAT在臨床中的應(yīng)用提供前景。
本文從以下幾個(gè)方面進(jìn)行詳細(xì)描述
1. 模仿蠶絲紡絲工藝制作TM-FAT
2. HONF對(duì)機(jī)械性能的作用
3. HONF對(duì)TM-FAT抗斷裂能力的作用
4. HONFs對(duì)大鼠BMSCs活力的作用
5. 用于跟腱缺損修復(fù)的TM-FATs
6. 解剖大體觀
7. 組織染色
8. 磁共振成像評(píng)估
9. 跟腱功能指數(shù)評(píng)估
10. 肌腱相關(guān)基因表達(dá)分析
圖1 蠶絲紡絲過(guò)程蠶絲纖維蛋白的結(jié)構(gòu)重塑
如圖所示，膠束自組裝和機(jī)械負(fù)載引起纖維化是天然蠶絲紡絲的兩個(gè)關(guān)鍵過(guò)程。蠶絲纖維素由高度重復(fù)的親水-疏水-親水結(jié)構(gòu)域組成，其中疏水結(jié)構(gòu)域和親水結(jié)構(gòu)域分別形成β-片層結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)螺旋結(jié)構(gòu)。在疏水作用力的驅(qū)動(dòng)下和親水絲膠蛋白的幫助下，蠶絲蛋白在蠶絲腺中聚集成直徑100-200 nm的無(wú)定形膠束或膠束聚集體（稱為纖維蛋白球）。在紡絲過(guò)程中受到物理剪切或拉伸時(shí)，膠束和球會(huì)變形為納米纖維絲，并沿著剪切的方向定向，隨后水逐漸從膠束中釋放出來(lái)。機(jī)械拉伸引起的纖維化過(guò)程會(huì)在分子鏈之間，特別是在β片層之間迅速形成分子間氫鍵，強(qiáng)烈的疏水作用會(huì)使其具有一定的聚合趨勢(shì)。
圖2 制造TM-FAT的仿生策略
受天然蠶絲紡絲過(guò)程中膠束自組裝和機(jī)械負(fù)載誘導(dǎo)纖維化協(xié)同作用的啟發(fā)，本文構(gòu)思了一種將相變誘導(dǎo)膠束化和機(jī)械負(fù)載驅(qū)動(dòng)纖維化結(jié)合起來(lái)，構(gòu)建FAT中的肌腱模擬HONFs。實(shí)驗(yàn)選擇再生蠶絲纖維蛋白（RSF）作為起始材料。RSF保持原蠶絲蛋白獨(dú)特的親水-疏水-親水序列，具有膠束化能力。此外，RSF是一種廣泛存在的天然蛋白質(zhì)，由于其出色的生物相容性、良好的免疫原性和可調(diào)的體內(nèi)降解性，是組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾多生物材料應(yīng)用的理想材料。具體來(lái)講，研究人員使用RSF/聚環(huán)氧乙烷（PEO）/Ca2+離子溶液來(lái)模擬蠶絲的天然紡絲過(guò)程，親水性PEO可被視為絲膠蛋白的替代品。在此過(guò)程中，大多數(shù)RSF分子都聚集成膠束和膠束聚集體。PEO與特定數(shù)量的RSF結(jié)合形成了連續(xù)均勻的基質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)PEO的含量來(lái)調(diào)整球狀物的大小，進(jìn)一步影響ACM的機(jī)械性能。在本研究中，選擇的RSF/PEO比率為80%，與天然紡絲溶液中絲纖維素和絲膠蛋白的比率非常相似。
圖3 TM-FAT的機(jī)械性能
接著研究人員對(duì)TM-FAT、NF-AT和ACM進(jìn)行平面拉伸試驗(yàn)，確定HONF對(duì)TM-FAT機(jī)械性能的影響。干燥狀態(tài)下的ACM很脆，而TM-FAT在剛度、強(qiáng)度、伸展性和韌性之間保持了良好的平衡。與對(duì)照材料相比，TM-FAT在高水合狀態(tài)下也保持機(jī)械性能上的優(yōu)勢(shì)。TM-FAT在平衡韌性和模量方面的優(yōu)勢(shì)也非常明顯。將TM-FAT的機(jī)械性能與其他生物和工程材料系統(tǒng)進(jìn)行比較，脫水TM-FAT的強(qiáng)度和剛度與典型肌腱組織的強(qiáng)度和剛度非常匹配，突顯其在肌腱修復(fù)和再生應(yīng)用中的適用性。。對(duì)于TM-FAT而言，肌腱動(dòng)態(tài)力學(xué)和斷裂力學(xué)的匹配更為重要，因?yàn)樗枰谌粘Ｊ褂弥谐惺芩矔r(shí)和持續(xù)的循環(huán)機(jī)械刺激，并在長(zhǎng)期植入過(guò)程中保持結(jié)構(gòu)和機(jī)械穩(wěn)定性。結(jié)果顯示TM-FAT值均比現(xiàn)有韌性水凝膠的測(cè)量值大3倍左右。比單網(wǎng)絡(luò)水凝膠的疲勞閾值高10-100倍。此外，應(yīng)力-應(yīng)變曲線清楚地表明，在拉伸斷裂過(guò)程中，TM-FAT形成了合適的階梯狀韌性斷裂，而不是瞬間的全部斷裂。應(yīng)力曲線上的每個(gè)階梯都與裂紋的縱向轉(zhuǎn)移相對(duì)應(yīng)，大大增加了裂紋擴(kuò)展的路徑，顯著提高了TM-FAT的斷裂韌性。階梯狀延展斷裂對(duì)有缺陷的肌腱至關(guān)重要，可防止在受到瞬時(shí)機(jī)械力時(shí)發(fā)生瞬間斷裂。
圖4 對(duì)移植后大鼠跟腱恢復(fù)情況進(jìn)行分析
術(shù)后八周，對(duì)TM-FAT進(jìn)行HE染色顯示出正常的肌腱樣結(jié)構(gòu)，其中有平行纖維、致密的細(xì)胞外基質(zhì)、伸長(zhǎng)的腱母細(xì)胞和腱細(xì)胞，與自體組織組非常相似。TM-FAT中的細(xì)胞和新生組織呈定向生長(zhǎng)。相比之下，NF-AT組的細(xì)胞更圓，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞外基質(zhì)較少，表明其肌腱再生能力有限。MT染色顯示，植入TM-FAT 8周后，樣本成熟膠原纖維多于NF-AT組。用阿爾新藍(lán)染色法測(cè)量再生跟腱中肥大軟骨細(xì)胞的增殖情況。與NF-AT組和缺損組相比，TM-FAT組和自體組有較少的肥大軟骨細(xì)胞，可能是由于TM-FAT中HONFs的作用。平行纖維結(jié)構(gòu)有利于跟腱的形成，而無(wú)定向結(jié)構(gòu)則傾向于促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和成骨。在TM-FATs組中，正常跟腱區(qū)域所占總面積的百分比遠(yuǎn)高于NF-ATs組，接近自體修復(fù)組。核磁共振成像評(píng)估結(jié)果示：正常肌腱組的腓腸肌內(nèi)側(cè)和外側(cè)肌腱以及屈指淺肌腱均呈均勻的低信號(hào)，邊緣相對(duì)清晰。手術(shù)后，所有組的肌腱都出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為中高密度的不均勻信號(hào)。然而，在TM-FAT組中，信號(hào)不均勻的區(qū)域在4周后有所減少，8周后僅在縫線末端殘留少量。接著使用跟腱功能指數(shù)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)能力恢復(fù)評(píng)估，結(jié)果顯示缺損組大鼠的運(yùn)動(dòng)能力低于其他手術(shù)組。在TM-FAT、NF-AT和自體組中觀察到跟腱功能隨時(shí)間而增加，在所有觀察期內(nèi)，TM-FAT組的恢復(fù)能力都明顯優(yōu)于NF-AT組。
總結(jié)與展望
本文受天然紡絲過(guò)程的啟發(fā)，提出了一種利用相變誘導(dǎo)膠束化和機(jī)械負(fù)載誘導(dǎo)纖維化協(xié)同生產(chǎn)TM-FAT的策略。由此制得的TM-FAT具有高度各向異性。這種良好的結(jié)構(gòu)賦予TM-FAT與天然肌腱相匹配的機(jī)械力和抗斷裂特性。該相似性表明，TM-FAT是一種有前途的跟腱修復(fù)和再生植入物。與NF-AT相比，TM-FAT的纖維結(jié)構(gòu)和高取向性分別通過(guò)改變細(xì)胞粘附性增加跟腱相關(guān)基因的表達(dá)和跟腱相關(guān)功能的恢復(fù)。在動(dòng)物運(yùn)動(dòng)、組織學(xué)特征、基因表達(dá)和免疫反應(yīng)方面，植入TM-FAT刺激肌腱修復(fù)和再生的程度接近自體組。以上結(jié)果激勵(lì)我們繼續(xù)利用該策略開(kāi)展損傷后體內(nèi)組織替代研究，從而為T(mén)M-FAT的臨床應(yīng)用鋪平道路。
文章來(lái)源：https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsnano.3c03428
京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
