本文旨在對(duì)線性驗(yàn)證的相關(guān)系數(shù)與截距不符合要求的原因進(jìn)行分析。
一、概述
在做線性相關(guān)驗(yàn)證時(shí)，相關(guān)系數(shù)與截距是最該驗(yàn)證項(xiàng)非常重要的兩個(gè)參數(shù)，筆者在多年的從業(yè)經(jīng)歷中多次碰到或見到相關(guān)系數(shù)與截距不符合要求的情況，導(dǎo)致這種情況的原因多種多樣，遂將筆者總結(jié)的一些原因與讀者分享，且敬請(qǐng)方家指正。
需要說(shuō)明的是，鑒于篇幅有限，本文僅論述HPLC且為紫外檢測(cè)器條件下的線性驗(yàn)證情況，其他情況可以參考相關(guān)內(nèi)容；且僅分析技術(shù)上的原因，儀器故障與操作失誤這兩個(gè)原因可以導(dǎo)致所有的異常結(jié)果，不在本文討論。
二、 朗伯比爾定理
眾所周知，組分的紫外吸收遵循朗伯比爾定理，其物理意義是當(dāng)一束平行單色光垂直通過(guò)某一均勻非散射的吸光物質(zhì)時(shí),其吸光度A與吸光物質(zhì)的濃度c及吸收層厚度b成正比，而與透光度T成反相關(guān)。也就是說(shuō)，在理想狀態(tài)下響應(yīng)值與濃度在一定范圍內(nèi)應(yīng)該是一條經(jīng)過(guò)原點(diǎn)的直線，相關(guān)系數(shù)應(yīng)該是1，截距為0；但是現(xiàn)實(shí)總會(huì)在一定程度上偏離理想狀態(tài)，這種偏離就會(huì)導(dǎo)致相關(guān)系數(shù)不再是1，截距不再是0。
偏離的原因多種多樣，程度也各有不同，本文僅分析由實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不當(dāng)導(dǎo)致的偏離，即分析人員可以糾正過(guò)來(lái)的偏離，對(duì)于某些儀器原理或性能等方面不能糾正的偏離，本文不作論述。下文詳細(xì)論述各種可能導(dǎo)致線性異常的原因。
三、 線性驗(yàn)證異常原因
誤差
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的誤差是線性驗(yàn)證的結(jié)果偏離理想狀體的一個(gè)重要原因，誤差越大，意味著某個(gè)變量的響應(yīng)偏離預(yù)期值越大，在線性驗(yàn)證的結(jié)果中就體現(xiàn)出得到一個(gè)糟糕的相關(guān)系數(shù)與截距的值。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程的誤差主要來(lái)源于兩個(gè)方面：操作過(guò)程的誤差與儀器響應(yīng)的誤差。
1、操作過(guò)程的誤差
操作過(guò)程引入較大誤差常見不適宜的做法有：從貯備液稀釋不同濃度線性溶液時(shí)，取樣體積過(guò)??；如體積為0.8ml、0.9 ml 、1 ml、1.1 ml與1.2ml等；小的取樣體積必然引入較大的誤差，即實(shí)際濃度偏離計(jì)算濃度較大，導(dǎo)致線性相關(guān)數(shù)據(jù)偏離較大。這一類操作誤差一般為隨機(jī)誤差，它在線性數(shù)據(jù)一般表現(xiàn)為下圖的形式：
為減少操作誤差，由貯備液稀釋線性溶液時(shí)，取樣體積應(yīng)盡可能大；如含量測(cè)定線性驗(yàn)證，建議取樣體積應(yīng)不小于10ml，量瓶體積應(yīng)不小于100ml；雜質(zhì)線性驗(yàn)證也應(yīng)充分評(píng)估操作過(guò)程引入的誤差對(duì)驗(yàn)證結(jié)果的影響。
2、儀器響應(yīng)的誤差
儀器響應(yīng)誤差越大，線性越差，這個(gè)現(xiàn)象眾所周知；GC的響應(yīng)誤差一般大于LC，所以GC的線性驗(yàn)證數(shù)據(jù)一般較LC為差。導(dǎo)致儀器響應(yīng)誤差的原因多種多樣，儀器原理或性能等方面不能糾正的情況本章節(jié)不予討論，僅論述方法或?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)等方面的原因。常見的導(dǎo)致儀器響應(yīng)較大誤差的原因一般有波長(zhǎng)選擇不合理、流動(dòng)相pH值選擇不合理、色譜峰拖尾與進(jìn)樣體積過(guò)小等。
2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇不合理
如方法檢測(cè)波長(zhǎng)不是組分實(shí)際上的最大吸收波長(zhǎng)，則儀器響應(yīng)誤差較大。導(dǎo)致該情況的原因常見于采用紫外分光光度計(jì)獲得組分光譜圖，所選稀釋劑不同于流動(dòng)相；該情況下即組分在HPLC系統(tǒng)中的最大吸收波長(zhǎng)與檢測(cè)波長(zhǎng)不一致。
2.2 流動(dòng)相pH值選擇不合理
許多時(shí)候組分電離狀態(tài)與未電離狀態(tài)的響應(yīng)值有明顯不同，如流動(dòng)相pH值不在組分的pka±2范圍外，且流動(dòng)相緩沖能力不足，分析過(guò)程中組分電離狀態(tài)變化較大，導(dǎo)致響應(yīng)值差異較大；
2.3 色譜峰拖尾
色譜峰拖尾導(dǎo)致積分不準(zhǔn)確，響應(yīng)值的誤差較大。
儀器響應(yīng)的誤差一般也都是隨機(jī)誤差，其線性表現(xiàn)形式同操作誤差。
3、溶液未分散均勻
某些組分在稀釋劑中分散需要一段時(shí)間，如果振搖澄清后立即將溶液倒入進(jìn)樣小瓶，很可能由于溶液尚未分散均勻?qū)е逻M(jìn)樣小瓶中的濃度與溶液平均濃度不一致。
四、線性驗(yàn)證異常原因
流動(dòng)相本底吸收大
如流動(dòng)相本底吸收大，即檢測(cè)波長(zhǎng)低于或接近流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)，流動(dòng)相有較大的吸收，可能會(huì)對(duì)線性產(chǎn)生一定程度的影響。尤其在雜質(zhì)的線性驗(yàn)證中，這種影響非常明顯。最常見的表現(xiàn)形式是低濃度下的響應(yīng)值與高濃度不成相應(yīng)的比例，即濃度為一半的溶液響應(yīng)值遠(yuǎn)小于高濃度響應(yīng)值的一半。一般來(lái)說(shuō)，如果流動(dòng)相本底吸收大，截距一般為負(fù)值，且回收率驗(yàn)證中低濃度樣品回收率較低，高濃度樣品回收率較高；其線性表現(xiàn)形式一般如下圖：
五、線性驗(yàn)證異常原因
溶液未分散均勻
某些組分在稀釋劑中分散需要一段時(shí)間，如果振搖澄清后立即將溶液倒入進(jìn)樣小瓶，很可能由于溶液尚未分散均勻?qū)е逻M(jìn)樣小瓶中的濃度與溶液平均濃度不一致。如果沒有研究溶液分散均勻所需時(shí)間，可能某個(gè)濃度點(diǎn)的進(jìn)樣小瓶溶液濃度與計(jì)算濃度差異較大，導(dǎo)致線性數(shù)據(jù)異常，其表現(xiàn)形式一般為下圖：
六、線性驗(yàn)證異常原因
交叉污染
此處論述的不是引入外源的污染，這是操作失誤，不屬于本文論述的范疇。這里的交叉污染指的是雜質(zhì)對(duì)照品不純含有另外一種需要研究的雜質(zhì)，如雜質(zhì)A中含有10%雜質(zhì)B，如果配制混合線性溶液，雜質(zhì)A中含有的雜質(zhì)B必然影響雜質(zhì)B的線性結(jié)果。這種情況下，雜質(zhì)A與雜質(zhì)B應(yīng)當(dāng)分別驗(yàn)證，不宜配制混合線性溶液。
七、其它
由上文可知，導(dǎo)致線性驗(yàn)證數(shù)據(jù)異常原因主要來(lái)源于方法設(shè)計(jì)與操作兩個(gè)方面，如想獲得良好的線性驗(yàn)證數(shù)據(jù)，在方法開發(fā)與設(shè)計(jì)階段應(yīng)當(dāng)充分評(píng)估方法各項(xiàng)參數(shù)對(duì)線性驗(yàn)證的風(fēng)險(xiǎn)，在驗(yàn)證過(guò)程中應(yīng)當(dāng)充分評(píng)估各個(gè)操作過(guò)程對(duì)結(jié)果的影響。
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