所有 1 型糖尿病（T1D）和晚期 2 型糖尿病患者都需要胰島素治療來(lái)控制血糖水平（BGL）。目前，血糖控制的改善依賴于混合閉環(huán)胰島素輸送系統(tǒng)，該系統(tǒng)將連續(xù)血糖監(jiān)測(cè)設(shè)備與胰島素泵連接起來(lái)，在高血糖水平（高血糖）時(shí)輸送胰島素。然而，患者需要每天 24 小時(shí)佩戴此類設(shè)備，并使用系留泵和管道，這就帶來(lái)了風(fēng)險(xiǎn)，如插管引起的皮膚感染、設(shè)備故障和胰島素不穩(wěn)定問(wèn)題。此外，設(shè)備和配件的高昂成本也讓許多患者難以承受，而患者需要進(jìn)行干預(yù)和繁瑣的維護(hù)工作，這通常會(huì)因不可預(yù)測(cè)的飲食和運(yùn)動(dòng)模式而變得復(fù)雜，并伴有低血糖風(fēng)險(xiǎn)。在各種系統(tǒng)中，葡萄糖反應(yīng)型聚合物微針（MN）貼片因其使用方便、易于去除以及在高血糖時(shí)可釋放足量胰島素而受到特別關(guān)注。理想的胰島素給藥聚合物 MN 貼片需要保留較高的胰島素有效載荷，保持原生胰島素的結(jié)構(gòu)/生物活性，并能按需在較長(zhǎng)的周期內(nèi)快速釋放胰島素，水凝膠基 MN 貼片在這方面顯示出巨大的潛力。除了可定制的聚合物成分外，水凝膠基 MN 貼片在干燥狀態(tài)下還能物理穿透角質(zhì)層，進(jìn)入表皮間質(zhì)，實(shí)現(xiàn)大分子的透皮給藥。然而，大多數(shù)已報(bào)道的水凝膠基 MN 貼片都需要熱、光或化學(xué)交聯(lián)，這可能會(huì)導(dǎo)致胰島素變性。一種能在高血糖濃度下輸送胰島素的透皮貼片具有極大的優(yōu)勢(shì)，可以減輕糖尿病患者對(duì)安全性的擔(dān)憂，提高他們的生活質(zhì)量。
來(lái)自加拿大多倫多大學(xué)的Xiao Yu Wu團(tuán)隊(duì)：
①設(shè)計(jì)了一種新型自交聯(lián)葡萄糖響應(yīng)聚合物微針貼片（MN），用于在高血糖狀態(tài)下輸送胰島素。
②微針貼片由多巴胺和 4-氨基-3-氟苯硼酸（AFBA）官能化的透明質(zhì)酸聚合物制成，在沒(méi)有任何化學(xué)交聯(lián)劑或有機(jī)溶劑的情況下，聚合物溶液混合后即可快速交聯(lián)。多巴胺（DA）單元中的兒茶酚基團(tuán)之間通過(guò)自動(dòng)氧化形成共價(jià)交聯(lián)，并通過(guò)絡(luò)合作用與苯硼酸（PBA）形成動(dòng)態(tài)交聯(lián)。兒茶酚和硼酸之間的可逆交聯(lián)會(huì)隨著葡萄糖濃度的增加而減少，從而導(dǎo)致高血糖時(shí)的膨脹率比優(yōu)血糖時(shí)更高，胰島素釋放更快。
③體外分析和體內(nèi)療效研究都證明了這種卓越的葡萄糖響應(yīng)特性。實(shí)驗(yàn)和分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示，水凝膠聚合物還能保持胰島素的原生結(jié)構(gòu)和生物活性，這歸功于透明質(zhì)酸（HA）與胰島素分子的相互作用。
基質(zhì)微針（mMN）貼片的設(shè)計(jì)和制造過(guò)程簡(jiǎn)單，而且在輸送胰島素時(shí)具有葡萄糖反應(yīng)性，因此具有很大的臨床應(yīng)用潛力。相關(guān)工作以題為“‘Smart’ Matrix Microneedle Patch Made of Self-Crosslinkable and Multifunctional Polymers for Delivering Insulin On-Demand”的文章發(fā)表在2023年9月18日的國(guó)際頂級(jí)期刊《Advanced Science》。
1. 創(chuàng)新型研究?jī)?nèi)容
本研究利用受貽貝啟發(fā)化學(xué)的優(yōu)勢(shì)，設(shè)計(jì)了一種新型自交聯(lián)聚合物基質(zhì) MN（mMN）貼片，該貼片能夠封裝高濃度胰島素，具有超強(qiáng)溶脹能力，并能在高血糖時(shí)快速輸送胰島素。mMN 陣列由透明質(zhì)酸（HA）聚合物骨架與含兒茶酚的多巴胺（DA）和 4-氨基-3-氟苯硼酸（AFBA）功能化而成，聚合物水溶液在微堿性 pH 值下混合后可快速交聯(lián)。mMN 的交聯(lián)是通過(guò) i）兒茶酚-兒茶酚（DA-DA）共價(jià)連接和 ii）兒茶酚與 AFBA 之間的動(dòng)態(tài)/可逆絡(luò)合形成的，無(wú)需額外的交聯(lián)劑和/或加熱或紫外線照射（圖 1A）。在生理和高血糖條件下，AFBA 通過(guò)與兒茶酚基團(tuán)解離而優(yōu)先與葡萄糖結(jié)合，導(dǎo)致二次交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)斷裂，增強(qiáng)水凝膠的膨脹并促進(jìn)胰島素釋放（圖 1B）。相反，在低血糖/無(wú)血糖條件下，AFBA 可逆地與鄰苯二酚形成復(fù)合物，重新形成二次交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)水凝膠致密化，從而延緩胰島素釋放，降低低血糖風(fēng)險(xiǎn)。這種新型 mMN 貼片具有充分的皮膚滲透性、快速和超高膨脹能力、高胰島素負(fù)荷能力以及有效的低血糖/高血糖預(yù)防功能。由于其在高血糖狀態(tài)下的出色胰島素輸送特性以及保留胰島素生物活性的能力，經(jīng)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這種新型 MN 貼片在微創(chuàng)胰島素給藥方面具有巨大潛力。
圖1 mMN 的制造及其葡萄糖反應(yīng)性胰島素輸送
傅立葉變換紅外光譜（FTIR）用于確認(rèn) mMN 貼片交聯(lián)成功（圖 2A）。與 HA 相比，HA-DA 和 HA-AFBA 在 1591 和 1285 cm-1 處出現(xiàn)兩個(gè)峰值，分別歸因于 C═N 伸展振動(dòng)和芳香族 C─C 伸展振動(dòng)，表明 DA 和 AFBA 功能基團(tuán)已成功共軛到 HA 主干上。交聯(lián)后聚合物的紅外光譜在 1480cm-1 處出現(xiàn)了一個(gè)新的峰值，這是由于形成了鄰苯二酚-硼酸酯復(fù)合物。此外，在 ≈3300-3400 cm-1 處鄰苯二酚羥基的寬帶顯著降低，表明形成了 DA-DA 共價(jià)連接。本研究還關(guān)注了不同重量比的 HA-DA 和 HA-AFBA 混合物的流變學(xué)，以確定適合貼片制造的理想凝膠化動(dòng)力學(xué)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)葡萄糖反應(yīng)性。在測(cè)試的比例中，HA-DA 和 HA-AFBA 的比例為 2:1，由于凝膠化階段相對(duì)較慢，水凝膠更容易轉(zhuǎn)移到模具中，而且形成的 MN 具有更鋒利的尖端，完整性更好，因此被選中用于制造 mMN 補(bǔ)丁。如圖 2B、C 所示，mMN 補(bǔ)丁由 10×10 的微針陣列組成，長(zhǎng)度為 800 微米，呈金字塔形。補(bǔ)片呈現(xiàn)獨(dú)特的棕色是由于 DA-DA 共價(jià)交聯(lián)過(guò)程中兒茶酚基團(tuán)發(fā)生氧化所致。交聯(lián)的 mMN 貼片每針的斷裂力超過(guò) 0.45 牛頓，而未交聯(lián)的 MN 貼片每針的斷裂力為 0.27 牛頓（圖 2D），這表明在接下來(lái)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，交聯(lián)為皮膚穿透提供了足夠的機(jī)械強(qiáng)度。本研究將 mMN 貼片浸入不同葡萄糖濃度（50、100、200 或 400 毫克 dL-1）的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，pH 7.4）中，代表低血糖、優(yōu)血糖和高血糖條件，從而檢測(cè) mMN 陣列的溶脹能力。200 mg dL-1 的葡萄糖濃度是與糖尿病患者臨床相關(guān)的高血糖水平，而 400 mg dL-1 通常在 T1D 大鼠模型中觀察到。如圖 2E 所示，mMN 在高血糖時(shí)變得極度腫脹，在 400 mg dL-1 葡萄糖介質(zhì)中浸泡 3 小時(shí)后，腫脹程度達(dá)到其干重的 45 倍以上。值得注意的是，在最大膨脹狀態(tài)下，可膨脹 mMN 的針頭仍保持完整（圖 2G）。
圖2 體外表征和葡萄糖依賴性腫脹研究
由于在 mMN 形成過(guò)程中直接添加了胰島素，mMN 系統(tǒng)顯示出 100% 的胰島素負(fù)載效率和高負(fù)載能力（18.2 wt.%），這為多周期胰島素遞送提供了優(yōu)勢(shì)。將 mMN 貼片浸入含有不同葡萄糖濃度（50、100、200 和 400 mg dL-1）的 PBS 中，對(duì) mMN 貼片的體外胰島素釋放進(jìn)行了檢測(cè)。如圖 3B 所示，高血糖狀態(tài)（200 和 400 mg dL-1）下 mMN 貼片釋放胰島素的速率和程度大于優(yōu)血糖（100 mg dL-1）和低血糖（50 mg dL-1）水平下的速率和程度，這表明 mMN 貼片以與葡萄糖反應(yīng)的方式釋放胰島素。隨著葡萄糖濃度的增加，更多的葡萄糖分子取代兒茶酚-AFBA 復(fù)合物中的兒茶酚基團(tuán)，形成更多的葡萄糖-AFBA 復(fù)合物，導(dǎo)致更多的 mMN 腫脹和胰島素釋放。相反，當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度降低時(shí)，兒茶酚-AFBA 復(fù)合物的驅(qū)動(dòng)力增加，從而再生二級(jí)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)在反饋控制回路中降低胰島素釋放速度。因此，每隔 30 分鐘將貼片交替浸入優(yōu)糖溶液和高糖溶液中幾個(gè)周期后，就能觀察到胰島素的脈沖式釋放曲線（圖 3C）。這種響應(yīng)葡萄糖濃度的周期性高低胰島素釋放率有助于應(yīng)用 mMN 進(jìn)行日常血糖管理。相比之下，無(wú)葡萄糖反應(yīng)的 MN 貼片（由 HA-DA 制成，不含葡萄糖反應(yīng)單元 AFBA）能快速釋放胰島素，不受葡萄糖濃度的影響。雖然觀察到了胰島素的初始爆發(fā)釋放，但這種效應(yīng)在體內(nèi)并不顯著，因?yàn)橹挥形⑨樀募舛瞬迦肫つw，其膨脹會(huì)受到限制。
圖3 體外葡萄糖反應(yīng)性胰島素釋放
除實(shí)驗(yàn)研究外，本研究還利用分子建模和計(jì)算生物學(xué)方法研究了水凝膠聚合物對(duì)胰島素分子的穩(wěn)定作用的分子機(jī)制。利用全原子分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬研究了胰島素與功能化聚合物之間的相互作用模式，其中聚合物鏈與胰島素的摩爾比是根據(jù)實(shí)驗(yàn)中使用的比例確定的。圖 4A 顯示了在 HA-DA 和 HA-AFBA 聚合物存在時(shí)，胰島素在 t = 0（起點(diǎn)）、100、200、300、400 和 500 ns 的快照。如圖 4A 所示，聚合物鏈包圍了胰島素分子，隨著時(shí)間的推移，它們完全包裹了胰島素分子。為了解聚合物對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的影響，本研究分析了胰島素在沒(méi)有聚合物或有聚合物的情況下的均方根偏差（RMSD）值（圖 4B）。在這項(xiàng)研究中，多肽α碳原子（Cα）的 RMSD 值是在模擬過(guò)程中參照其初始結(jié)構(gòu)計(jì)算得出的。在模擬開(kāi)始時(shí)（t = 0 到 t < 150 ns），存在聚合物的胰島素的 RMSD 值高于其自由狀態(tài)。肽的較高流動(dòng)性可歸因于分子與聚合物殘基相互作用的初始運(yùn)動(dòng)。然而，在 150 ns 時(shí)，RMSD 值下降，這是因?yàn)橐葝u素與聚合物的相互作用趨于穩(wěn)定（圖 4B）。本研究還監(jiān)測(cè)了胰島素分子中每個(gè)殘基的均方根波動(dòng)（RMSF），以確定聚合物對(duì)多肽殘基動(dòng)態(tài)行為的影響（圖 4C）。胰島素中 Cα 原子的計(jì)算 RMSF 值與從 X 射線晶體學(xué)實(shí)驗(yàn)中提取的多肽原子的 B 因子（熱因子）進(jìn)行了比較。如圖4C所示，所有胰島素殘基對(duì)聚合物的存在都很敏感，這表現(xiàn)在它們?cè)趶?fù)合狀態(tài)下的 RMSF 值較低。這一特征可歸因于胰島素與功能化-HA 聚合物之間的有利相互作用。圖 4D 展示了胰島素在聚合物不存在和存在的情況下回轉(zhuǎn)半徑（Rg）的典型結(jié)果?？梢钥闯觯c游離胰島素相比，存在聚合物的胰島素在 300 ns 及以后幾乎沒(méi)有變化，這表明聚合物對(duì)胰島素的 Rg沒(méi)有顯著影響。
圖4 不同時(shí)間胰島素/聚合物系統(tǒng)的示意圖
在體內(nèi)研究中，首先通過(guò)向大鼠皮膚輸送胰藍(lán)染料，然后進(jìn)行蘇木精和伊紅（H&E）染色組織學(xué)研究（圖 5A、B），證實(shí)了 mMN 貼片具有出色的皮膚滲透能力。由于其微創(chuàng)性和高生物相容性，mMN 的痕跡在貼敷后逐漸消失。為了研究 mMN 貼片對(duì)高血糖的體內(nèi)療效，本研究將鏈佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的 T1D 雄性 Sprague-Dawley 大鼠隨機(jī)分組，分別使用胰島素負(fù)載 mMN 貼片（58 U）、假貼片（作為對(duì)照）或皮下注射胰島素（0.5 U kg-1）進(jìn)行治療。研究開(kāi)始前，所有 T1D 糖尿病大鼠均禁食 5 小時(shí)。如圖 5C 所示，在整個(gè)研究過(guò)程中，使用假貼片的對(duì)照組大鼠的血糖值一直處于高血糖狀態(tài)。然而，接受 mMN 貼片和胰島素注射治療的大鼠的血糖濃度迅速下降，并在 1 小時(shí)內(nèi)降至 165 mg dL-1 以下。相反，mMN 貼片成功地將大鼠的 BGL 調(diào)節(jié)在嚴(yán)格的血糖目標(biāo)范圍內(nèi)（<190 mg dL-1 和 >70 mg dL-1）達(dá) 7 小時(shí)以上，這比其他研究小組報(bào)告的基質(zhì) MN 貼片的時(shí)間更長(zhǎng)。與葡萄糖反應(yīng)型 mMN 貼片不同，非葡萄糖反應(yīng)型 MN 貼片裝載了相同量的胰島素（58 U），但沒(méi)有 AFBA 單位，可快速釋放胰島素且不受葡萄糖濃度的影響。因此，它們不能長(zhǎng)時(shí)間維持正常血糖，處理后的大鼠血糖在 3 小時(shí)后迅速升高。
為了研究 mMN 貼片的血糖調(diào)節(jié)能力，在應(yīng)用 mMN 或注射胰島素 2 小時(shí)后，通過(guò)注射 2 g kg-1 葡萄糖進(jìn)行腹腔內(nèi)葡萄糖耐量試驗(yàn)（IPGTT），以將初始血漿葡萄糖水平降至類似正常血糖水平。如圖 5D 所示，經(jīng) mMN 治療的 T1D 大鼠在血糖水平達(dá)到峰值后，其血糖濃度恢復(fù)到與健康大鼠相似的正常血糖水平。相反，皮下注射（s.c.）胰島素 2 小時(shí)后的 T1D 大鼠在葡萄糖挑戰(zhàn)后出現(xiàn)了持續(xù)的高血糖。經(jīng) s.c. 胰島素處理的大鼠的葡萄糖曲線下面積（AUC）是經(jīng) mMN 貼片處理的大鼠 120 分鐘持續(xù)葡萄糖暴露量的五倍（圖 5E）。mMN 貼片的葡萄糖調(diào)節(jié)作用可歸因于其葡萄糖依賴性胰島素釋放。如圖 5F 所示，在 t = 0 時(shí)（即 mMN 貼敷 2 小時(shí)后），當(dāng)血糖水平恢復(fù)到優(yōu)格血癥時(shí)，mMN 貼片處理大鼠的血漿胰島素與假貼片處理組一樣處于低水平，表明此時(shí)胰島素 mMN 貼片釋放的胰島素檢測(cè)不到。在 t = 0 時(shí)進(jìn)行葡萄糖挑戰(zhàn)后，血漿胰島素水平在 30 分鐘和 60 分鐘時(shí)急劇升高達(dá) 9.8 倍，然后在 120 分鐘時(shí)再次降至基礎(chǔ)水平，而假貼片處理大鼠的血漿胰島素水平?jīng)]有變化（圖 5F）。這些結(jié)果表明，mMN貼片能夠根據(jù)血糖水平調(diào)節(jié)胰島素釋放速率，從而長(zhǎng)時(shí)間維持正常血糖，而不引起低血糖，并迅速抑制高血糖。由于 T1D 大鼠的禁食時(shí)間和持續(xù)研究中每只大鼠的血樣數(shù)量有限，胰島素 mMN 貼片的長(zhǎng)期療效將通過(guò)大型動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)估，本研究小組正在進(jìn)行后續(xù)的研究。
圖5 STZ 誘導(dǎo)的 1 型糖尿病大鼠模型中 mMN 貼片的體內(nèi)評(píng)估
2. 總結(jié)與展望
總之，本研究開(kāi)發(fā)了一種可自交聯(lián)的聚合物 mMN 貼片，它能夠在高血糖狀態(tài)下封裝和輸送胰島素，并通過(guò)使用生物兼容的 HA 和蛋白質(zhì)友好型交聯(lián)條件保留了多肽的原生結(jié)構(gòu)/生物活性。用于制造 MN 的交聯(lián)機(jī)制無(wú)需使用加熱或輻照等傳統(tǒng)的苛刻交聯(lián)方法。在制造交聯(lián) mMN 時(shí)，只需簡(jiǎn)單調(diào)節(jié)聚合物溶液的 pH 值，就能省去多步制造過(guò)程，為擴(kuò)大 MN 貼片的制造規(guī)模帶來(lái)了機(jī)遇。MD 模擬結(jié)果表明，通過(guò)胰島素、功能化-HA 聚合物和水分子之間的相互作用，可以保留原生胰島素結(jié)構(gòu)。mMN 的血糖響應(yīng)特性在體外得到了證實(shí)，并在 T1D 大鼠模型上得到了進(jìn)一步驗(yàn)證，血糖目標(biāo)至少維持了 8 小時(shí)。雖然持續(xù)皮下注射胰島素比注射胰島素能更好地控制血糖，但該系統(tǒng)的成本和不便妨礙了它的廣泛應(yīng)用。相比之下，使用 “智能”mMN 貼片的給藥策略可以為糖尿病患者提供方便、無(wú)痛、經(jīng)濟(jì)的血糖控制，從而改善他們的生活質(zhì)量。mMN 系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和制造過(guò)程非常簡(jiǎn)單，因此具有推廣和臨床應(yīng)用的巨大潛力。本研究中開(kāi)發(fā)的 mMN 貼片已成功證明了其作為葡萄糖響應(yīng)型一次性透皮給藥平臺(tái)的應(yīng)用，該平臺(tái)可優(yōu)化后供日常使用。所述系統(tǒng)還可用于輸送其他治療激素，如胰島素類似物和胰高血糖素，以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期血糖管理。要充分發(fā)揮 mMN 貼片的轉(zhuǎn)化潛力，還需要優(yōu)化貼片的設(shè)計(jì)和制造工藝。最后，胰島素與聚合物結(jié)合的計(jì)算建模結(jié)果表明，MD 模擬有助于闡明選定聚合物材料穩(wěn)定蛋白質(zhì)的內(nèi)在機(jī)制。
文章來(lái)源：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202303665
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