藥品標(biāo)準(zhǔn)是把握藥品質(zhì)量的標(biāo)尺，藥品標(biāo)準(zhǔn)中的檢驗(yàn)項(xiàng)目需圍繞藥品的設(shè)計(jì)制定，檢驗(yàn)項(xiàng)目中采用的方法為藥典通用方法如干燥失重，重金屬檢查等無(wú)需對(duì)方法驗(yàn)證，但是特異性的檢驗(yàn)項(xiàng)目的方法需有方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容以支持方法的可行性，如有關(guān)物質(zhì)檢查的HPLC方法，含量測(cè)定的HPLC方法等。方法學(xué)驗(yàn)證中容易出現(xiàn)的偏差，如驗(yàn)證結(jié)果未在Chp2020版四部通則的9101規(guī)定范圍內(nèi)，需要找尋閉環(huán)方法，使分析方法和操作方法更完善，順利通過(guò)驗(yàn)證。本文結(jié)合驗(yàn)證實(shí)例對(duì)方法學(xué)驗(yàn)證中的偏差閉環(huán)給出一些方法，供同行參考。
首先，偏差大咖是回收率未在要求范圍內(nèi)，舉例：特定雜質(zhì)A的限度要求為不得過(guò)3%，參考待測(cè)成分含量和回收率限度的規(guī)定，雜質(zhì)A的回收率限度為92-105%，但是測(cè)定結(jié)果中80%水平的回收率結(jié)果分別為108%、90%、107%，未在限度要求的范圍內(nèi)；發(fā)生偏差后調(diào)查使用玻璃儀器等在校驗(yàn)范圍內(nèi)，操作無(wú)偏差，對(duì)照品使用得當(dāng)，最后發(fā)現(xiàn)是供試品中的基質(zhì)造成的回收率測(cè)定結(jié)果偏離限度要求。如果供試品本底響應(yīng)值遠(yuǎn)大于對(duì)照品的響應(yīng)值，在加標(biāo)供試品溶液中僅僅是供試品本底響應(yīng)值的偏差就會(huì)對(duì)回收率的結(jié)果造成較大影響，導(dǎo)致回收率結(jié)果偏離限度的范圍，如下圖所模擬的影響過(guò)程。倘若本底值和對(duì)照品值發(fā)生相同方向的偏差，測(cè)得的回收率結(jié)果將會(huì)出現(xiàn)更大程度的偏離。
本例中的回收率偏高的原因是基質(zhì)的影響，那么如果供試品的本底在定量限水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)不會(huì)影響到回收率的結(jié)果，那么還有哪些原因會(huì)導(dǎo)致回收率偏高呢，排查儀器設(shè)備，玻璃器具，操作不當(dāng)?shù)仍谕猓虬?，①?duì)照品影響，對(duì)照品開(kāi)啟時(shí)間較長(zhǎng)吸潮，或者對(duì)照品的使用不當(dāng)（部分對(duì)照品會(huì)標(biāo)注干燥后使用），這樣造成測(cè)得值的結(jié)果偏高，回收率偏高。②雜質(zhì)B與主峰的分離度基線分離（分離度1.9），雜質(zhì)B的限度為0.5%，回收率的限度要求為90-108%，如下圖所示（雜質(zhì)B的保留時(shí)間為33.6min），那么，積分方式的選擇就對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響較大，本例中以外標(biāo)法定量，對(duì)照品溶液與供試品加標(biāo)溶液的積分方式完全一致，模擬一下積分方式變化對(duì)結(jié)果的影響過(guò)程：雜質(zhì)B的加入濃度為1，對(duì)照品溶液中雜質(zhì)B的峰面積為5000，那么A/C為5000，供試品加標(biāo)溶液中雜質(zhì)B為6000，測(cè)得100%水平回收率為120%。當(dāng)調(diào)整積分方式為峰谷到峰谷之后，對(duì)照品溶液中雜質(zhì)B的峰面積為4800，那么A/C為4800，供試品加標(biāo)溶液中雜質(zhì)B為5000，測(cè)得100%水平回收率為104%。
③供試品溶液不穩(wěn)定，供試品分析時(shí)長(zhǎng)90min，在進(jìn)樣室中供試品不斷降解成特定雜質(zhì)C，導(dǎo)致雜質(zhì)C的回收率異常高，可達(dá)200%左右。
由以上幾個(gè)回收率偏差的例子得出閉環(huán)策略：a雜質(zhì)的定量方法中，供試品本底值的響應(yīng)水平需要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)照品的響應(yīng)值，可以通過(guò)供試品精制獲得較小本底值的樣品，通過(guò)供試品稀釋減小本底值對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，或者改變定量方法為標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定；b對(duì)照品的使用中，需要提前了解對(duì)照品的理化性質(zhì)，如引濕性等，避免因?yàn)閷?duì)照品賦值不準(zhǔn)造成的回收率結(jié)果偏差；c積分方法的選擇，對(duì)照品和供試品溶液的積分參數(shù)如峰寬，斜率等直接影響峰面積的參數(shù)需要一致，在調(diào)整積分參數(shù)的時(shí)候優(yōu)先以供試品為參考，同時(shí)兼顧主成分與雜質(zhì)的積分合理性，避免導(dǎo)致雜質(zhì)的積分過(guò)大，當(dāng)然在積分方式影響較大的方法中，通過(guò)改變色譜柱。柱溫或流速等方式優(yōu)化方法更為重要；d供試品溶液穩(wěn)定性的提前考察，必要時(shí)選擇進(jìn)樣室控溫的方式或者臨用現(xiàn)制的方式進(jìn)行方法驗(yàn)證；
其次：偏差大咖是含量測(cè)定結(jié)果偏高或偏低。舉例：API的HPLC方法測(cè)定其含量，方法的專屬性良好，含量結(jié)果的限度要求為98.0%-101.0%，但是測(cè)定的結(jié)果卻總是偏低，測(cè)得值在96.0%。在偏差調(diào)查中發(fā)現(xiàn)儀器器具、試驗(yàn)操作等均正常，對(duì)照品的F值也在99.0-101.0范圍內(nèi)，儀器精密度良好，重復(fù)試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果還是96.0%，對(duì)照品為剛開(kāi)瓶，操作正確。后來(lái)考慮對(duì)照品的賦值存在問(wèn)題，買到的API對(duì)照品為非法定對(duì)照品，在COA報(bào)告中賦值方式采取的是定量核磁的結(jié)果，經(jīng)過(guò)其他品牌的對(duì)照品重新對(duì)供試品測(cè)定，發(fā)現(xiàn)含量的結(jié)果為99.0%，本次偏差是第一次采用的對(duì)照品的賦值偏低造成的測(cè)定結(jié)果偏低，可見(jiàn)非法定對(duì)照品作為含量測(cè)定的對(duì)照品風(fēng)險(xiǎn)是很高的，需要評(píng)估其賦值方式是否合理。舉例：口服片劑的HPLC方法測(cè)定其含量，方法的專屬性良好，含量結(jié)果的限度要求為95.0%-105.0%，但是測(cè)定的結(jié)果偏高，測(cè)得值在106.0%。本例調(diào)查結(jié)果是試生產(chǎn)時(shí)部分壓片不準(zhǔn)，造成平均偏重偏大。因?yàn)槠瑒┑暮坑?jì)算方式為含量（%）=（（m測(cè)得值/m取樣量）*平均片重）/標(biāo)示量*100%，造成含量偏高的原因還可能是包衣在研磨過(guò)程中不易粉碎，出現(xiàn)取樣不均勻，造成測(cè)得值偏高，進(jìn)而含量偏高。
由以上的含量偏高的偏差得出閉環(huán)策略：a在原料的含量測(cè)定中，對(duì)照品的選擇要慎重，對(duì)其對(duì)照品的賦值準(zhǔn)確性需要進(jìn)行評(píng)估后使用，必要時(shí)可通過(guò)精制原料自制工作對(duì)照品進(jìn)行標(biāo)定；b在制劑含量測(cè)定中出現(xiàn)異常偏高，需要考察工藝中的原因，還有含量用供試品的制備過(guò)程的優(yōu)化，比如是否需要去除包衣等。
最后，偏差大咖是RSD不在限度要求的范圍內(nèi)，RSD是評(píng)價(jià)一組測(cè)定結(jié)果的精密度指標(biāo)，之所以需要制定RSD的限度，是為了避免測(cè)定結(jié)果離散之后超出雜質(zhì)的限度要求，影響測(cè)定結(jié)果的真實(shí)性，比如，限度為0.1%的雜質(zhì)，在0時(shí)測(cè)定值為0.03%，平行6次，僅一次0.05%時(shí)，RSD為24.5%，在0時(shí)測(cè)定值為0.08%，平行6次，僅一次0.1%時(shí)，RSD為9.8%，雖然第二次的RSD更小，但是卻有雜質(zhì)超限的風(fēng)險(xiǎn)，因此在制定RSD可接受標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，需要結(jié)合待測(cè)雜質(zhì)水平，這也就是LOQ的RSD一般可以接受10%甚至15%的原因，那么LOQ的RSD依然超過(guò)限度造成偏差時(shí)，排查原因，操作正常，儀器器具正常使用，原因?yàn)殡s質(zhì)的靈敏度極高，S/N約為10時(shí)，峰面積僅900左右，并且相當(dāng)于供試品的0.001%，因此較小峰面積很容易產(chǎn)生較大的RSD。另外一種容易出現(xiàn)RSD偏差的情況是重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，一般與RSD的可接受限度的制定相關(guān)。
由以上的RSD偏差得出閉環(huán)策略：a根據(jù)實(shí)測(cè)雜質(zhì)水平，特別是一些單雜測(cè)定值很低，在評(píng)價(jià)重復(fù)性等RSD指標(biāo)制定中可適當(dāng)放寬，或者換絕對(duì)偏差，極差等方式評(píng)價(jià);b定量限水平需要根據(jù)實(shí)際待測(cè)物質(zhì)的靈敏度制定，不必固定于S/N在10附近。
綜上列舉了幾種方法學(xué)驗(yàn)證中出現(xiàn)頻率較高的偏差類型，并結(jié)合實(shí)例給出了閉環(huán)策略，希望可以給到同行工作中一些參考，同時(shí)也歡迎大家一起探討。
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