引言
體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)具有通用性，與體內(nèi)試驗(yàn)方法相比具有簡便、快速、干擾少、可避免倫理問題等優(yōu)點(diǎn)，作為醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)的常規(guī)檢測項(xiàng)目，廣泛適用于各種醫(yī)療器械和材料的評(píng)價(jià)。
1、為何要進(jìn)行細(xì)胞毒測試？
（1）細(xì)胞毒性測試可以幫助評(píng)估器械材料對(duì)人體細(xì)胞的潛在毒性，從而確定其在體內(nèi)使用的安全性。
（2）材料選擇和優(yōu)化。細(xì)胞毒性測試可以幫助醫(yī)療器械制造商選擇合適的材料，并優(yōu)化其設(shè)計(jì)。通過測試不同材料的細(xì)胞毒性，可以選擇對(duì)人體細(xì)胞影響較小的材料，從而減少潛在的生物相容性問題。
（3）法規(guī)要求。醫(yī)療器械生物學(xué)安全性評(píng)價(jià)中要求對(duì)醫(yī)療器械進(jìn)行細(xì)胞毒性測試，是確保醫(yī)療器械的安全性的重要步驟之一。
2、參考標(biāo)準(zhǔn)
ISO 10993-5:2009
Biological Evaluation of Medical Devices —— Part 5: Tests for in vitro Cytotoxicity
GB/T 16886.5-2017
醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)
GB/T 14233.2-2005
醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法 第2部分：生物學(xué)試驗(yàn)方法
GB/T 16175-2008
醫(yī)用有機(jī)硅材料生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)方法
YY/T 0127.9-2009
口腔醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第2單元 試驗(yàn)方法 細(xì)胞毒性試驗(yàn)：瓊脂擴(kuò)散法及濾膜擴(kuò)散法
3、細(xì)胞毒性試驗(yàn)的方法
細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法分為三類：浸提液法、直接接觸法、間接接觸法。[1]
浸提液法：適合檢測可瀝濾物的毒性，常使用極性和非極性的含血清的培養(yǎng)基對(duì)器械進(jìn)行浸提，進(jìn)行試驗(yàn)樣品的檢驗(yàn)。
直接接觸法：該方法對(duì)材料的細(xì)胞毒性敏感性最高，可檢測出材料微弱的細(xì)胞毒性。
間接接觸法：分為瓊脂擴(kuò)散法和濾膜擴(kuò)散法，瓊脂擴(kuò)散法適用于毒性大的大批量材料篩選，濾膜擴(kuò)散法適合于小分子量毒性材料的評(píng)價(jià)。
針對(duì)某些特殊的產(chǎn)品，可能已經(jīng)具有特定的細(xì)胞毒測試方法。例如，接觸鏡類產(chǎn)品，細(xì)胞毒可采用瓊脂擴(kuò)散法（參考標(biāo)準(zhǔn)YY 0719.7-2011 眼科光學(xué)接觸鏡和接觸鏡護(hù)理產(chǎn)品 第7部分：生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)方法），某些口腔類產(chǎn)品可能采取瓊脂擴(kuò)散或?yàn)V膜擴(kuò)散法檢測細(xì)胞毒性（YY/T 0127.9-2009口腔醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第2單元 試驗(yàn)方法）。
對(duì)于選擇哪種方法去評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性，各種方法因原理不同，各有特點(diǎn)，應(yīng)具體根據(jù)產(chǎn)品、材料的用途、本身理化性質(zhì)，考慮試驗(yàn)的原理、靈敏度、可定量性等因素去選擇。
4、不同滅菌方式對(duì)細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果的影響
常用的滅菌方法有輻照滅菌、環(huán)氧乙烷滅菌、低溫等離子滅菌、高壓蒸汽滅菌和紫外等。
這些滅菌方式對(duì)細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果影響各有不同：
輻照滅菌可能對(duì)樣品中生物材料或高分子材料產(chǎn)生影響，從而影響細(xì)胞毒結(jié)果；
EO滅菌中EO的殘留，對(duì)細(xì)胞可能產(chǎn)生毒性作用，對(duì)細(xì)胞生長會(huì)有一定的影響，需確保EO殘留充分去除；
低溫等離子滅菌殘留的氣體和化學(xué)物質(zhì)，一定程度上會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的損傷和死亡；
使用高壓蒸汽滅菌需考慮高溫是否會(huì)影響產(chǎn)品本身的性質(zhì)，存在一定的局限性；
紫外照射屬于一種物理方式的滅菌，操作簡單，使用方便，但其主要針對(duì)表面和空氣中的微生物，不適用于深層或隱藏的細(xì)菌、病毒和真菌，從而造成假陽性的試驗(yàn)結(jié)果。
5、非無菌產(chǎn)品測試細(xì)胞毒時(shí)，需要進(jìn)行滅菌處理嗎？
非無菌產(chǎn)品中可能存在生長因子、細(xì)菌、真菌，它們的存在可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長、代謝等產(chǎn)生影響，從而使研究得到假陽性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
如果樣品高溫滅菌后或者紫外照射后，對(duì)產(chǎn)品本身不會(huì)有任何影響，建議采取滅菌措施，排除其中可能存在的微生物和其他影響因素對(duì)細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果的影響。
6、試驗(yàn)樣品的浸提
浸提介質(zhì)：優(yōu)先選用含血清的培養(yǎng)基，是由于該浸提介質(zhì)具有支持細(xì)胞生長以及浸提極性和非極性兩種物質(zhì)的能力。
也可以選擇其他適宜的浸提介質(zhì)，包括純水、生理鹽水溶液等，使用該類浸提介質(zhì)，只能提供極性或者非極性的浸提環(huán)境，不能同時(shí)包含極性和非極性浸提兩種情況、且不能提供支持細(xì)胞生長的營養(yǎng)物質(zhì)，100%樣品浸提細(xì)胞存活會(huì)受到影響。可考慮使用培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行稀釋，但應(yīng)進(jìn)行論證并形成文件。
浸提條件：常見組合有——
(37±1)℃， (24±2)h
(50±2)℃， (72±2)h
(70±2)℃， (24±2)h
(121±2)℃，(1±0.2)h
上述浸提條件是基于歷史資料，已用于提供器械或材料風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中潛在危害的測定?？刹捎闷渌麠l件（例如在37℃時(shí)延長或縮短浸提時(shí)間），根據(jù)產(chǎn)品接觸信息進(jìn)行選擇。
如選擇的浸提介質(zhì)是含血清培養(yǎng)基，溫度只能選擇37℃，溫度超過37℃會(huì)對(duì)血清化學(xué)或穩(wěn)定性以及培養(yǎng)基中其他成分產(chǎn)生不良影響。
7、細(xì)胞毒的結(jié)果評(píng)價(jià)和分析
可采用定性和定量的方法測定細(xì)胞毒性反應(yīng)。細(xì)胞毒性的定量評(píng)價(jià)更好一些，可以客觀地對(duì)細(xì)胞數(shù)量、蛋白總量、酶的釋放、活體染料的釋放、活體染料的還原或其他可測定的參數(shù)進(jìn)行定量測定，不易受到試驗(yàn)者主觀因素的影響，具有相對(duì)高的靈敏性且有明確判定限，MTT定量法是國內(nèi)普遍應(yīng)用的方法。相對(duì)而言，細(xì)胞毒性的定性評(píng)價(jià)具有更多的評(píng)價(jià)者主觀性，更適合篩選用途。
定性評(píng)價(jià)：顯微鏡檢查細(xì)胞的形態(tài)、空泡形成、脫落、細(xì)胞溶解和胞膜完整性等方面的改變。
定量評(píng)價(jià)：測定細(xì)胞死亡、細(xì)胞生長抑制、細(xì)胞增殖或集落形成。
如出現(xiàn)細(xì)胞毒性反應(yīng)，需從以下幾點(diǎn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)，例：
附加試驗(yàn)（培養(yǎng)基含血清或不含血清，改變培養(yǎng)基中血清的水平）；
浸提液分析（如滅菌或其他生產(chǎn)過程殘留物）；
稀釋液的濃度反應(yīng)分析；
可瀝濾物成分的化學(xué)表征。
結(jié)語
隨著醫(yī)療器械注冊相關(guān)法規(guī)的更新，醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)工作要求愈發(fā)細(xì)致，作為靈敏的生物相容性試驗(yàn)項(xiàng)目，體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)不同的方法、不同的滅菌方式，對(duì)測試結(jié)果有著不同的影響，需要根據(jù)不同條件制訂不同方案以保障評(píng)價(jià)結(jié)果的準(zhǔn)確性和適用性。
【參考文獻(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)】
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[4] ISO 10993-5:2009 Biological Evaluation of Medical Devices -- Part 5: Tests for in vitro Cytotoxicity
[5] GB/T 16886.5-2007醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)
[6] GB/T 14233.2-2005醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法 第2部分：生物試驗(yàn)方法
[7] GB/T 16175-2008 醫(yī)用有機(jī)硅材料生物學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)方法
[8] YY/T 0127.9-2009口腔醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第2單元 試驗(yàn)方法 細(xì)胞毒性試驗(yàn)：瓊脂擴(kuò)散法及濾膜擴(kuò)散法
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