角膜新生血管（CoNV）的特征是角膜組織中血管的異常生長(zhǎng)，是世界范圍內(nèi)造成視力損害的主要原因。目前，可用的治療方案療效有限，并與生物障礙和清除機(jī)制導(dǎo)致的不良反應(yīng)相關(guān)。為了解決這一挑戰(zhàn)，湖南大學(xué)史俊峰教授和中南大學(xué)湘雅二院眼科李蕓主任合作開(kāi)發(fā)了一種新的局部傳遞系統(tǒng)——Gel 2_1&Eylea——一種由細(xì)胞穿透肽1介導(dǎo)的游離滴眼液水凝膠。Gel 2_1&Eylea具有優(yōu)越的膜通透性，增加穩(wěn)定性，延長(zhǎng)藥物在眼表的保留時(shí)間，從而提高藥物療效。在兔CoNV模型中，Gel 2_1&Eylea顯著降低新生血管密度，對(duì)正常角膜鞏膜角膜緣血管無(wú)不良影響，具有良好的療效和生物相容性。本研究確定了一種很有前景的治療CoNV的方法，也可能有利于其他眼部新生血管疾病。
相關(guān)研究?jī)?nèi)容以“Aflibercept Loaded Eye-Drop Hydrogel Mediated with Cell-Penetrating Peptide for Corneal Neovascularization Treatment”為題于2023年9月7日發(fā)表在《Small》上。
圖1 Gel 2_1&Eylea治療角膜新生血管的應(yīng)用
本研究設(shè)計(jì)一種新型的細(xì)胞穿透肽1，它可以中和帶負(fù)電荷的Eylea并穿透角膜基質(zhì)（1&Eylea）。使用水凝膠可以增加1&Eylea的保留時(shí)間和攝取效率。因此開(kāi)發(fā)了一種新型的細(xì)胞穿透肽（稱為Gel 2_1）介導(dǎo)的Gel2_1&Eylea來(lái)治療角膜新生血管。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，與單獨(dú)使用Eylea相比，滴眼液Gel2_1&Eylea具有較高的相容性，對(duì)抗血管生成的治療效果更優(yōu)越（圖1）。
圖2 1&Eylea的制備和表征
摩爾比為1：1的1&Eylea配合物帶負(fù)電荷，而摩爾比為1：10的1&Eylea配合物則帶正電荷，表明10等量的帶正電荷的1可以通過(guò)靜電相互作用中和帶負(fù)電荷的Eylea。從圖2B中可以看出，1和Eylea形成聚集體，而改變1的濃度并沒(méi)有導(dǎo)致明顯的形態(tài)變化。熒光素標(biāo)記的多肽1在孵育1h后可以進(jìn)入人角膜上皮細(xì)胞-7（HCE-T）細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)（圖2C）。
圖3 滴眼液水凝膠的生物物理表征
在材料配方過(guò)程中加入Eylea，能夠精確地控制封裝藥物的濃度，藥物-肽復(fù)合物形成一個(gè)不透明的水凝膠（圖3A），表明在水凝膠基質(zhì)中存在較大的聚集體。透射電鏡圖像顯示，水凝膠基質(zhì)由納米纖維組成，也觀察到納米顆粒（圖3A），表明1&Eylea復(fù)合物的封裝并沒(méi)有顯著改變Gel2_1&Eylea的形態(tài)。所有組在216 nm處觀察到一個(gè)負(fù)峰，表明1&Eylea復(fù)合物封裝后形成穩(wěn)定的β-sheet結(jié)構(gòu)（圖3B）。為了評(píng)估1&Eylea對(duì)Gel 2_1&Eylea的流變特性影響，監(jiān)測(cè)了存儲(chǔ)模量（G'）隨時(shí)間的函數(shù)，發(fā)現(xiàn)剪切恢復(fù)性能非常接近Gel2（圖3C）。38%的Eylea在4h內(nèi)從Gel 2_1&Eylea（1：10）中釋放出來(lái)，而大約31%的水凝膠從1：1的比例釋放出來(lái)（圖3D）。如圖3E、F所示，絕大多數(shù)HCE-T細(xì)胞顯示鈣黃綠素AM（活細(xì)胞）染色陽(yáng)性，而在所有水凝膠組中只觀察到少數(shù)碘化丙啶（PI，死細(xì)胞）染色的細(xì)胞。這些結(jié)果表明，該水凝膠是無(wú)毒的，使其成為開(kāi)發(fā)生物相容性眼液基質(zhì)的一個(gè)有前途的候選藥物。
圖4 Gel2_1&Eylea的體內(nèi)療效評(píng)價(jià)
術(shù)后5天觀察到角膜間質(zhì)內(nèi)新血管明顯充血（圖4A），治療前各組間CoNV面積無(wú)差異（圖4C），證實(shí)CoNV模型的成功建立。不同配方處理后的CoNV面積占角膜總面積的百分比（圖4D）與CoNV面積呈相同的趨勢(shì)。綜上所述，用細(xì)胞穿透肽1介導(dǎo)的Eylea水凝膠滴眼液水凝膠具有良好的CoNV抑制能力。
圖5 Gel 2_1&Eylea選擇性抑制病理性新血管
治療14天后，使用前段光學(xué)相干斷層掃描血管造影（AS-OCTA）獲得血管圖像（圖5A），并使用Image J軟件生成二值化和骨骼化圖像。與Eylea組和NS組相比，Gel 2_1&Eylea組CoNV的血管面積密度（VAD）值顯著降低（圖5B），表明Gel 2_1&Eylea在降低新血管密度方面非常有效。CoNV的容器直徑指數(shù)（VDI）值在三組間沒(méi)有顯著差異（圖5C），表明Gel 2_1&Eylea對(duì)血管形態(tài)沒(méi)有顯著影響，是安全的。三組患者角膜緣的VAD和VDI值均無(wú)明顯變化（圖5D、E）。在角膜上觀察到一個(gè)較大的熒光素斑點(diǎn)，這是由CoNV模型發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)的縫合線引起的（圖5F 白色箭頭）。NS組、Eylea組和Gel 2_1&Eylea組的染色評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5G）。結(jié)合圖5D、E、G中的數(shù)據(jù)，這些結(jié)果表明，Gel 2_1&Eylea具有較高的生物相容性。
雖然抗VEGF藥物被認(rèn)為是治療眼部新生血管疾病最有效的治療方法，但由于存在多種屏障和清除機(jī)制，傳統(tǒng)的局部滴眼液的療效有限。為了解決這一挑戰(zhàn)，本研究開(kāi)發(fā)了一種含有細(xì)胞穿透肽1的新型滴眼液水凝膠。由此得到的Gel 2_1&Eylea具有剪切誘導(dǎo)的變薄特性，可以用作滴眼液。封裝的1&Eylea復(fù)合物可以迅速?gòu)乃z基質(zhì)中釋放出來(lái)，而細(xì)胞穿透肽的存在促進(jìn)Eylea的滲透。水凝膠的使用可以延長(zhǎng)藥物的停留時(shí)間，從而加強(qiáng)對(duì)病理區(qū)域的滲透。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，Gel 2_1&Eylea可以抑制新的異常血管發(fā)育，而對(duì)正常血管的影響很小?？傊?，本研究表明2_1&Eylea凝膠可以作為Eylea治療角膜新生血管的一種有效和安全的遞送系統(tǒng)。
文章來(lái)源：https://doi.org/10.1002/smll.202302765
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